Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Özet

Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.

Özet

Membran füzyon ökaryotik hücrede önemli bir süreçtir. Özel proteinler füzyon katalizörler için gereklidir. Atlastins, er 'in homottifik füzyon içinde bulunan endoplazmik retikulum (er) yerleşik proteinleridir. Biz detay burada bir glutatyon S-transferase (GST) ve Poly-histidin temizleyerek için bir yöntem benzeşme Kromatografi iki tur tarafından Drosophila atlastin etiketlenmiş. Füzyon reaksiyonları içinde vitro eğitim, lipid bilayer içine yerleştirilmek üzere arıtılmış füzyon proteinlerini gerektirir. Lipozomlar ideal model membranlara sahiptir, lipid bileşimi ve boyutu ayarlanabilir. Bu amaçla, biz önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine Drosophila atlastin için deterjan kaldırma ile bir reanayasa yöntemi açıklanmaktadır. Çeşitli reanayasa yöntemleri mevcut iken, deterjan kaldırma ile reanayasası atlastins ve diğer benzer proteinler için uygun hale getirmek çeşitli avantajları vardır. Bu yöntemin avantajı, reconstituted proteinin yüksek reanayasa verimi ve doğru yönünü içerir. Bu yöntem diğer membran proteinleri ve proteoliposomes gerektiren diğer uygulamalar için uzatılabilir. Ayrıca, membran füzyon ölçümü olarak kullanılan proteoliposomların bir FRET bazlı lipid karıştırma tahlili açıklanmaktadır.

Giriş

Membran füzyon birçok biyolojik reaksiyonda kritik bir süreçtir. Biyolojik koşullarda, membran füzyon spontan değildir ve bu tür reaksiyonlar katalizleştirmek için özel füzyon proteinleri gerektirir¹. ER homotipik membran füzyon, Dynamin ile ilgili GTPase atlastin²' ye göre hayvanlarda aracılık edilir. Homotipik füzyon atlastin rolü periferik er üç yönlü kavşak için temel, hücre boyunca uzatmak tübüllerin büyük bir bağlantılı ağ oluşturmaktadır. Atlastins, büyük bir GTPase, üç sarmal paket orta etki alanı, hidrofobik membran çapa ve kısa sitoplazmik C-Terminal kuyruğu³' ten oluşan bir korunması alan morfolojisine sahiptir. İn vitro çalışmalar rekombinant Drosophila atlastin ile lipozomlar için reconstituted, onun fusogenic özelliklerini korur göstermiştir. İnsan homologlar da dahil olmak üzere diğer atlastins, Fusion in vitro reapitulate mümkün olmamıştır. Biz burada bir GST ve poli-histidin etiketli rekombinant Drosophila atlastin arındırmak için bir metodoloji tarif, lipozomlar için reconstituting, ve füzyon iddia.

Membran füzyon içinde vitro eğitim fusogenik proteinler genellikle bir membran çapa sahip olarak bir meydan okuma sunar. Onları incelemek için, onları model lipid bilayers içine yeniden oluşturmak için gereklidir. Büyük unilamellar veziküller (LUV) lipid protein etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır. Biz burada bir sistem protein reanayasası ve füzyon assays için farklı lipid bileşimleri LUVs yapmak için sunuyoruz. Integral proteinlerin luvs içine yeniden oluşturulması da dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir, organik solvent aracılı reanayasa, mekanik mekanizmalar, veya deterjan destekli sulandırma⁴. Biz burada bir yöntem sunuyoruz Drosophila atlastin ön biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan kaldırma. Bu reanayasa yönteminin avantajları yüksek reanayasa verimi ve lipid bilayer içinde atlastin uygun oryantasyonu içerir. Ayrıca, bu yöntem sayesinde, protein kurutulmaz veya organik çözücülere maruz kalmaktadır, böylece yapı ve fonksiyon sürdürüyor. Dezavantajları arasında, deterjanların varlığı tüm proteinler için ideal olmayabilir ve son proteoliposomların lipid bilayer içinde bazı entegre deterjan olabilir. Daha fazla diyaliz daha fazla deterjan ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Ancak diyaliz uzun sürebilir ve bu nedenle protein aktivitesinin kaybına neden olabilir.

