Ricostituzione assistita da detergenti della Drosophila ricombinante Atlastin in Liposomi per i saggi che mescolano i lipidi

Riepilogo

La fusione biologica della membrana è catalizzata da proteine di fusione specializzate. Misurare le proprietà fusogene delle proteine può essere ottenuto mescolando saggi. Vi presentiamo un metodo per purificare la Drosophila ricombinante atlastina, una proteina che media la fusione omotipica del ER, riconformandola in liposomi preformati e testando la capacità di fusione.

Abstract

La fusione a membrana è un processo cruciale nella cellula eucarica. Proteine specializzate sono necessarie per catalizzare la fusione. Le atlastine sono proteine residenti nell'endoplasmico (ER) implicate nella fusione omotipica del ER. Abbiamo descritto qui un metodo per purificare un glutathione S-transferase (GST) e poli-istidina etichettato Drosophila atlastina da due cicli di cromatografia di affinità. Lo studio delle reazioni di fusione in vitro richiede l'inserimento di proteine di fusione purificate in un bistrato lipidico. I liposomi sono membrane modello ideale, come la composizione e le dimensioni dei lipidi possono essere regolati. A tal fine, descriviamo un metodo di ricostituzione mediante rimozione del detergente per la Drosophila atlastin a liposomi preformati. Sebbene siano disponibili diversi metodi di ricostituzione, la ricostituzione mediante rimozione del detergente presenta diversi vantaggi che lo rendono adatto per atlastini e altre proteine simili. Il vantaggio di questo metodo include un'elevata resa di ricostituzione e un corretto orientamento della proteina ricostituita. Questo metodo può essere esteso ad altre proteine della membrana e per altre applicazioni che richiedono proteoliposomi. Inoltre, descriviamo un saggio di miscelazione dei lipidi a base di FRET di proteoliposomi utilizzati come misura della fusione della membrana.

Introduzione

La fusione a membrana è un processo critico in molte reazioni biologiche. In condizioni biologiche, la fusione della membrana non è spontanea e richiede proteine di fusione specializzate per catalizzare tali reazioni¹. Er fusione della membrana otipipica è mediata negli animali dal dinamino correlato GTPase atlastin². Il ruolo di Atlastin nella fusione omotipica è fondamentale per le giunzioni a tre vie nel ER periferico, che costituisce una grande rete interconnessa di tubuli che si estendono in tutta la cellula. Atlastins hanno una morfologia di dominio conservato costituito da una grande GTPase, un dominio intermedio fascio di tre elicoie, un'ancora di membrana idrofobica, e una breve coda citoplasmatica C-terminal3³. Studi in vitro con drosophila ricombinante alla Drosophila atlastin hanno dimostrato che, una volta ricostituito per i liposomi, mantiene le sue proprietà fusogene. Altri atlastini, compresi gli omologhi umani non sono stati in grado di ricapitolare la fusione in vitro. Descriviamo qui una metodologia per purificare un GST e la poli-idina etichettata come l'atsolazione ricombinante della Drosophila, riconciliandola ai liposomi e rivaleggere la fusione.

Lo studio della fusione della membrana in vitro rappresenta una sfida in quanto le proteine fusogene di solito hanno un'ancora di membrana. Per studiarli, è necessario ricostituirli in modelli di bistrati lipidici. Le grandi vesciche di unilamellar (LUV) sono uno strumento utile per studiare le interazioni delle proteine lipidi. Vi presentiamo qui un sistema per fare LUV di diverse composizioni lipidiche per la ricostituzione delle proteine e i saggi di fusione. La ricostituzione delle proteine integrali nei LLU può essere ottenuta con una varietà di metodi, tra cui la ricostituzione organica mediata dal solvente, i meccanismi meccanici o la ricostituzione assistita dal detersivo⁴. Vi presentiamo qui un metodo per ricostituire la Drosophila atlastina in liposomi preformati mediante rimozione del detersivo. I vantaggi di questo metodo di ricostituzione includono elevati rendimenti di ricostituzione e un corretto orientamento di atlastin nel bistrato lipidico. Inoltre, attraverso questo metodo, la proteina non viene essiccata o esposta a solventi organici mantenendo così la struttura e la funzione. Tra i suoi svantaggi, la presenza di detergenti potrebbe non essere ideale per tutte le proteine e i proteoliposomi finali possono avere qualche detergente incorporato nel bistrato lipidico. Ulteriore dialisi può essere utilizzata per eliminare più del detersivo. Tuttavia, la dialisi può richiedere molto tempo e può quindi portare alla perdita di attività proteica.

