洗涤剂辅助重组重组果蝇阿拉他素到脂质混合测定脂质体

摘要

生物膜融合由专用融合蛋白催化。通过脂质混合测定,可以测量蛋白质的富源性。我们提出了一种纯化重组果蝇蛋白的方法,这是一种蛋白质,可以调节ER的同质融合,将其重组为预制脂质体,并测试融合能力。

摘要

膜融合是真核细胞的关键过程。特殊蛋白质是催化融合所必需的。阿普拉斯是内质视网膜 (ER) 居民蛋白,与 ER 的同质融合有关。在这里,我们详细介绍了通过两轮亲和色谱法来纯化谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 和多组氨酸标记果蝇蛋白的方法。研究体外融合反应需要将纯化融合蛋白插入脂质双层。脂质体是理想的模型膜,因为脂质成分和大小可以调整。为此,我们描述了一种重组方法,通过去除果蝇在骨细胞素到预先成型的脂体。虽然有几种重组方法可用,但通过洗涤剂去除进行重组有几个优点,使其适用于蛋白条和其他类似蛋白质。该方法的优点包括高重组产量和重组蛋白的正确方向。该方法可扩展到其他膜蛋白和其他需要蛋白体的其他应用。此外,我们描述了用于测量膜融合的蛋白石体体基于FRET的脂质混合测定。

引言

膜融合是许多生物反应的关键过程。在生物条件下,膜融合不是自发的,需要专门的融合蛋白来催化这种反应1。ER同质膜融合在动物中由与发电机相关GTPase在lastin2中介导。阿克拉斯丁在同质融合中的作用对于外围ER中的三向结至关重要,它构成了一个贯穿整个细胞的大型互联小管网络。阿克拉斯林有一个保守的域形态,包括一个大的GTPase,一个三螺旋束中间域,一个疏水膜锚,和一个短的细胞质C端尾部3。体外研究用重组果蝇对骨素表明,当重组为脂质体时,它保持其富源性。其他的lastin,包括人类同源物,未能在体外重述融合。我们在这里描述一种方法,用于纯化GST和多肽标记重组果蝇对lastin,将其重组为脂体,并分析融合。

研究体外膜融合是一个挑战,因为富源蛋白通常具有膜锚。为了研究它们,有必要将它们重新组成模型脂质双层。大型单片囊泡(LUV)是研究脂质蛋白相互作用的有用工具。我们在这里提出了一个系统,使不同脂质成分的LUV蛋白质重组和融合测定。通过多种方法将整体蛋白质重组到LUV中,可以实现,包括有机溶剂介导的重组、机械机制或洗涤剂辅助重组4。我们这里提出了一种通过洗涤剂去除将果蝇在骨素中重组成预制脂体的方法。这种重组方法的优点包括高再生产量和脂质双层中甲苯的适正定向。此外,通过这种方法,蛋白质不干燥或暴露于有机溶剂,从而保持结构和功能。其缺点之一是,洗涤剂的存在可能并不适用于所有蛋白质,而最终的蛋白酶体在脂质双层中可能有一些结合的洗涤剂。进一步透析可用于消除更多的洗涤剂。然而,透析可能需要很长时间,因此可能导致蛋白质活性的丧失。

评估lastin的聚变活性可以通过脂质混合测定,如前^所述2。在这里,我们划定了一种通过N-(7-硝基苯-2-oxa-1,3-二氮-4-yl)/利萨明罗达明-B磺胺(罗达明)标记脂质测量lastin介导聚变的方法。这种测定需要融合供体(标记)蛋白酶体和受体(未标记)蛋白酶体。FRET释放可以在反应过程中测量为从"标记"脂质体稀释的供体受体对到"未标记"脂质体,这是膜融合过程中脂质混合的结果(图1)5。虽然这种测定是膜融合的代理,但它在区分膜融合和血合液方面受到限制,这种状态只有外层传单混合。为了解决这个问题,另一种选择是用二硝基石对NBD进行外部包装。遵循与NBD/罗达明脂质混合测定相同的方法,在淬火外单子时,任何NBD FRET通过融合释放的,都将是由于内部传单混合8。

替代融合测定由内部水含量混合地址完全融合只有5。这方面的例子有二聚氰胺(Tb)/二恶酸(DPA)测定和氨基苯三硫酸(ANTS)/p-二甲苯二(二甲苯)溴化物(DPX)测定。在 Tb/DPA 测定中,封装 Tb 的脂体池与封装 DPA 的脂体混合并融合在一起;融合后,荧光通过内部能量从DPA转移到Tb在[Tb(DPA)3+^3-结合复合^物6内增加。相比之下,对于ANTS/DPX测定,ANTS荧光由DPX7淬火。虽然这些系统解决了内部内容混合问题,但需要更深入地制备脂体,以去除非封装试剂,以及荧光荧光的意外相互作用。