Atlastin 'in füzyon aktivitesinin değerlendirilmesi, daha önce açıklandığı gibi lipid karıştırma kavramında belirlenir². Burada, biz N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-il (NBD)/Lissamine Rhodamine-B sülfonil (Rhodamine) etiketli lipidler yoluyla atlastin aracılı füzyon ölçmek için bir yöntem betimlemek. Bu tahlil donör (etiketli) proteoliposomes ve Acceptor (etiketlenmemiş) proteoliposomes füzyon gerektirir. Bir donörün seyreltmesi olarak reaksiyon sırasında bir FRET sürümü ölçülebilir – membran füzyon sırasında lipid karıştırma sonucunda "etiketli" lipozomlar "etiketlenmemiş" liderecede ' den alıcı çifti (Şekil 1)⁵. Bu tahlil membran füzyon için bir vekil olarak hizmet ederken, membran füzyon ve hemifüzyon arasında ayırt sınırlıdır, bir devlet nerede sadece dış broşürler karışımı. Bu sorunu gidermek için, alternatif olarak NBD 'nin dithionite tarafından dış broşür giderici olduğunu. NBD/Rhodamine lipid karıştırma gibi aynı metodoloji takip, dış broşürün füzyon tarafından herhangi bir NBD FRET serbest Quenching üzerine iç broşür karıştırma⁸nedeniyle olacaktır.

Alternatif füzyon iç sulu içerik karıştırma adresi tam füzyon sadece⁵tarafından görülmektedir. Bu örnekler Terbiyum (TB)/dipicolinik asit (DPA) deneyleri ve aminonaphthalene trisulfonik asit (karıncalar)/p-Xylene bis (pyridinium) bromür (DPX) deneyleri. TB/DPA 'da, kapsüllenmiş TB olan lipozomlar havuzu karışık ve kapsüllü DPA ile lipozomlar ile kaynaşıyor; Füzyon üzerine, floresans [TB (DPA)₃]^3- şelasyon kompleksi⁶içinde DPA 'dan TB 'ye dahili enerji aktarımı ile artar. Buna karşılık, ANTS/DPX için, ANTS floresans DPX⁷tarafından söndürülün. Bu sistemler iç içeriği karıştırırken, lipozomların daha derinlemesine hazırlanması, kapsüllenmeyen reaktiflerin kaldırılması ve fluorophorlerin istenmeyen etkileşimi için gereklidir.

