Los gobernantes de ADN dual estudiarán el mecanismo de la translocación ribosoma con resolución de un solo nucleótido

Resumen

El ensayo de la regla de ADN dual se desarrolla para determinar la posición del ARNm durante la translocación ribosoma, que se basa en las fuerzas de disociación de los dúplex de ARN-ADN formados. Con la resolución de un solo nucleótido y la capacidad de llegar a ambos extremos del ARNm, puede proporcionar información mecanicista para la translocación ribosoma y sondear otros desplazamientos de ácido nucleico.

Resumen

La translocación ribosoma se refiere al movimiento ribosomal en el ARNm por exactamente tres nucleótidos (nt), que es el paso central en la síntesis de proteínas. Para investigar su mecanismo, existen dos requisitos técnicos esenciales. En primer lugar es la resolución de un solo nt que puede resolver la translocación normal del cambio de cuadro, durante el cual el ribosoma se mueve por otros 3 nt. El segundo es la capacidad de sondear los lados de entrada y salida del ARNm con el fin de dilucidar toda la imagen de la translocación. Informamos del ensayo de la regla de ADN dual que se basa en las fuerzas de disociación críticas de los dúplex de ARN-ADN, obtenidos por espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS).  Con una resolución de fuerza de 2-4 pN, el ensayo de regla dual es suficiente para distinguir diferentes pasos de translocación. Mediante la implementación de un vinculador largo en los DN de sondeo, pueden alcanzar el ARNm en el lado opuesto del ribosoma, de modo que la posición del ARNm se puede determinar para ambos lados. Por lo tanto, el ensayo de doble regla es especialmente adecuado para investigar la translocación ribosoma, y el movimiento del ácido nucleico en general. Mostramos resultados representativos que indicaban una conformación de ARNm en bucle y resolvieron la translocación normal del cambio de trama.

Introducción

El desplazamiento biomolecular es un parámetro fundamental en el estudio del mecanismo de las funciones biológicas relacionadas. Un ejemplo particular es la translocación ribosoma^1,2, durante la cual el ribosoma se mueve exactamente por tres nucleótidos (nt) en el ARN mensajero (arNM) normalmente, y por uno, dos u otros números de nt excepto tres en el caso de cambio de marco. Por lo tanto, se requiere una resolución de un solo nt del sistema de reglas moleculares para distinguir los diferentes tamaños de paso. Un desafío mayor es sondear el movimiento ribosoma tanto en el lado de entrada como en el de salida. En otras palabras, sólo con un sistema de doble regla podremos revelar si el ARNm se enhebra suavemente a través del ribosoma, o hay pasos intermedios en los que los dos lados tienen diferentes tamaños de paso que conducen a una conformación de ARNm torcido o en bucle dentro de la Ribosoma.

Se han desarrollado varios métodos para abordar el primer reto de resolver diferentes pasos en el lado de salida del ribosoma (el extremo de 3' del ARNm). El ensayo de doble luciferasa resuelve los diferentes marcos de lectura midiendo las proporciones de las diferentes proteínas resultantes^3,4. Sólo es aplicable para el extremo de 3' del ARNm y, por lo tanto, insuficiente para proporcionar una imagen completa de la translocación. La espectrometría de masas puede analizar los diferentes fragmentos de péptidos como consecuencia de los correspondientes reordenamientos de código⁵. Pero no puede identificar cuántos movimientos ribosomas en el ARNm. El ensayo de impresión de dedos de los dedos es otro método común que utiliza una transcriptasa inversa cebada en el extremo distal de 3'para transcribir el ARNm hacia el ribosoma⁶. Sin embargo, no es aplicable para el extremo de 5' de ARNm que está entrando en el ribosoma. Otras técnicas, incluyendo enfoques de molécula única y métodos de fluorescencia⁷, son difíciles de lograr una resolución de un solo nt.