研究方案

1. 消费税-达特尔-赫8的净化

1. 蛋白质表达和酸酶制剂
   1. 在 pGEX4-T3²中使用 GST-DAtl-His8 结构将 BL21 (DE3)大肠杆菌转换为大肠杆菌,并在阿霉素板上进行选择。
   2. 在14 mL培养管中选择单一转化剂,接种5 mL的LB+阿霉素(5μL,100mg/mL安西林),在25°C下孵育,在200rpm下摇动6-8小时。
      注:由于表达漏水,不建议在较高温度下孵育。在25°C下生长会减少蛋白质在此生长期间的聚集。
   3. 用1 mL的5 mL培养基接种200 mL的LB+阿霉素,并在25°C下孵育过夜(±15~18小时)。
   4. 第二天早上,通过离心(2,000 x g 10分钟)收获细胞,并在5 mL的LB中重新悬浮。
   5. 接种 4 L LB + 异氰酸酯,测量 OD₆₀₀ (0.05±0.15)。在25°C下孵育,摇动。
      注:在添加细菌之前,保留一些介质作为 OD₆₀₀测量的空白。
   6. 每小时测量 OD_600,直到达到 0.4-0.5 之间的 OD。此时,将温度降至 16°C。
   7. 诱导0.2 mM IPTG(800 μL的1M库存),孵化器达到16°C后10分钟。在16°C下孵育过夜(±15~18小时)。
      注:较低的温度通过减少蛋白的聚合提高功能蛋白的产量。
   8. 第二天早上,在4°C下以7,500 x g离心来收获细胞。
   9. 在 200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7.4) 和 200 mM KCl) 中重新悬浮电池。
   10. 在4°C下,在11,000 x g下将细胞离心5分钟。
   11. 在40 mL的破碎缓冲液中重新悬浮颗粒(A200加10%甘油、2 mM 2-mercapto乙醇、4%Triton X-100 (TX100)、40mM imidazole 和一片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片)。
       注:重新悬浮后添加 TX-100,以避免产生气泡和泡沫。
   12. 穿过18G针,在±10,000 psi下运行细胞通过细胞干扰器三次。
   13. 在 125,000 x g下离心提取物 1 小时。
       注:可选择将颗粒1:2(w:v)溶解在8M尿素中,并在室温下过夜。尿素作为变性剂,可缓慢溶解任何不溶性颗粒蛋白,用于SDS-PAGE分析。节省 1 μL 用于 SDS-PAGE 和库马西染色分析。
   14. 通过 0.45 μm 纤维素硝酸盐无菌膜过滤器过滤提取物,以去除细菌和大型细菌碎片。
       注:可选,为SDS PAGE和库马西染色分析保存1μL。
2. 通过亲和色谱进行蛋白质纯化
   1. 以 1 mL/ 的速率将过滤的赖沙酸盐加载到带 Ni²⁺的固定金属亲和色谱 (IMAC) 树脂柱上,预平衡低 imidazole 缓冲液(A100 加 10% 甘油、2 mM 2-mercapto 乙醇、1% TX-100、40 mM imidazole)在 4 °C 时最小。
   2. 用 25 mL 的 A100 加 10% 甘油、2 mM 2-mercaptoto 乙醇、0.1% Anapoe X-100、40 mM imidazole 清洗柱子,在 4°C 时速率为 1 mL/min。利用从 40 mM 到 500 mM 的 30 mL 线性梯度将蛋白质洗净,最后在 500 mM 下洗涤 5 mL。
   3. 汇集峰值分数,在 4°C 下孵育 1 小时,与肿胀的 GSH-Agarose 珠子一起孵育,以前在水中肿胀,在 A100 中与 10% 甘油、2 mM 2-mercaptoto 醇、0.1% Anapoe X-100 和 1 mM EDTA 进行平衡。
      注:GSH-Agarose 珠子可以在前一天的 50 mL 水中肿胀,并在 4°C 孵育过夜,或在 RT 孵育 1 小时。要去除水和平衡缓冲液,在 500 x g的摆动铲斗转子中离心 1 分钟,无需制动。用26G针吸气上清液。
   4. Pellet GSH-Agarose 珠子在 500 x g的摆动铲斗转子中离心,无需制动,并通过 26 G 针的吸气去除裂液上清液。
   5. 将珠子转移到10mL聚容柱上,用5mL的平衡缓冲液(A100与10%甘油,2mM 2-甲氨醇,0.1%Anapoe X-100和1mM EDTA)在500 x g离心洗涤5次。
   6. 用1~1.5 mL的平衡缓冲液补充10 mM减少谷胱甘肽。在液氮中稀释蛋白和闪光冻结。蛋白质可以无限期地储存在-80°C。
      注:将洗脱缓冲液的pH量调整到7.4。
   7. 通过酰胺黑蛋白^测定9量化蛋白质浓度,并通过SDS-PAGE和Coomassie染色评估纯度。