Protokol

1. GST-DAtl-His8 arıtma

1. Protein ifadesi ve lysate hazırlığı
   1. BL21 (DE3) E. coli 'yi PGEX4-T3² ' de GST-Datl-His8 yapısı ile dönüştürün ve bir ampikilin plakasını seçin.
   2. 14 mL 'Lik bir kültür tüpünde 5 mL LB + ampisilin (5 μL 100 mg/mL ampisilin) olarak tek bir transformant seçin ve 6-8 h için 200 rpm 'de sallayarak 25 °C ' de inkük et.
      Not: Sızdırmaz ifade nedeniyle, yüksek sıcaklıklarda inkübe etmek tavsiye edilmez. 25 °C ' de büyüme, bu büyüme döneminde protein toplamayı azaltır.
   3. 5 mL kültürden 1 mL 'Lik LB + ampisilin 200 mL 'yi ınoculate ve 25 °C ' de gecede (~ 15 – 18 h) inkük edilir.
   4. Ertesi sabah, santrifüjleme ile hücreleri hasat (2.000 x g 10 dk) ve pelletini içinde 5 ml lb.
   5. Inoculate 4 L LB + ampisilin ve ölçüm OD₆₀₀ (0.05 – 0.15). Titreyerek 25 °C ' de inküye.
      Not: Bakteri eklemeden önce OD₆₀₀ ölçümleri için boş olarak hizmet vermek için bazı medya rezerv.
   6. Ölçüm OD₆₀₀ her saat 0.4 – 0.5 arasında bir od ulaşır kadar. Bu noktada, sıcaklığı 16 °C ' ye azaltın.
   7. 0,2 mM ıPTG (800 μL 1 M stokta) ile birlikte, 10 dakika sonra kuluçkörü 16 °C ' ye ulaşır. Bir gecede (~ 15 – 18 saat) 16 °C ' de inküytir.
      Not: Düşük sıcaklık atlastin toplama azaltarak fonksiyonel protein verimi artırır.
   8. Ertesi sabah, 4 °C ' de 7.500 x g santrifügleme ile hücreleri hasat.
   9. 200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) ve 200 mM KCl) hücrelerinde yeniden resuspend.
   10. 11.000 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler.
   11. (A200 artı 10% gliserol, 2 mm 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mm imidazol ve bir EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl tablet) kırma tampon 40 ml Pelet resuspend.
       Not: Baloncuklar ve köpük üretme önlemek için resuspending sonra TX-100 ekleyin.
   12. Bir 18 G iğne üzerinden geçmek ve üç kez bir hücre bozucu üzerinden hücreleri çalıştırmak ~ 10.000 psi.
   13. 1 saat için 125.000 x g 'de özü Santrifüjü.
       Not: İsteğe bağlı olarak pelet 1:2 (w:v) 8 M Urea ve oda sıcaklığında gecede nutate çözülür. Bir denaturant olarak Urea SDS-PAGE analizi için yavaşça çözünebilir peletli protein çözünür. SDS-PAGE ve Coomassie leke analizi için 1 μL tasarruf edin.
   14. Bakteri ve büyük bakteriyel enkaz kaldırmak için 0,45 μm selüloz nitrat steril membran filtre aracılığıyla ekstresi filtre.
       Not: Isteğe bağlı olarak, SDS PAGE ve Coomassie leke analizi için 1 μL kaydedin.
2. Benzerliği kromatografi ile protein arıtma
   1. Süzülmüş lysate, ni^{2 +}ile şarj edilmiş immobilize metal benzeşimi Kromatografi (IMAC) reçine sütun üzerine yükleyin, düşük imidazol tampon ile önceden equilibrated (A100 artı 10% gliserol, 2 mm 2-mercaptoetanol, 1% TX-100, 40 mm imidazol) bir hızda 1 ml/ min 4 °C ' de.
   2. Sütunu 25 mL A100 artı% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazol ile 4 °C ' de 1 mL/dak hızında yıkayın. 40 mM 'den 500 mM 'ye kadar imidazol 30 mL doğrusal gradyan ile proteini elute ve 500 mM 'de son 5 mL yıkama.
   3. Havuz birlikte zirve fraksiyonları ve 1 h 4 °C ' de şişmiş GSH-Agarose boncuk ile, daha önce suda şişmiş ve% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 ve 1 mM EDTA ile A100 içinde dengelenmiş.
      Not: GSH-Agarose boncuklar önceki gün 50 mL su içinde şişebilir ve 4 °C ' de veya RT 'de 1 h 'de bir gecede inküte edilir. Su ve dengeleme tamponunu kaldırmak için, 500 x g 'de 1 dakika frensiz olarak sallanan kova rotorunda santrifüjler. 26 G iğne ile süpernatant aspirate.
   4. Pellet GSH-agarose boncuk 500 x g frensiz bir sallanan kova rotor santrifüjleme ve 26 g iğne ile aspirasyon ile lysate süpernatant çıkarın.
   5. Boncukları 10 mL polyprep sütununa aktarın ve 5 mL Dengeleme tamponu ile beş kez yıkayın (A100% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100 ve 1 mM EDTA), 500 X g 'de santrifüpleme yaparak .
   6. 10 mm azaltılmış glutatyon ile takviyalı 1 – 1,5 ml dengelemesinden tampon ile protein elute. Sıvı nitrojen içinde aliquot elüe protein ve flaş dondurulması. Protein-80 °C ' de süresiz olarak depolanabilir.
      Not: 7,4 için elüsyon tampon pH ayarlayın.
   7. Amonye siyah protein assay tarafından protein konsantrasyonu ölçmek⁹ ve SDS-sayfa ve Coomassie boyama tarafından saflık değerlendirmek.