Hemos desarrollado el ensayo de la regla de ADN dual que puede determinar de manera única las posiciones de entrada y salida del ARNm descubierto en los complejos ribosoma-mRNA.  Los DN a la regla son oligómeros de ADN que forman dúplex de ciertos números de pares de bases (bp) con el ARNm descubierto por el ribosoma, independientemente de qué extremo del ARNm. Los números bp revelan con precisión la posición ribosoma en el ARNm durante la translocación. Los números bp de los dúplex están determinados por sus fuerzas de disociación crítica obtenidas a partir de la espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS)⁸. Con una incertidumbre de fuerza de 2-3 pN, las fuerzas críticas son suficientes para ofrecer una resolución de un solo nt. Mediante la implementación de una molécula de vinculador en las reglas de ADN, el lado esterrámico obstaculizado del ARNm por el ribosoma puede ser sondeado. Por lo tanto, se pueden resolver con precisión los diferentes desplazamientos ribosomales. Hemos revelado con éxito una conformación única en bucle de ARNm atrapado por antibióticos durante la translocación^9,y resuelto diferentes marcos de lectura que coexistían en una secuencia de ARNm resbaladizo^10. Este artículo describe los detalles del ensayo de doble regla, que incluyen la preparación de los complejos ribosomas, la funcionalización superficial de los portaobjetos de vidrio, la inmovilización de los complejos ribosomas y su hibridación con la regla de ADN etiquetada magnéticamente moléculas, detección magnética y análisis del espectro de fuerza por PARTE de FIRMS.

Protocolo

1. Preparación de los complejos ribosomas

1. Hacer 1.000 mL de tam10 buffer, que consiste en 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)₂, 30 mM NH₄Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-mercaptoetanol), y 0.05% Tween20.
2. Preparar las cinco mezclas enumeradas en la Tabla1.
   NOTA: El ribosoma era de la cepa MRE600¹¹. EF-Tu: factor de alargamiento termo inestable. EF-Ts: factor de alargamiento termo estable. GTP: trifosfato de guanosina. PEP: fosfo(enol)piruvato.
3. Incubar las cinco mezclas por separado a 37 oC durante 25 minutos antes de hacer los complejos ribosomas. Preparar los cinco complejos ribosomas según la Tabla2.
   NOTA: Publicar: post-translocación; Pre: pre-translocación.
4. Añade cada uno de los cinco complejos ribosomas a un cojín de sacarosa de 1,1 M por separado, con una relación de volumen 1:1. Purificar cada uno con 450.000 g durante 2 h en una ultracentrífuga. Utilice un pipeta para eliminar el sobrenadante y restaurar los complejos ribosomas a -80 oC después de la resuspensión del pellet con tam10 buffer.

2. Preparación de portaobjetos de vidrio recubiertos de biotina

1. Limpieza preliminar de los portaobjetos de vidrio
   1. Coloque 12 diapositivas de vidrio con dimensiones de 60,0 x 4,0 x 0,3 mm³ (L a W a T) en un plato de vidrio corto y ancho.
   2. Llene el plato de vidrio con acetona y sonicar durante 5 min. Luego lave los portaobjetos con agua ultrapura 5 veces y llene 3/4 del plato con agua.
   3. Añadir 10 M KOH para llenar el plato y sonicar los portaobjetos de vidrio durante 20 minutos.
   4. Añadir etanol y sonicar durante 5 min, verter el etanol y luego secarlos por separado a 300 oC durante 3 h.
2. Recubrimiento aminosilano
   1. Coloque los 12 portaobjetos limpios de nuevo en el plato de vidrio que contiene metanol. Limpie un matraz de PEGylation con metanol sonicando durante 5 min, luego llénelo con 25 mL de metanol, 1,25 ml de agua, 0,125 ml de HAc, 0,25 ml 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
   2. Sustituya inmediatamente el metanol en la placa de vidrio por la solución AMEO preparada. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Enjuague los portaobjetos con agua varias veces y luego séquelos con purga de nitrógeno. Coloque los toboganes secos en platos de vidrio limpios.
3. PEGlation
   1. Preparar la solución de NaHCO₃ (8,4 mg/ml) y el tampón de PEGylation (37,5 mg de PEG, 6 mg de PEG biotinilado, solución de NaHCO₃ de 150 l). Mezclar bien girando a 6.000 rpm durante 1 min.
   2. Coloque 25 sl de solución peg en cada diapositiva. Cúbralo con la otra diapositiva en la parte superior. Asegúrese de que no haya burbujas entre las dos diapositivas.  Coloque las diapositivas en una caja de punta de pipeta vacía. Asegúrese de que la caja esté nivelada y colóquela en un cajón oscuro durante aproximadamente 3 h.
   3. Enjuague los portaobjetos con agua y vuelva a secarlos. Almacene los portaobjetos secos a temperatura ambiente al vacío durante un máximo de 2 semanas.

