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摘要

开发双DNA标尺测定,以确定核糖体易位过程中的mRNA位置,该位置依赖于形成DNA-mRNA复面的解离力。具有单核苷酸分辨率和达到mRNA两端的能力,可为核糖体易位提供机械见解,并探测其他核酸位移。

摘要

核糖体易位是指在mRNA上核糖体运动,正好由三个核苷酸(nt),这是蛋白质合成的中心步骤。为了研究其机制,有两个基本的技术要求。首先是单nt分辨率,它可以解决帧移位的正常移位问题,在此期间,核糖体移动的分辨率超过 3 nt。第二种是探测mRNA的入口和出口两侧的能力,以便阐明易位的整体情况。我们报告双DNA标尺测定,该测定基于DNA-mRNA复式的关键解离力,通过力诱导的残余磁化光谱(FIRMS)获得。 使用 2-4 pN 力分辨率时,双标尺测定足以区分不同的易位步骤。通过在探测DNA上实现长链接器,它们可以到达核糖体另一侧的mRNA,从而确定双方的mRNA位置。因此,双标测定特别适合研究核糖体易位和核酸运动。我们显示了一个代表性的结果,表明环mRNA构象和解决帧移位的正常移位。

引言

生物分子位移是研究相关生物函数机理的基本参数。一个特别的例子是核糖体易位1,2,在此期间,核糖体移动正好三个核苷酸 (nt) 在信使RNA (mRNA) 正常, 和一,2,或其他数字的nt,除了三个在帧移位。因此,需要分子标尺系统单nt分辨率来区分不同的步长大小。更大的挑战是探测入口和出口侧的核糖体运动。换句话说,只有使用双标尺系统,我们才能揭示mRNA是否平滑地穿过核糖体,或者有中间步骤,其中双方具有不同的步长大小,导致在核糖体。

已经开发出几种方法来解决解决核糖体出口侧不同步骤的第一个挑战(mRNA的3'末端)。双荧光素酶测定通过测量产生的不同蛋白质3,4的比例来解决不同的阅读帧。它仅适用于 mRNA 的 3' 端,因此不足以提供易位的完整图像。质谱法可以分析不同的肽片段,作为相应代码重新排列的结果5。但它不能确定核糖体在mRNA上移动多少nt。脚趾印刷测定是另一种常见的方法,它使用在3'远端的逆转录酶将mRNA转录到核糖体6。然而,它不适用于进入核糖体的mRNA的5'结束。其他技术,包括单分子方法和荧光方法7,很难达到单nt分辨率。

我们开发了双DNA标尺测定,可以独特地确定核糖体-mRNA复合物中未发现的mRNA的入口和出口位置。 标尺DNA是DNA寡聚体,与核糖体发现的mRNA形成一定数量的碱基对(bp)的双面,无论mRNA的哪一端。然后,bp数精确地显示在易位期间mRNA上的核糖体位置。双工的bp数由它们从力引起的残余磁化光谱(FIRMS)8中获得的临界解离力决定。在 2-3 pN 力不确定的情况下,临界力足以提供单点分辨率。通过在DNA标尺上实现一个链接分子,可以探测核糖体对mRNA的消毒阻碍侧。因此,可以准确地解决不同的核糖体位移。我们已经成功地揭示了在易位9期间被抗生素捕获的mRNA的独特环状构象,并解决了在湿滑的mRNA序列10上共存的不同阅读帧。本文介绍了双标尺测定的细节,包括核糖体复合物的制备、玻璃玻片的表面功能化、核糖体复合物的固定性及其与磁性标记DNA标尺的杂交分子、磁检测和力谱分析。