La valutazione dell'attività di fusione di atlastin può essere determinata mescolando saggi come descritto in precedenza². Qui, deperiamo un metodo per misurare la fusione mediata atlastina attraverso i lipidi etichettati N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine). Questo saggio richiede la fusione di proteoliposomi donatore (etichettato) e proteoliposomi accettatori (senza etichetta). Un rilascio di FRET può essere misurato durante la reazione come la diluizione di una coppia donatore-acceleratore da liposomi "etichettati" a liposomi "senza etichetta" come risultato della miscelazione dei lipidi durante la fusione della membrana (Figura 1)⁵. Mentre questo test serve come proxy per la fusione della membrana, è limitato nel distinguere tra fusione della membrana ed emifusione, uno stato in cui solo i volantini esterni si mescolano. Per risolvere questo problema, un'alternativa è l'eliminazione di NBD da parte di NBD per dithionite. Seguendo la stessa metodologia dei pronostici di miscelazione dei lipidi NBD/rhodamine, dopo aver placato il volantino esterno qualsiasi rilascio NBD FRET mediante fusione sarà dovuto alla miscelazione interna dei volantini⁸.

Saggi di fusione alternativa da contenuti acquosi interni mixaggio indirizzo full fusion solo⁵. Esempi di questo sono i saggi di terbio (Tb)/dipicolinic acid (DPA) e i saggi di acido trisulfonico aminonaftalene (ANTS)/p-xylene bis(pyridinium) (DPX). Nei saggi Tb/DPA, un pool di liposomi con Tb incapsulato viene miscelato e fuso con liposomi con DPA incapsulato; al momento della fusione, la fluorescenza viene aumentata attraverso il trasferimento interno di energia da DPA a Tb all'interno del complesso [Tb(DPA)₃]^3- chelazione⁶. Al contrario, per i saggi ANTS/DPX, la fluorescenza ANTS viene spenta da DPX⁷. Mentre questi sistemi affrontano la miscelazione del contenuto interno, è necessaria una preparazione più approfondita dei liposomi per la rimozione di reagenti non incapsulati, così come l'interazione involontaria dei fluorofori.