3. Preparación de muestras antes de las mediciones magnéticas y de fuerza

1. Mecanizar un pozo de muestra de plástico con dimensiones de 4 x 3 x 2 mm³ (L a An. a D). Pegue una pieza de vidrio recubierto de biotina (aproximadamente 5 mm de largo, cortada de los portaobjetos de 60 mm de largo preparados en la sección 2) en la superficie inferior utilizando epoxi.
2. Añadir 20 ml de solución acuosa de estreptavidina de 0,25 mg/ml en el pozo de la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 40 min. A continuación, enjuague bien la muestra dos veces con tam₁₀ buffer.
3. Inmovilizar los complejos ribosomas.
   1. Sin antibióticos: Utilice una pipeta para extraer el tampón de la muestra bien, luego agregue 20 s de complejo ribosoma de 0,1 m (MF-Pre o MF-Post) en el pozo de la muestra. El complejo ribosoma se unirá con la estreptavidina en la superficie a través de la biotina de 5'-end en el ARNm. Incubar a 37oC durante 1 h y luego enjuagar una vez con TAM₁₀ buffer.
   2. Para el experimento con neomicina y ácido fusídico: incubar el complejo MF-Pre con neomicina a 37 oC durante 10 min; incubar EF-G con ácido fusídico a 37oC durante 20 min. Las concentraciones son las siguientes: complejo ribosoma de 0,1 M, EF-G de 2 M, GTP de 4 mM, PEP de 4 mM, 0,02 mg/ml de piruvato quinuvato, 0,2 mM de neomicina y ácido fusídico de 0,25 mM.
   3. Llevar a cabo los otros experimentos de antibióticos de manera similar. Las concentraciones son las siguientes: 0,2 mM de viomicina, 0,4 mM de higromicina B y 0,25 mM de ácido fusídico.
   4. Para el estudio de cambio de cuadro, repita los pasos anteriores para los complejos MFNF-Pre y MFNF-Post que implican el motivo resbaladizo U₆A. Use antibióticos ácido fusídico más neomicina, y ácido fusídico solo, respectivamente.
4. Retire el tampón de la muestra bien, luego agregue 20 s l de cadena de ADN de sondeo biotintilado de 1 M e incubar a temperatura ambiente durante la noche. Enjuague el dúplex DNA-mRNA formado una vez con tam tampón TAM_10.
5. Quite el búfer del pozo de muestra. A continuación, añadir 20 sL de 0,5 mg/ml de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en el pozo de la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 2 horas.
6. Inserte cuidadosamente la muestra bien en un soporte y colóquela en una centrífuga. Retire las partículas magnéticas libres de la superficie centrifugando a 84 x g durante 5 min.