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研究方案

1. 核糖体复合物的制备

  1. 制作 1,000 mL 的 TAM10 缓冲液,包括 20 mM tris-HCl (pH 7.5)、10 mM Mg (OAc) 2、30 mM NH4Cl、70 mM KCl、5 mM EDTA、7 mM BME(2-mercaptoto 乙醇)和 0.05% 补间20。
  2. 准备表1中列出的五种混合物。
    注:核糖体来自MRE600菌株11。EF-Tu:伸长系数热不稳定。EF-T:伸长系数热稳定。GTP:三磷酸三磷酸二磷酸二苯基苯基。PEP:磷(苯酚)丙酮酸盐。
  3. 在制造核糖体复合物之前,在37°C下分别孵育这五种混合物25分钟。按照表2准备五个核糖体复合物。
    注:帖子:易位后;前:预移位。
  4. 将五个核糖体复合物分别添加到 1.1 M 蔗糖垫上,容积比为 1:1。在超离心机中,用450,000 μg每点净化2小时。使用移液器去除上清液,并在使用 TAM10 缓冲液重新悬浮颗粒后,在 -80°C 恢复核糖体复合物。

2. 生物镀锡玻璃玻片的制备

  1. 玻璃玻片的初步清洁
    1. 将尺寸为 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 (L + W + T) 的 12 张玻璃玻片放入短而宽的玻璃盘中。
    2. 在玻璃盘中用丙酮和声波填充5分钟。然后用超纯水清洗幻灯片5次,将3/4的盘子注水。
    3. 加入10M KOH填充盘子,将玻璃滑梯声波20分钟。用水清洗幻灯片5次。
    4. 加入乙醇和声波5分钟,倒出乙醇,然后在300°C下分别干燥3小时。
  2. 阿米米西兰涂层
    1. 将 12 张清洁的幻灯片放回装有甲醇的玻璃盘中。用甲醇清洁PEGylation烧瓶5分钟,然后用25mL甲醇、1.25 mL水、0.125 mL HAc、0.25 mL 3-氨基丙酸二氧烷(AMEO)填充。
    2. 立即用准备好的 AMEO 溶液更换玻璃盘中的甲醇。在室温下孵育30分钟。
    3. 用水冲洗幻灯片几次,然后通过氮气净化将其干燥。将干燥的幻灯片放入干净的玻璃碗碟中。
  3. PEGlation
    1. 制备NaHCO3溶液(8.4毫克/mL)和PEGylation缓冲液(37.5毫克PEG,6毫克生物异位化PEG,150μL NaHCO3溶液)。在 6,000 rpm 转速下旋转 1 分钟,将其混合均匀。
    2. 将 25 μL 的 PEG 溶液放在每张幻灯片上。盖上另一张幻灯片。确保两个幻灯片之间没有气泡。 将幻灯片放在空移液提示盒中。确保盒子已平放,并将其放在黑暗的抽屉中约 3 小时。
    3. 用水冲洗幻灯片,然后再次晾干。将干滑片在室温下真空下存放长达 2 周。

3. 在磁力和力测量前进行样品制备

  1. 用尺寸为 4 × 3 × 2 mm3 (L × W = D) 的塑料样品进行加工。使用环氧树脂将一块生物锡涂层玻璃(长约 5 mm,从第 2 节中准备的 60 mm 长幻灯片切割)粘附在底面上。
  2. 将20μL的0.25mg/mL链球菌水溶液加入样品井中,在室温下孵育40分钟。然后用TAM10缓冲液冲洗样品两次。
  3. 固定核糖体复合物。
    1. 不使用抗生素:使用移液器从样品中去除缓冲液,然后将20μL的0.1 μM核糖体复合物(MF-Pre或MF-Post)加入样品井。核糖体复合物将通过mRNA上的5'端生物锡与表面的链球菌结合。在37°C孵育1小时,然后用TAM10缓冲液冲洗一次。
    2. 对于使用新霉素和富西丁酸的实验:用新霉素在37°C孵育MF-Pre复合物10分钟;在37°C下用富西德酸孵育EF-G20分钟。浓度如下:0.1 μM核糖体复合物、2 μM EF-G、4 mM GTP、4 mM PEP、0.02 mg/mL 丙酸激酶、0.2 mM 新霉素和0.25 mM 富西德酸。
    3. 以同样的方式进行其他抗生素实验。浓度如下:0.2 mM 维奥霉素、0.4 mM 湿霉素 B 和 0.25 mM 富西丁酸。
    4. 对于框架移位研究,重复上述步骤的MFNF-Pre和MFNF-Post复合物涉及滑图案U6A.分别使用抗生素富西酸加新霉素,和富西西酸单独。
  4. 从样品中去除缓冲液,然后加入20μL的1μM生物浸化探测DNA链,并在室温下孵育过夜。用TAM10缓冲液冲洗成型的DNA-mRNA双工一次。
  5. 从样品井中取出缓冲区。然后加入20 μL的0.5毫克/mL链球菌涂层磁珠到样品井,并在室温下孵育2小时。
  6. 小心地将样品很好地插入支架中,并将其放入离心机中。在 84 x g下离心 5 分钟,将游离磁性颗粒从表面清除。