Protocollo

1. Purificazione di GST-DAtl-His8

1. Espressione proteica e preparazione del liscia
   1. Trasformare BL21 (DE3) E. coli con il costrutto GST-DAtl-His8 in pGEX4-T3² e selezionare su una piastra di ampicillina.
   2. Selezionare un singolo trasformativo e inoculato di 5 mL di LB - ampicillina (5 -L di 100 mg/mL di ampicillina) in un tubo di coltura da 14 mL e incubare a 25 mL con agitazione a 200 rpm per 6-8 h.
      NOT: A causa dell'espressione che perde, non è consigliabile incubare a temperature più elevate. La crescita a 25 gradi centigradi riduce l'aggregazione di proteine durante questo periodo di crescita.
   3. Inoculare 200 mL di LB - ampicillina con 1 mL della coltura 5 mL e incubare durante la notte (15-18 h) a 25 gradi centigradi.
   4. La mattina successiva, raccogliere le cellule per centrifugazione (2.000 x g per 10 min) e risospendere in 5 mL di LB.
   5. Inoculato 4 L di LB - ampicillina e misura OD₆₀₀ (0,05–0,15). Incubare a 25 gradi centigradi con lo scuotimento.
      NOT: Riservare alcuni supporti per fungere da spazio vuoto per le misurazioni OD₆₀₀ prima di aggiungere batteri.
   6. Misurare OD₆₀₀ ogni ora fino a raggiungere un OD compreso tra 0,4-0,5. A questo punto, ridurre la temperatura a 16 gradi centigradi.
   7. Indurre con 0,2 mM di IPTG (800 -L di 1 M di stock), 10 min dopo che l'incubatrice raggiunge i 16 gradi centigradi. Incubare durante la notte (15–18 ore) a 16 gradi centigradi.
      NOT: La temperatura più bassa migliora la resa della proteina funzionale riducendo l'aggregazione di atlastin.
   8. La mattina successiva, raccogliere le cellule centrifugando a 7.500 x g a 4 gradi centigradi.
   9. Risospendere le celle in 200 mL di A200 (25 m HEPES (pH 7,4) e 200 mM KCl).
   10. Centrifugare le cellule a 11.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   11. Risospendere il pellet in 40 mL di rottura del buffer (A200 più 10% glicerolo, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 4% Triton X-100 (TX100), 40mMM imidazole, e un protease da cocktail tablet senza EDTA).
       NOT: Aggiungere Il TX-100 dopo aver eseguito la rimozione per evitare di generare bolle e schiuma.
   12. Passare attraverso un ago da 18 G ed eseguire le cellule attraverso un disgregatore di cellule tre volte a 10.000 dollari.
   13. Centrifugare l'estratto a 125.000 x g per 1 h.
       NOT: Facoltativamente sciogliere il pellet 1:2 (w:v) in 8 M Urea e nutate a temperatura ambiente durante la notte. Urea come denaturante dissolverà lentamente qualsiasi proteina pellettante insolubile per l'analisi SDS-PAGE. Risparmiare 1 l per l'analisi delle macchie SDS-PAGE e Coomassie.
   14. Filtrare l'estratto attraverso un filtro di membrana sterile di nitrato di cellulosa 0,45 m per rimuovere batteri e grandi detriti batterici.
       NOTA: Opzionalmente, salvare 1 L per l'analisi delle macchie SDS e Coomassie.
2. Purificazione delle proteine per fromatografia di affinità
   1. Caricare la colonna di rematografia di affinità del metallo immobilizzato (IMAC) carica con Ni^2,pre-equilibrata con buffer imidazolo basso (A100 più 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 1% TX-100, 40 mM imidazole) ad una velocità di 1 mL/ min a 4 gradi centigradi.
   2. Lavare la colonna con 25 mL di A100 più 10% glicerolo, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazolo con una velocità di 1 mL/min a 4 gradi centigradi. Eluire la proteina con un gradiente lineare di 30 mL di imidazolo da 40 mM a 500 mM e un lavaggio finale da 5 mL a 500 mM.
   3. Piscina insieme frazioni di picco e incubare per 1 h a 4 s c con perline gonfie GSH-Agarose, precedentemente gonfio in acqua ed equilibrato in A100 con 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 0.1% Anapoe X-100, e 1 mM EDTA.
      NOT: Le perle GSH-Agarose possono essere gonfie in 50 mL di acqua il giorno prima e incubate durante la notte a 4 gradi centigradi, o per 1 h a RT. Per rimuovere l'acqua e il buffer di equilibration, centrifugare in un rotore a benna oscillante a 500 x g per 1 min senza freno. Aspirare il supernatante con un ago 26 G.
   4. Pellet GSH-Agarose perline da centrifuga in un rotore secchio oscillante a 500 x g senza freno e rimuovere il supernata lisata per aspirazione con un ago 26 G.
   5. Trasferire le perline in una colonna poliprep da 10 mL e lavare cinque volte con 5 mL di tampone equilibration (A100 con 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 0.1% Anapoe X-100 e 1 mM EDTA) centrifugando a 500 x g.
   6. Eluire la proteina con 1–1,5 mL di tampone di equilibration integrato con 10 mM ridotto glutathione. Proteine elutate e congelano in azoto liquido. Le proteine possono essere conservate a -80 gradi centigradi a tempo indeterminato.
      NOT: Regolare il pH del buffer di eluizione a 7.4.
   7. Quantifica la concentrazione di proteine mediante il saggio⁹ della proteina nera di amido e valuta la purezza mediante colorazione SDS-PAGE e Coomassie.