2. 重组性对拉他体重组成脂体

1. 用挤出法生产脂量¹⁰
   1. 使脂质混合储存在氯仿(10 mM总脂质)。必需的脂质是 1-棕榈基-2-油基-甘油-3 磷脂素 (POPC), 1,2-二恶英-sn-甘油-3 磷-L-血清 (DOPS 1,2-二醇-sn-甘油-3-磷乙醇-N-(7-硝基-2-1,3-苯二氮二氮-4-yl)(NBD-DPPE)和1,2-二苯基苯甲酰-甘油-3-磷乙醇胺-N-(利沙明罗达明B磺胺)(Rh-DPPE)。受体脂体由 POPC: DOPS (85:15 摩尔比) 和 POPC 的供体脂体:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 摩尔比) 组成。
      注:虽然POPC:DOPS脂质混合传统上用于体外脂质混合测定,但替代脂质组合物可能适合不同的实验目的。POPC:DOPS脂体非常稳定,难以熔断,因此是一个非常严格的融合系统。
   2. 在脂质混合物中加入1μCi/mL的L-α-二甲酰磷脂酰胆碱(胆碱甲基-3H),以便通过液体闪烁计数确定以后步骤的脂质浓度。至少保留 8 μL 的库存。
   3. 将所需数量的脂质混合物转移到火石玻璃管中。
   4. 在N2气体的温和流下干燥脂质混合物约10分钟,直到不再可见氯仿。
   5. 在干燥器中进一步干燥脂质膜,吸尘30分钟。
   6. 在脂质膜中加入足够的水性 A100,加入 10% 甘油、2 mM 2-mercapto 酸酯和 1 mM EDTA,并将浓度带回 10 mM。在室温下轻轻涡旋15分钟,重新悬浮脂质膜。推荐一种可以容纳火石玻璃管的涡旋器。
   7. 将液氮中的水合脂质冷冻解冻十次。在液氮中冷冻后,通过让溶液在室温下坐30s,解冻脂体,然后转移到水中,以更快地解冻。这种冻融循环将最大限度地减少多拉梅拉菌囊泡。
      警告:如果管子含有大于0.5 mL的体积,并且直接将液氮输送到水中,它们可能会破裂。
   8. 使用微型挤出机将脂质通过 100 nm 孔径为 19 倍的聚碳酸酯滤镜。
   9. 通过闪烁计数确定脂质体的总脂质浓度
      注:一些脂质可能留在玻璃管和微型挤出机。
      1. 在3 mL的闪烁鸡尾酒中加入4 μL的脂质和脂质体。
      2. 测量库存和脂体每分钟平均计数 (CPMA)。并采用以下公式计算脂体浓度:
   10. 将脂体储存在4°C下长达一周。不建议延长存储时间,因为脂体可能会随时间聚合,从而降低重组效率。
2. 通过洗涤剂协助合并成预先形成的脂体重组
   1. 计算要混合的缓冲液、蛋白质、脂体和额外洗涤剂的量:
      1. 确定所需的总卷。该体积由缓冲器 A100 和 10% 甘油、2 mM 2-mercaptoto 乙醇和 1 mM EDTA 组成。小于 250 μL 的体积在 0.5 mL 微离心管中不能很好地混合。
      2. 计算最终脂质浓度约为 1 mM 所需的脂质体体积。从缓冲区卷中减去该卷。
      3. 计算提供所需蛋白质与脂质摩尔比所需的蛋白质量(通常为 1:400)。相应地减小缓冲区量。
      4. 确定需要添加多少额外的洗涤剂来饱和脂质体,以达到 0.64–0.8 之间的有效洗涤剂与脂质比 (R eff)。切记考虑与蛋白质一起添加的洗涤剂。(R_eff)由方程 D_总为洗涤剂总浓度确定,D_水为单体洗涤剂浓度(TX-100 为 0.18 mM,在洗涤剂存在时为 Anapoe X-100)^{4, 11}.
   2. 以以下顺序将溶液混合在 0.5 mL 管中:缓冲液、洗涤剂、蛋白质和脂体。快速加入脂质体,立即涡旋5s,使混合物均质化。
   3. 在4°C下在螺母中孵育反应1小时。
   4. 使 0.2 g/mL 非极性聚苯乙烯吸附珠在水中"浆料"。
      注:使聚苯乙烯吸附珠在步骤 2.2.3 中的 1 小时孵育期间"浆料"。
   5. 称重 0.2 g 聚苯乙烯吸附珠子并转移到微离心管中。
   6. 通过在管中加入1mL甲醇,并混合1分钟,将珠子解气。脱气珠将下沉。
   7. 将甲醇吸出,并加入珠子中。让珠子与水混合5分钟,然后吸水。重复四次,然后将聚苯乙烯吸附珠"浆"带水至1 mL体积,最终浓度为0.2 g/mL。
      注:珠子仍应沉降到管的底部。如果他们不这样做,再次去气。使用 21 G 或更高的针头从珠子中吸出甲醇和水。
   8. 计算吸收每个样品中所有洗涤剂所需的聚苯乙烯吸附珠子的数量。1克聚苯乙烯吸附珠吸收70毫克TX-100。要计算每种反应所需的聚苯乙烯吸附珠浆的体积,请将反应中的总洗涤剂(步骤 2.2.1.4)除以 70 mg,然后除以珠浆的浓度(0.2 g/mL(步骤 2.2.7)。
   9. 将计算数量的聚苯乙烯吸附珠浆转移到0.5 mL管中,吸水。
      注:切下20⁄200 μL尖端的末端,以转移珠子,在移液前涡旋管以重新悬浮固定的珠子。
   10. 将样品加入含有聚苯乙烯吸附珠的0.5 mL管中,并在4°C下孵育样品螺母1小时。
   11. 重复两次留下旧珠子,并将样品转移到新鲜珠子上。
   12. 将样品加入第四管,加入新鲜珠子,并在4°C下孵育过夜(±15~18小时)。
3. 早晨,在4°C下,在16,000 x g处离心10分钟,从聚苯乙烯吸附珠和颗粒不溶性蛋白聚集体中取出样品。
4. 回收上清液,并通过液体闪烁计数确定最终脂质浓度(参见步骤 2.1.9.2)。或者,蛋白质浓度可以通过酰胺黑蛋白^测定9确定。
   注:对于蛋白酶蛋白酶体,应使用新鲜的脂质体进行酶测定。长时间储存在4°C或冷冻会导致在骨末素活性的显著损失。