4. 磁性和力测量

  1. 打开激光
    1. 使用钥匙打开激光。然后按电源按钮。
    2. 将锁定放大器 1 (LIA1) 的灵敏度调整到 500 mV,并等待约 2 小时以预热并稳定原子磁力计。
  2. 设置原子磁力计
    1. 运行仪器控制软件并设置测量参数。某些参数在每个测量中可能略有不同。
      注:原子磁力计包括激光(如上所述)、SR830锁定放大器(称为LIA1)、SR530锁定放大器(称为LIA2)、DS345(称为FG1)和ATF20B(称为FG2)功能发生器(高分辨率)电机和计算机。所有这些应在协议的这一步中打开。
    2. 将电机移动模式设置为"噪音",并将默认位置设置为0。按前面板上的锁定,将 LIA1 的灵敏度调整回 200 mV。
    3. 调整激光的电流和电压,并找到适当的谐振峰值和信噪电平。按前面板上的扫描。请注意,振幅/宽度比应高于 0.5,相位值应小于 5 度。如果没有,则重新执行扫描步骤。
    4. 插入LIA2的输出到激光的反馈,以锁定其频率。该放大器测量辅助钚电池的光旋转,以保持对谐振12的激光频率。状态将一直持续到测量结束。
    5. 插件功能发生器FG2以输入方波(500mVpp,100mHz)作为参考信号。方波对应于 100 pT,用于将放大器的电流输出转换为磁性信号。拔下功能生成器的插头。
    6. 将电机移动模式设置为双向,默认位置设置为 260 mm。检查温度控制器的状态,以确保原子传感器的温度正确(+37 °C)。
    7. 通过测量空样品架的信号两次来检查整个系统的稳定性。减去两条走线后,评估稳定性和噪声水平。在 30 ms 积分时间,典型噪声水平和波动应为 ±2 pT。
  3. 磁化样品
    1. 将样品轻轻放在磁化站上,让它停留 2 分钟。
      注:磁化站由永磁体(±0.5 T)和塑料垫块组成。
    2. 将样品放回样品架。使用 335.4 × g离心力去除非特有结合的磁性颗粒。
  4. 施加力后的磁性测量
    1. 使用钳子将样品加载到电机上。单击前面板上的锁定以运行程序。同时,使用钳子将其他样品装载到支架中,并将其放入离心机中。请注意,涂层玻璃侧应面向离心机的中心。
      注:使用力诱导残余磁化光谱(FIRMS)技术,在样品中的分子相互作用施加机械力后,使用原子磁力计测量样品的磁信号。在这里,分子相互作用是DNA标尺分子和核糖体复合物中的mRNA。通过增加离心速度,力会逐步增加。施加每一个力后,电机将样品转换到原子传感器,然后移回。因此,获得两个磁场配置文件,一个在正向扫描期间,另一个在向后扫描13期间。我们只使用后者来提取峰值高度,因为其信噪比更好。基于校准方波,电流 (nA) 中的峰值高度转换为磁信号振幅 (pT)。
    2. 每次测量持续约 5 分钟。当电机返回 0 时,单击前面板上的"保存"。小心地使用钳子从电机和离心机取样。使用对应于 335.4 × g的初始速度(2000 rpm,对于材料表中列出的离心机每分钟转数)。
    3. 通过将离心速度提高 100 rpm 或类似步长,交换两个样本并施加更强的力。交替过程,逐渐增加力;在10-12个数据点之后获得完整的力谱。
  5. 完成实验
    1. 完成所有计划的实验后,关闭设备,在打开设备时按相反的顺序进行。
    2. 从支架中取出样品,并将其浸入乙醇中,以便进行清洁和将来使用。在磁珠污染的情况下,用丙酮清洁样品架。
  6. 数据分析
    1. 打开 Python 分析脚本并输入所有实验数据。单击"加载方"以输入方波作为参考。然后单击"加载基线"以输入残余磁性信号作为背景。
    2. 将整体磁信号减小定义为B0。标准化每个磁性信号将B减小到B0,并将其表示为百分比。绘制百分比 (B/B0) 与离心力以获得 FIRMS 频谱。
      注:离心力F是根据磁珠m(4.6 × 10 ±15 kg)、离心速度w和离心机r半径(7.5厘米)通过方程F = mw计算的。2r. 典型的力分辨率为 2-4 pN,力范围为 15-95 pN。