2. Ricostituzione di Atlastin ricombinante in Liposomes

1. Produzione liposomataria con metodo di estrusione ¹⁰ del sistema
   1. Realizzare le scorte di misceladi i lipidi in cloroformio (10 mm di lipidi totali). I lipidi necessari sono 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) e 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamina rhodamine B sulfonyl) (Rh-DPPE). I liposomi dell'accettazione sono costituiti da POPC: DOPS (85:15 molare ratio) e liposomi donatori di POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 rapporto molare).
      NOT: Mentre le miscele di lipidi POPC:DOPS sono state tradizionalmente utilizzate per i saggi di miscelazione dei lipidi in vitro, le composizioni lipidiche alternative possono essere adattate per diversi scopi sperimentali. POPC: I liposomi DOPS sono molto stabili e più difficili da fondere, quindi è un sistema molto rigoroso per la fusione.
   2. Aggiungere 1 cioccol di l-z-dipalmitoyl-fosfatidylcolina (metile di colina-3H) alle miscele di lipidi al fine di determinare le concentrazioni di lipidi nei passaggi successivi mediante il conteggio dello scintillazione del liquido. Riservare almeno 8 l di questo stock.
   3. Trasferire la quantità desiderata di miscele lipidiche in tubi di vetro di selce.
   4. Asciugare le miscele lipidiche sotto un flusso delicato di gas N₂ per 10 min fino a quando non è visibile più cloroformio.
   5. Asciugare ulteriormente la pellicola lipidida in un desiccatore aspirando per 30 min.
   6. Aggiungere abbastanza A100 con 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanolo, e 1 mM EDTA alla pellicola lipidica e riportare la concentrazione a 10 mM. Risospendere la pellicola lipidida vortice leggermente per 15 min a temperatura ambiente. Si consiglia un vortice che possa ospitare tubi di vetro di selce.
   7. Congelare i lipidi idratati in azoto liquido dieci volte. Dopo aver congelato in azoto liquido, scongelare i liposomi lasciando la soluzione a temperatura ambiente per 30 s, quindi trasferire in acqua per un più veloce scongelamento. Questo ciclo di congelamento-disgelo ridurrà al minimo le vesciche multilamellar.
      ATTENZIONE: I tubi possono rompersi se contengono volumi superiori a 0,5 mL e se vengono trasferiti direttamente all'acqua di azoto liquido.
   8. Passare il lipido attraverso filtri in policarbonato con 100 nm dimensione poro 19 volte utilizzando mini-estrusore.
   9. Determinazione della concentrazione totale di lipidi dei liposomi mediante conteggio scintillante
      NOT: Alcuni lipidi possono essere lasciati in tubi di vetro e in mini-estrusore.
      1. Aggiungere 4 ll l di brodo lipidico e liposomi in 3 mL di cocktail scintillante.
      2. Misura i conteggi medi al minuto (CPMA) per scorte e liposomi. E calcola la concentrazione di liposomi con la seguente formula:
   10. Conservare i liposomi a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana. Lo stoccaggio più lungo non è raccomandato in quanto i liposomi potrebbero aggregarsi con il tempo, diminuendo l'efficienza della ricostituzione.
2. Ricostituzione mediante incorporazione assistita di detersivo in liposomi preformati
   1. Calcolare la quantità di tampone, proteine, liposomi e detergenti extra da miscelare insieme:
      1. Determinare il volume totale desiderato. Questo volume è costituito da buffer A100 con 10% glicerolo, 2 mM 2-mercaptoetanolo e 1 mM EDTA. I volumi inferiori a 250 gradi non si mescolano bene in tubi di microcentrifuga da 0,5 ml.
      2. Calcolare il volume di liposomi necessari per dare una concentrazione lipidica finale di circa 1 mM. Sottrarre il volume dal volume del buffer.