3. 脂质混合测定

1. 使供体和受体蛋白酶体在A100中各浓度为0.15 mMM,含有10%甘油、2 mM β-甲苯醇、1mM EDTA和5 mM MgCl_2。每种反应(50 μL)应添加到适合荧光读数的扁平白色96孔板中的孔中。准备至少4种反应,包括三联和无GTP阴性对照。
2. 将板置于预热的板式读卡器中,温度为 37°C。测量 NBD 荧光(激励 460 nm,排放 535 nm),每分钟测量 5 分钟。
3. 通过加入 5 mM GTP(5 μL 50 mM GTP)诱导融合。
4. 每分钟测量 NBD 荧光 1 小时。
5. 加入5 μL 2.5%的w/v n-Dodecylβ-D-麦芽苷,以溶解蛋白酶体并测量最大NBD荧光。每分钟读取 NBD 荧光 15 分钟。

4. 硫醇不连续梯度上的脂体浮力¹²

1. (可选)通过浮动测定分析13的重建效率。
2. 在 A100 中制备 80% 和 30% 的 ihexol,含有 10% 甘油、2 mM 2-mercapto 酸酯和 1 mM EDTA。碘醇不易溶解,因此必须在前一天在4°C下过夜。
3. 将 150 μL 的 80% 碘酚库存与 150 μL 的蛋白酶体样品彻底混合,使其接近 40% 碘酚。将其添加到 5 x 41 mm²超透明管中,避免气泡。
4. 第250层μL的30%的碘醇在样品顶部缓慢地放量,使中间层。避免任何气泡和干扰底层。在中间层的顶部,缓慢地加入 50 μL 的 A100,其中 2 mM 2-mercaptoto 乙醇和 1 mM EDTA。
5. 在 4 °C 下,在 220,000 x g下将旋转铲斗转子中的梯度离心 4 小时,速度缓慢且无断裂。
6. 收获梯度层,并通过SDS-PAGE和库马西染色进行分析,定量可以通过密度测定法进行。重组后的蛋白质应浮到顶层,而蛋白质和脂质聚集物会沉积在底层或中间层。