2. rekombinant Atlastin lipozomlar içine reanayasası

1. Ekstrüzyon yöntemiyle Liposome üretim ¹⁰ ' dan fazla
   1. Kloroform (10 mM toplam lipid) lipid karışımı stokları olun. Gerekli lipidler 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-phospho-L-serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-fosfoetolidin-N-(7-Nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (NBD-DPPE), ve 1, 2- Dipalmitoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-(lissamine rodamin B sülfonil) (RH-dppe). Acceptor lipozomlar POPC oluşur: DOPS (85:15 molar oranı) ve POPC donör lipozomlar: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molar oranı).
      Not: POPC: DOPS lipid karışımları geleneksel olarak in vitro lipid karıştırma işlemleri için kullanılırken, alternatif lipid bileşimleri farklı Deneysel amaçlar için uyarlanabilir. POPC: DOPS lipozomlar çok kararlı ve sigortalı zor, bu nedenle füzyon için çok sıkı bir sistemdir.
   2. 1 Μcı/mL L-α-Dipalmitoyl-Fosfatidilkolin (Kolin metil-3H) lipid karışımlarına, daha sonraki adımlarla sıvı scintilasyon sayımı ile lipid konsantrasyonlarını belirlemek için ekleyin. Bu stokta en az 8 μL rezerve et.
   3. İstenilen miktarda lipid karışımları, çakmaktaşı cam tüplere aktarın.
   4. Daha fazla kloroform görülene kadar N₂ gazının yumuşak bir akışı altında lipid karışımların kuru.
   5. 30 dakika vakumlama ile bir kurutucu içinde daha fazla lipid filmi kuru.
   6. Yeterli sulu A100 ekleyin 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, ve 1 mM EDTA lipid film ve 10 mM konsantrasyon geri getirmek. Oda sıcaklığında 15 dakika hafifçe vortekslenir tarafından lipid filmi resuspend. Flint cam tüpler barındırabilir bir vorteks tavsiye edilir.
   7. Sıvı azot on kez nemlendirici lipidler dondurmak-çözüyor. Sıvı nitrojen içinde dondurulduktan sonra, solüsyonun 30 s için oda sıcaklığında oturmasına izin vererek lipozomları çözün, daha sonra daha hızlı çözme için suya aktarın. Bu donma-çözülme bisiklet çok amellar veziküller en aza indirir.
      Dikkat: Onlar 0,5 mL 'den büyük birimler içeriyorsa ve doğrudan suya sıvı azot formu aktarıldığında tüpler çatlak olabilir.
   8. Mini Extruder kullanarak 100 Nm gözenek boyutu 19 kez Polikarbonat filtreleri ile lipid geçirin.
   9. Skintilasyon sayımı ile lipozomların toplam lipid konsantrasyonu belirlenmesi
      Not: Bazı lipid cam tüpler ve mini-Extruder geride bırakılabilir.
      1. 3 mL scintilasyon kokteylinde 4 μL lipid stokları ve lipozomlar ekleyin.
      2. Stok ve lipozomlar için dakika başına ortalama sayar (CPMA) ölçün. Ve aşağıdaki formül ile lipozomlar konsantrasyonu hesaplayın:
   10. Lipozomları 4 °C ' de bir haftaya kadar saklayın. Lipozomlar zaman ile toplu olabilir olarak daha uzun depolama tavsiye edilmez, reanayasa verimlilikleri azalan.
2. Önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan destekli kuruluş ile Reconstitution
   1. Birlikte karıştırılacak tampon, protein, lipozomlar ve ekstra deterjan miktarını hesaplayın:
      1. İstenen toplam hacmi belirleyin. Bu hacim, 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile A100 tampon oluşur. 250 μL 'den küçük birimler 0,5 mL mikrosantrifüj tüplerde iyi karışmaz.