      3. Calcolare il volume di proteine necessario per dare la proteina desiderata al rapporto molare lipidico (di solito 1:400). Diminuire di conseguenza il volume del buffer.
      4. Determinare la quantità di detersivo supplementare da aggiungere per saturare i liposomi che mirano a un efficace rapporto detergenti/lipidi (R_eff) tra 0,64-0,8. Ricordatevi di considerare il detersivo che viene aggiunto con la proteina. Il (R_eff) è determinato dall'equazione D_totale è la concentrazione totale di detergenti e D_acqua è la concentrazione di detergente monomerico (0,18 mM per TX-100 e Anapoe X-100 in presenza di detergente)^{4, 11}.
   2. Mescolare le soluzioni in un tubo da 0,5 mL nel seguente ordine: tampone, detersivo, proteine e liposomi. Aggiungere rapidamente i liposomi e il vortice immediato per 5 s per omogeneizzare la miscela.
   3. Incubare la reazione in un nutator per 1 h a 4 gradi centigradi.
   4. Rendere 0,2 g/mL di polistirolo non polare adsorbente "slurry" in acqua.
      NOT: Rendere il perline adstito in polistirolo "slurry" durante il precedente l'incubazione 1 h al passo 2.2.3.
   5. Pesare 0,2 g di perline adassi di polistirolo e trasferirli in un tubo di microcentrifuga.
   6. Degas le perline aggiungendo 1 mL di metanolo al tubo e mescolare per 1 min.
   7. Aspirare il metanolo e aggiungere acqua alle perline. Lasciate che le perline si mescolino con acqua per 5 min, quindi aspirare l'acqua. Ripetere quattro volte, quindi portare il "slurry" adstibile in polistirolo a 1 ml di volume con acqua e una concentrazione finale di 0,2 g/mL.
      NOT: Perline dovrebbero ancora stabilirsi sul fondo del tubo. Se non lo fanno, degas di nuovo. Utilizzare un ago 21 G o superiore per aspirare metanolo e acqua da perline.
   8. Calcolare la quantità di perline ad assorbimento in polistirolo necessarie per assorbire tutto il detersivo in ogni campione. 1 g di perline adassorbite in polistirolo assorbe 70 mg di TX-100. Per calcolare il volume di liquami di perline di polistirolo necessari per ogni reazione, dividere il detergente totale nella reazione (passaggio 2.2.1.4) per 70 mg, quindi per la concentrazione del liquame di perline (0,2 g/mL (passaggio 2.2.7).
   9. Trasferire la quantità calcolata di liquame di perline adstituolo in polistirolo su un tubo da 0,5 mL e aspirare l'acqua.
      NOT: Tagliare la fine di una punta di 20-200 gradi per trasferire le perline, vorticare il tubo appena prima della pipiglio per risospendere le perline stabili.
   10. Aggiungere i campioni al tubo da 0,5 mL contenente perline ad assorbenti in polistirolo e incubare il campione con la faraazione per 1 h a 4 gradi centigradi.
   11. Ripetere due volte lasciando vecchie perline alle spalle e trasferendo il campione a perline fresche.
   12. Aggiungere il campione a un quarto tubo con perline fresche e incubare durante la notte (15-18 h) a 4 gradi centigradi.
3. Al mattino, rimuovere il campione dalle perle adorbente in polistirolo e gli aggregati di proteine insolubili del pellet centrifugando per 10 min a 16.000 x g a 4 gradi centigradi.
4. Recuperare il super-natante e determinare la concentrazione di lipidi finali mediante il conteggio della scintillazione liquida (vedere il passo 2.1.9.2). Facoltativamente, la concentrazione di proteine può essere determinata dal saggio proteico nero amido⁹.
   NOT: Per i proteoliposomi atlastin, i saggi enzimatici devono essere eseguiti con liposomi freschi. Un lungo accumulo a 4 gradi centigradi o il congelamento porta a perdite significative nell'attività di atlastina.