4. Mediciones magnéticas y de fuerza

1. Encendiendo el láser
   1. Encienda el láser con la tecla . A continuación, pulse el botón de encendido.
   2. Ajuste la sensibilidad del amplificador de bloqueo 1 (LIA1) a 500 mV y espere aproximadamente 2 h para calentar y estabilizar el magnetómetro atómico.
2. Configuración del magnetómetro atómico
   1. Ejecute el software de control de instrumentos y configure los parámetros de medición. Algunos parámetros pueden variar ligeramente en cada medición.
      NOTA: El magnetómetro atómico comprende un láser (descrito anteriormente), un amplificador de bloqueo SR830 (denominado LIA1), un amplificador de bloqueo SR530 (denominado LIA2), DS345 (denominado FG1) y ATF20B (denominado FG2), un generador de funciones de alta resolución motor y una computadora. Todos estos deben estar activados en este paso del protocolo.
   2. Configure el modo de movimiento del motor en Ruido y la posición predeterminada en 0. Pulse Bloquear en el panel frontal, ajuste la sensibilidad de LIA1 a 200 mV.
   3. Ajuste la corriente y el voltaje del láser y encuentre el pico de resonancia adecuado y el nivel de señal a ruido. Pulse Barrido en el panel frontal. Tenga en cuenta que la relación amplitud/ancho debe estar por encima de 0,5 y el valor de fase debe ser inferior a 5 grados. Si no es así, vuelva a realizar el paso de barrido.
   4. Plug-in de la salida de LIA2 a la retroalimentación del láser para bloquear su frecuencia. Este amplificador mide la rotación óptica de una célula de cesio auxiliar para mantener la frecuencia del láser en la resonancia^12. El estado permanece hasta el final de la medición.
   5. Generador de función plug-in FG2 para introducir una onda cuadrada (500 mVpp, 100 mHz) como señal de referencia. La onda cuadrada corresponde a 100 pT y se utiliza para convertir la salida de corriente del amplificador en señal magnética. Desconecte el generador de funciones.
   6. Configure el modo de movimiento del motor en posición bidireccional y predeterminada a 260 mm. Compruebe el estado del controlador de temperatura para garantizar la temperatura adecuada (37 oC) del sensor atómico.
   7. Compruebe la estabilidad de todo el sistema midiendo las señales del portamuestras vacío dos veces. Evalúe la estabilidad y el nivel de ruido después de restar las dos trazas. El nivel de ruido y la fluctuación típicos deben ser de 2 pT a 30 ms de tiempo de integración.
3. Magnetización de la muestra
   1. Coloque suavemente la muestra en la estación de magnetización y déjela permanecer durante 2 minutos.
      NOTA: La estación de magnetización consta de un imán permanente (0,5 T) y un espaciador de plástico.
   2. Vuelva a colocar la muestra en el soporte de la muestra. Utilice una fuerza centrífuga de 335,4 g para eliminar las partículas magnéticas no específicamente unidas.
4. Mediciones magnéticas después de aplicar fuerzas
   1. Utilice pinzas para cargar la muestra en el motor. Haga clic en Bloquear en el panel frontal para ejecutar el programa. Mientras tanto, utilice pinzas para cargar la otra muestra en el soporte y colóquela en la centrífuga. Tenga en cuenta que el lado de vidrio recubierto debe estar frente al centro de la centrífuga.
      NOTA: Se utiliza la técnica de espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS), que utiliza un magnetómetro atómico para medir la señal magnética de la muestra después de aplicar la fuerza mecánica en las interacciones moleculares en la muestra. Aquí, las interacciones moleculares son entre las moléculas de la regla de ADN y el ARNm en el complejo ribosoma. La fuerza se incrementa escalonadamente aumentando la velocidad centrífuga. Después de aplicar cada fuerza, el motor traduce la muestra al sensor atómico y luego se mueve hacia atrás. Por lo tanto, se obtienen dos perfiles de campo magnético, uno durante la exploración hacia adelante y el otro durante la exploración hacia atrás¹³. Sólo usamos este último para extraer la altura máxima debido a su mejor relación señal-ruido. La altura máxima en corriente (nA) se convierte en amplitud de señal magnética (pT) basada en la onda cuadrada de calibración.
   2. Cada medición dura aproximadamente 5 min. Cuando el motor vuelva a 0, haga clic en Guardar en el panel frontal. Utilice cuidadosamente pinzas para tomar muestras del motor y la centrífuga. Utilice la velocidad inicial correspondiente a 335,4 g (2000 rpm, revolución por minuto para la centrífuga enumerada en la Tabla de Materiales).
   3. Intercambie las dos muestras y aplique una fuerza más fuerte aumentando la velocidad centrífuga en 100 rpm o un tamaño de paso similar. Proceso alternativamente para aumentar gradualmente la fuerza; se obtiene un espectro de fuerza completo después de 10-12 puntos de datos.
5. Terminar el experimento
   1. Cuando se hayan terminado todos los experimentos planificados, apague el equipo, procediendo en el orden opuesto a medida que se activaba.
   2. Retire las muestras del soporte y sumerjalas en etanol para su limpieza y uso futuro. Limpie el soporte de la muestra con acetona en caso de contaminación por perlas magnéticas.
6. Análisis de datos
   1. Abra la secuencia de comandos de análisis de Python e introduzca todos los datos experimentales. Haga clic en Cargar cuadrado para introducir la onda cuadrada como referencia. A continuación, haga clic en Cargar línea base para introducir la señal magnética residual como fondo.
   2. Defina la disminución general de la señal magnética como B₀. Normalizar cada señal magnética disminuir B a B₀ y expresarla como un porcentaje. Trazar el porcentaje (B/B₀₎frente a la fuerza centrífuga para obtener el espectro FIRMS.
      NOTA: La fuerza centrífuga F se calcula a partir de la masa boyante de las perlas magnéticas m (4,6 x 10^{x 15} kg), la velocidad centrífuga w, y el radio de la centrífuga r (7,5 cm aquí) a través de la ecuación F a mw ² r. La resolución de fuerza típica es de 2-4 pN y el rango de fuerza es de 15-95 pN en este trabajo.