      2. Yaklaşık 1 mM son lipid konsantrasyonu vermek için gerekli lipozomların hacmini hesaplayın. Birim arabellek biriminden çıkarın.
      3. İstenen protein lipid molar oranı (genellikle 1:400) vermek için gerekli protein hacmini hesaplayın. Arabellek hacmini buna göre azaltın.
      4. 0.64 – 0.8 arasında etkili bir deterjan için lipid oranı (R_eff) hedefleyen lipozomları doyurmak için ne kadar ekstra deterjan eklenmesi gerektiğini belirleyin. Protein ile eklenen deterjan düşünün unutmayın. (R_eff ) denklem ile belirlenir d_Toplam toplam deterjan konsantrasyonu ve d_su MONOMERIK deterjan konsantrasyonu (0,18 mm TX-100 ve anapoe X-100 deterjan varlığında)^{4, 11}' den itibaren.
   2. Çözümleri birlikte bir 0,5 mL tüpte aşağıdaki sırada karıştırın: tampon, deterjan, protein ve lipozomlar. Hızla lipozomlar ekleyin ve karışımı homojenize 5 s için hemen girdap.
   3. 4 °C ' de 1 h için bir çatlak içinde reaksiyonu kuluçsa.
   4. Su içinde 0,2 g/ml apolar polistiren adsorban boncuk "bulamaç" olun.
      Not: Adım 2.2.3 yılında önceki 1 h inkübasyon sırasında polistiren adsorban boncuk "bulamaç" olun.
   5. Polistiren adsorban boncuk 0,2 g tartmak ve bir mikrosantrifüj tüp transfer.
   6. Tüp ve karışımı 1 dk için metanol 1 mL ekleyerek boncuklar Degas. gaz edilmiş boncuk batırılır.
   7. Metanol aspirate ve boncuk su ekleyin. Boncuk 5 dakika su ile karıştırın, sonra su Aspire edelim. Dört kez tekrarlayın, sonra su ile 1 ml hacmine polistiren adsorban boncuk "bulamaç" getirmek ve 0,2 g/ml son konsantrasyon.
      Not: Boncuklar hala tüpün altına yerleşmeli. Yoksa, tekrar Degas. Boncuk metanol ve su Aspire için 21 G veya daha yüksek iğne kullanın.
   8. Her numunenin tüm deterjan absorbe etmek için gerekli polistiren adsorban boncuk miktarını hesaplayın. 1 gr polistiren adsorban boncuklar 70 mg TX-100 emer. Her reaksiyon için gerekli polistiren adsorban boncuk Bulamaç hacmi hesaplamak için, reaksiyonda toplam deterjan Böl (adım 2.2.1.4) tarafından 70 mg, ve sonra boncuk Bulamaç konsantrasyonu (0,2 g/ml (adım 2.2.7).
   9. Transfer hesaplanan miktarı polistiren adsorban boncuk Bulamaç için bir 0,5 ml tüp ve Aspire su.
      Not: Boncukları aktarmak için 20 – 200 μL ucunun sonunu kesip, boruyu pipetleme işleminden hemen önce yerleştirerek yerleşmiş boncuklar yeniden pelletini.
   10. Örnekleri eklemek 0,5 ml tüp polistiren adsorban boncuklar içeren ve örnek nutating için 1 h 4 °c ' de kuluçkmak.
   11. Tekrar iki kez eski boncuk geride bırakarak ve taze boncuklar için örnek transfer tekrarlayın.
   12. Numuneyi taze boncuklarla dördüncü bir tüpe ekleyin ve gece (~ 15 – 18 saat) 4 °C ' de inküye yapın.
3. Sabah, 4 °c ' de 16.000 x g 'de 10 dakika santrifüpleme yapılarak polystyren adsorban boncuk ve Pelet çözünmez protein topaklardan numuneyi çıkarın.
4. Süpernatant kurtarmak ve sıvı scintıtma sayma ile son lipid konsantrasyonu belirlemek (adım 2.1.9.2 bakın). İsteğe bağlı olarak, protein konsantrasyonu, siyah protein assay tarafından belirlenebilir⁹.
   Not: Proteoliposomes atlastin için, enzimatik asdalar taze lipozomlar ile yapılmalıdır. 4 °C ' de uzun depolama veya donma, atlastin aktivitesinde önemli bir kaybına yol açar.