3. Lipid Mixing Saggi

1. Portare il proteoliposomi donatore e accettante a una concentrazione di 0,15 mM ciascuno in A100 con il 10% di glicerolo, 2 mM-mercaptoetanolo, 1 mM EDTA e 5 mM MgCl₂. Ogni reazione (50 ) deve essere aggiunta ad un pozzo in un pozzo bianco piatto 96 adatto per letture di fluorescenza. Prepara almeno 4 reazioni, tra cui un triplice e un controllo negativo no-GTP.
2. Collocare la piastra in un lettore di piastre preriscaldato a 37 gradi centigradi. Misurare la fluorescenza NBD (eccitazione 460 nm ed emissione 535 nm) per 5 min ogni min.
3. Indurre la fusione con l'aggiunta di 5 mM GTP (5 -L di 50 mM GTP).
4. Misurare la fluorescenza NBD ogni minuto per 1 h.
5. Aggiungete 5 L del 2,5% w/v n-Dodecyl -D-maltoside per sciogliere i proteoliposomi e misurare la fluorescenza massima di NBD. Leggere la fluorescenza NBD per 15 min ogni min ogni min.

4. Galleggiamento liposomale su Iohexol Discontinuo Gradiente¹²

1. (opzionale) Analizzare l'efficienza della ricostituzione mediante analisi di galleggiamento¹³.
2. Preparare un 80% e un 30% w/v iohexol in A100 con 10% glicerolo, 2 mM 2-mercaptoetanolo e 1 mM EDTA. Iohexol non si scioglie facilmente, quindi questo deve essere preparato un giorno prima facendo la deformazione durante la notte a 4 gradi centigradi.
3. Mescolare accuratamente 150 l di 80% di brodo iohexol con 150 l di proteoliposomi per portarlo ad un 40% iohexol. Aggiungere questo a un tubo 5 x 41 mm² Ultra-chiaro evitando bolle.
4. Strato 250 - L di 30% stock iohexol lentamente sopra il campione per fare uno strato medio. Evitare eventuali bolle e disturbare lo strato inferiore. In cima allo strato intermedio, aggiungere lentamente 50 -L di A100 con 2 mM 2-mercaptoetanolo e 1 mM EDTA.
5. Centrifugare il gradiente in un rotore a benna oscillante a 220.000 x g per 4 h a 4 gradi centigradi con accelerazione lenta e senza rottura.
6. Raccogliere gli strati del gradiente e analizzare da SDS-PAGE e Coomassie macchia, quantificazione può essere fatta da densitometria. Le proteine ricostituite dovrebbero fluttuare verso lo strato superiore, mentre gli aggregati di proteine e lipidi si sedimentano sul fondo o nello strato intermedio.

5. Analisi dell'orientamento delle proteine ricostituite dalla proteolisi da rombina

NOT: Il costrutto atlastin riportato qui ha un sito di taglio della trombina tra la fine del tag GST del terminale N e l'inizio di atlastin. Atlastin nell'orientamento corretto avrà questo sito di taglio accessibile alla proteasi, mentre le proteine con orientamento sbagliato saranno protette dal bistrato lipidico.