5. 血栓蛋白蛋白解重组蛋白方向分析

注:此处报告的 atlastin 构造在 N 端 GST 标签的末端和 atlastin 的开始之间有一个血栓切割站点。正确方向的Atlastin将使蛋白酶能够进入这个切割部位,而方向错误的蛋白质将受到脂质双层保护。

1. 要测定蛋白蛋白体定向,请保留至少8μL的新鲜重组蛋白酶体。
2. 加入8 μL的蛋白酶体和1μL的1U/μL血栓。在37°C孵育1小时。
3. 用1μL 5mg/mL的EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒对蛋白酶进行淬火,并在37°C下孵育30分钟。
4. 通过 SDS-PAGE 和库马西染色分析样品。被分块和未加工的蛋白质的比例可以通过密度测定来确定。

结果

图2给出了对正感重组的效率。重组的蛋白酶体在碘醇不连续梯度中漂浮。未结合的蛋白质沉积在底层 (B) 或中间层 (M) 中。重组后的蛋白质会浮到顶层(T)。梯度样本由SDS-PAGE和库马西染色采集和分析。通过密度测定对凝胶进行定量,表明重建效率很高,损失可忽略不计;96%的总蛋白质被发现为浮到顶层(T)的蛋白酶体。不到1%的蛋白质未重组,在中间层(M)中发现,只有3%未重组或聚合并...

讨论

本文的方法为重组lastin的净化、重组和测量融合活性提供了一种有效的方法。为了确保高产量的功能lastlastin一些关键步骤必须考虑。在低温(16°C)下必须表达阿列酮,以避免聚集,并且一种应针对0.4~1.5mg/mL的最终浓度。非常稀蛋白不会以1:400蛋白质与脂质比进行最佳重组。通过此处描述的浮点测定法(图 2),可以有选择地分析重组效率。脂质体浮化测定的优点之一是,可以扩展分析?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL poly-prep chromatography columns	Biored	731-1550
10 x 75 mm Flint glass tubes	VWR	608225-402
47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters	Whatman	7141 104
96 well white plate	NUNC	437796
Anapoe X-100	Anatrace	9002-931-1
Cell disrupter	Avestin	Avestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))	Avanti	840035P-10mg	DOPS
EDTA	Research organics inc.	6381-92-6	Ethylenediaminetetraacetic acid
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001	Complete protease inhibitor
Extruder	Sigma Aldrich	Z373400	Liposofast Basic Extruder
GE Akta Prime liquid chromatography system	GE Pharmacia	8149-30-0006
Glutathione agarose beads	Sigma aldrich	G4510-50ml
Glycerol	EMD	GX0185-5
GTP	Sigma Aldrich	36051-31-7	Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate
HEPES, acid free	Omnipur	5330
Imidazole	fluka	5670
Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column	GE Healthcare	17040801	1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns
Iohexol	Accurate chemical and scientific corporation	AN 7050 BLK	Accudenz/Nycodenz
IPTG	Research products international corp.	I56000-100.0	IPTG, dioxane free
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5g
Magnesium chloride	Fisher	7791-18-6
Methanol	Omnisolv	MX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))	Avanti	236495	NBD-DPPE
n-Dodecyl β-D-maltoside	Chem-Impex International	21950
Nonpolar polystyrene adsorbent beads	BioRad	152-3920	SM2 Biobeads
Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane	Whatman	800309
Optima LE80K Ultra centrifuge	Beckman Coulter
Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H]	ARC	ART0284	Titriated lipids
Plate reader	TECAN	TECAN infinite M200 plate reader
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti	850457C-25mg	POPC
Potassium chloride	MP	151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))	Avanti	236495	Rh-DPPE
Scintillation Cocktail	National Diagnostics	LS-272	Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples
Scintillation vials	Beckman	592928	Fast turn cap Mini Poly-Q Vial
Thrombin	Sigma	T1063-1kU	Thrombin from human plasma
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm	Beckman	344090
Vortex 9 to 13mm Tube Holder	VWR	58816-138	Insert for vortexing flint glass tubes
Vortex Insert Retainer	VWR	58816-132	Retainer needed for vortex tube holder
Vortexer	VWR	2.235074	Vortex Genie 2 model G560
β-mercaptoethanol molecular biology grade	Calbiochem	444203