3. lipid karıştırma Assays

1. % 10 gliserol, 2 mM β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA ve 5 mM MgCl₂ile her biri A100 'de 0,15 mm konsantrasyonuna donör ve alıcı proteoliposomları getirin. Her reaksiyon (50 μL) floresans okumaları için uygun düz beyaz 96 iyi plaka bir kuyu eklenmesi gerekir. Bir triplicate ve No-GTP negatif kontrol dahil olmak üzere en az 4 reaksiyonlar hazırlayın.
2. Plakayı 37 °C ' de önceden ısıtılmış bir plaka okuyucuya yerleştirin. Ölçüm NBD floresans (Excitation 460 nm ve emisyon 535 Nm) için 5 dk her dk.
3. 5 mM GTP (5 μL 50 mM GTP) ekleyerek füzyon yaratın.
4. 1 saat için her dakika NBD floresans ölçmek.
5. Proteoliposomları çözmek ve maksimum NBD floresans ölçmek için 5 μL 2,5% w/v n-Dodecyl β-D-maltoside ekleyin. NBD floresans her dakika 15 dakika okuyun.

4. ıohexol diskontinü gradyan¹² Liposome floatation

1. isteğe bağlı ¹³. floatasyon ile reanayasanın verimliliğini analiz edin.
2. 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile A100 'de% 80 ve% 30 w/v iohexol hazırlayın. Iohexol kolayca çözülür, bu yüzden bu gece 4 °C ' de nutating bir gün önce hazırlanmalıdır.
3. 80% iohexol ile 150 μL proteoliposomes numunesi ile 150 μL 'i iyice karıştırın ve% 40 iohexol 'e getirin. Bu Ekle 5 x 41 mm² Ultra-Clear tüp kaçınarak kabarcıklar.
4. Layer 250 μL% 30 iohexol stok yavaşça numunenin üstünde bir orta tabaka yapmak için. Herhangi bir kabarcıklar kaçının ve alt katman rahatsız. Orta tabakanın üst kısmında, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile yavaşça 50 μL A100 ekleyin.
5. 220.000 x g 'de 4 °c ' de yavaş ivme ve mola olmadan sallanan kova rotorunda gradyan Santrifüjü.
6. Gradyan katmanları hasat ve SDS-PAGE ve Coomassie leke tarafından analiz, ölçüme densitometri tarafından yapılabilir. Reconstituted protein üst katmana yüzer, protein ve lipid agregaları alt veya Orta katmanda tortu olacak iken.

5. Trombin proteolizi ile yeniden şekillendirilmiş proteinin oryantasyonu Analizi

Not: Burada bildirilen atlastin yapısı, N-terminal GST etiketinin sonu ve atlastin başlangıcı arasında bir Trombin kesim sitesi vardır. Doğru yönde atlastin bu kesim sitesi proteaz erişilebilir olacak, yanlış yönde protein lipid bilayer tarafından korunacaktır iken.

1. Proteoliposome oryantasyon atlastin tahlil için, en az 8 μL taze reconstituted proteoliposomes rezerv.
2. 8 μL proteoliposomes ve 1 μL 1 U/μL Trombin ekleyin. 37 °C ' de 1 saat boyunca inküye yapın.
3. 1 μL 5 mg/mL EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyli ile proteaz giderin ve 37 °C ' de 30 dakika boyunca inküye yapın.
4. SDS-PAGE ve Coomassie lekesi ile numuneyi analiz edin. Kırpılmış ve uncleaved protein oranı densitometri ile belirlenebilir.