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结果

图1显示了主要部件的检测方案和照片。磁探测是通过原子磁力计使用扫描方案(图1A)13实现的。样品放置在安装在直线电机上的杆上。电机将样品输送到磁屏蔽内的原子传感器,然后返回原始站点进行卸载。原子磁力计在样品扫描过程中检测磁信号,并产生信号跟踪,当样品最接近传感器时,最大信号。图 1

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讨论

在我们的双标测定中,磁珠起着两个重要的角色。首先,它们充当力传感器,因为离心力与其浮力成正比。其次,磁珠是原子磁力计探测到的信号载体,这是目前最精确的磁传感器。结合机械操作和磁检测,FIRMS技术能够基于其关键的解散力(DNA标尺的基础)解决大量的分子相互作用。双标尺测定特别适用于在易位期间探测 mRNA 的两侧。因为它是一种仅依赖于双面的形成的物理方法,它不受 mRNA 边或其他生物?...

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披露声明

作者没有报告潜在的利益冲突。

致谢

这项工作得到了美国国家卫生研究院(R01GM111452,Y.W.,S.X.)的支持。Y. W. 感谢韦尔奇基金会(E-1721)的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Styrene StripCity of IndustryMS-861
Glass slidesEvaporated Coatings60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acidMillipore SigmaA6283-500ML
3-AminopropyltriethoxysilaneUCT specialties21400088
mPEG-SVALaysan Bio154-82
Biotin-PEG-SVALaysan Bio152-84
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761-500G
Epoxy glueDevcon31345
StreptavidinThermoFisher434301
Fusidic AcidMillipore SigmaF0756-1G
Neomycin SulfateMillipore Sigma1458009
Viomycin SulfateMillipore Sigma1715000
Hygromycininvitrogen10687-010
Tris-HClMillipore SigmaT5941-100G
Magnesium acetateMillipore SigmaM5661-50G
Ammonium chlorideMillipore SigmaA9434-500G
Potassium chlorideMillipore SigmaP9333-500G
EDTAGIBCO774750
2-mercaptoethanolMillipore SigmaM6250-500ML
Tween20Millipore SigmaP1379-250ML
GTPMillipore SigmaG8877-100MG
PEPMillipore SigmaP7127-100MG
Pyruvate KinaseMillipore SigmaP1506-5KU
Sucrose Millipore SigmaS7903-5KG
Dynabeads M-280 StreptavidinThermoFisher11205D
mRNA OligoIntegrated DNA Technologies1338997275′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1574686303?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1648453703?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1574686283?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1634727053?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781303?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781313?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781323?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781333?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
CentrifugeEppendorf5427R
Micro UltracentrifugeHitachiCS150FNX
Vortex mixerVWRVM-3000
Lock-in AmplifierStanford Research SystemsSR530
Lock-in AmplifierStanford Research SystemsSR830
LaserNewportTLB-6918-D
Function generatorStanford Research SystemsDS345
Photo detectorsThorlabsDET36A

参考文献

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