1. Per scandire l'orientamento proteoliposomico ad all'accorto, riservare almeno 8 l di proteoliposomi freschi ricostituiti.
2. Aggiungete 8 -L di proteoliposomi e 1 luna di 1 trombina U/L. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora.
3. Quenso la proteasi con 1 l'l di 5 mg/mL di cocktail inibitore della proteasi senza EDTA e incubare per 30 min a 37 .
4. Analizzare il campione con macchie SDS-PAGE e Coomassie. La proporzione di proteine sciolse e ziave può essere determinata dalla densitometria.

Risultati

L'efficienza della ricostituzione atlastin è presentata nella Figura 2. I proteoliposomi ricostituiti sono stati galleggianti in un gradiente discontinuo iohexol. La proteina non incorporata è stata sedimentata nello strato inferiore (B) o nello strato intermedio (M). La proteina ricostituita fluttuerebbe verso lo strato superiore (T). I campioni del gradiente sono stati raccolti e analizzati da SDS-PAGE e Coomassie colorazione. La quantificazione del gel mediante densitometria mostra un'e...

Discussione

I metodi qui delineano un metodo efficiente per purificare, riclassificare e misurare l'attività di fusione dell'atlastina ricombinante. Per garantire alte rese di atlastina funzionale alcuni passaggi critici devono essere considerati. L'espressione di atlastin deve essere fatta a basse temperature (16 ) per evitare l'aggregazione e si dovrebbe puntare a una concentrazione finale tra 0,4-1,5 mg/mL. Le proteine molto diluite non saranno ricostituite in modo ottimale a un rapporto tra 1:400 proteine e lipidi. L'efficienza...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL poly-prep chromatography columns	Biored	731-1550
10 x 75 mm Flint glass tubes	VWR	608225-402
47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters	Whatman	7141 104
96 well white plate	NUNC	437796
Anapoe X-100	Anatrace	9002-931-1
Cell disrupter	Avestin	Avestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))	Avanti	840035P-10mg	DOPS
EDTA	Research organics inc.	6381-92-6	Ethylenediaminetetraacetic acid
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001	Complete protease inhibitor
Extruder	Sigma Aldrich	Z373400	Liposofast Basic Extruder
GE Akta Prime liquid chromatography system	GE Pharmacia	8149-30-0006
Glutathione agarose beads	Sigma aldrich	G4510-50ml
Glycerol	EMD	GX0185-5
GTP	Sigma Aldrich	36051-31-7	Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate
HEPES, acid free	Omnipur	5330
Imidazole	fluka	5670
Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column	GE Healthcare	17040801	1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns
Iohexol	Accurate chemical and scientific corporation	AN 7050 BLK	Accudenz/Nycodenz
IPTG	Research products international corp.	I56000-100.0	IPTG, dioxane free
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5g
Magnesium chloride	Fisher	7791-18-6
Methanol	Omnisolv	MX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))	Avanti	236495	NBD-DPPE
n-Dodecyl β-D-maltoside	Chem-Impex International	21950
Nonpolar polystyrene adsorbent beads	BioRad	152-3920	SM2 Biobeads
Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane	Whatman	800309
Optima LE80K Ultra centrifuge	Beckman Coulter
Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H]	ARC	ART0284	Titriated lipids
Plate reader	TECAN	TECAN infinite M200 plate reader
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti	850457C-25mg	POPC
Potassium chloride	MP	151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))	Avanti	236495	Rh-DPPE
Scintillation Cocktail	National Diagnostics	LS-272	Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples
Scintillation vials	Beckman	592928	Fast turn cap Mini Poly-Q Vial
Thrombin	Sigma	T1063-1kU	Thrombin from human plasma
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm	Beckman	344090
Vortex 9 to 13mm Tube Holder	VWR	58816-138	Insert for vortexing flint glass tubes
Vortex Insert Retainer	VWR	58816-132	Retainer needed for vortex tube holder
Vortexer	VWR	2.235074	Vortex Genie 2 model G560
β-mercaptoethanol molecular biology grade	Calbiochem	444203