Sonuçlar

Atlastin reanayasasının verimliliği Şekil 2' de sunulmuştur. Reconstituted proteoliposomes bir ıohexol kesintisiz gradyan içinde süzülmüştü. Unıncorporated protein alt katmanda (B) veya Orta katmanda (M) posalı oldu. Reconstituted protein üst katmanda (T) yüzer. Gradyan örnekleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama tarafından hasat edilmiş ve analiz edilmiştir. Jelin densitometri ile ölçülmesi, ihmal edilebilir kaybeder ile reanayasanın çok yüksek bir verimliliğini göst...

Tartışmalar

Buradaki Yöntemler, rekombinant atlastin 'in füzyon aktivitesini arındırmak, reconstituting ve ölçmek için verimli bir yöntem tarif ederler. Bazı kritik adımlarla fonksiyonel atlastin yüksek verim sağlamak için dikkate alınmalıdır. Atlastin ifadesi, toplama işleminden kaçınmak için düşük sıcaklıklarda (16 °C) yapılmalıdır ve bir adet 0.4 – 1.5 mg/mL arasında son bir konsantrasyon hedeflemelisiniz. Çok seyreltilmiş protein bir 1:400 protein lipid oranı en iyi şekilde reconstituted olmay...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL poly-prep chromatography columns	Biored	731-1550
10 x 75 mm Flint glass tubes	VWR	608225-402
47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters	Whatman	7141 104
96 well white plate	NUNC	437796
Anapoe X-100	Anatrace	9002-931-1
Cell disrupter	Avestin	Avestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))	Avanti	840035P-10mg	DOPS
EDTA	Research organics inc.	6381-92-6	Ethylenediaminetetraacetic acid
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001	Complete protease inhibitor
Extruder	Sigma Aldrich	Z373400	Liposofast Basic Extruder
GE Akta Prime liquid chromatography system	GE Pharmacia	8149-30-0006
Glutathione agarose beads	Sigma aldrich	G4510-50ml
Glycerol	EMD	GX0185-5
GTP	Sigma Aldrich	36051-31-7	Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate
HEPES, acid free	Omnipur	5330
Imidazole	fluka	5670
Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column	GE Healthcare	17040801	1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns
Iohexol	Accurate chemical and scientific corporation	AN 7050 BLK	Accudenz/Nycodenz
IPTG	Research products international corp.	I56000-100.0	IPTG, dioxane free
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5g
Magnesium chloride	Fisher	7791-18-6
Methanol	Omnisolv	MX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))	Avanti	236495	NBD-DPPE
n-Dodecyl β-D-maltoside	Chem-Impex International	21950
Nonpolar polystyrene adsorbent beads	BioRad	152-3920	SM2 Biobeads
Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane	Whatman	800309
Optima LE80K Ultra centrifuge	Beckman Coulter
Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H]	ARC	ART0284	Titriated lipids
Plate reader	TECAN	TECAN infinite M200 plate reader
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti	850457C-25mg	POPC
Potassium chloride	MP	151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))	Avanti	236495	Rh-DPPE
Scintillation Cocktail	National Diagnostics	LS-272	Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples
Scintillation vials	Beckman	592928	Fast turn cap Mini Poly-Q Vial
Thrombin	Sigma	T1063-1kU	Thrombin from human plasma
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm	Beckman	344090
Vortex 9 to 13mm Tube Holder	VWR	58816-138	Insert for vortexing flint glass tubes
Vortex Insert Retainer	VWR	58816-132	Retainer needed for vortex tube holder
Vortexer	VWR	2.235074	Vortex Genie 2 model G560
β-mercaptoethanol molecular biology grade	Calbiochem	444203