Resultados

La Figura 1 muestra el esquema de detección y las fotografías de los componentes principales. La detección magnética se logra mediante un magnetómetro atómico utilizando el esquema de escaneo (Figura1A)¹³. La muestra se coloca en una varilla montada en un motor lineal. El motor transporta la muestra al sensor atómico dentro de un escudo magnético, y luego de vuelta al sitio original para su descarga. El magnetóme...

Discusión

En nuestro ensayo de doble regla, las cuentas magnéticas desempeñan dos papeles esenciales. En primer lugar, sirven como transductores de fuerza porque la fuerza centrífuga es proporcional a su masa boyante. En segundo lugar, las perlas son portadoras de señal detectadas por un magnetómetro atómico, que actualmente es el sensor magnético más preciso. Combinando la manipulación mecánica y la detección magnética, la técnica FIRMS es capaz de resolver un gran número de interacciones moleculares basadas en sus ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Styrene Strip	City of Industry	MS-861
Glass slides	Evaporated Coatings		60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid	Millipore Sigma	A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane	UCT specialties	21400088
mPEG-SVA	Laysan Bio	154-82
Biotin-PEG-SVA	Laysan Bio	152-84
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761-500G
Epoxy glue	Devcon	31345
Streptavidin	ThermoFisher	434301
Fusidic Acid	Millipore Sigma	F0756-1G
Neomycin Sulfate	Millipore Sigma	1458009
Viomycin Sulfate	Millipore Sigma	1715000
Hygromycin	invitrogen	10687-010
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941-100G
Magnesium acetate	Millipore Sigma	M5661-50G
Ammonium chloride	Millipore Sigma	A9434-500G
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9333-500G
EDTA	GIBCO	774750
2-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-500ML
Tween20	Millipore Sigma	P1379-250ML
GTP	Millipore Sigma	G8877-100MG
PEP	Millipore Sigma	P7127-100MG
Pyruvate Kinase	Millipore Sigma	P1506-5KU
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin	ThermoFisher	11205D
mRNA Oligo	Integrated DNA Technologies	133899727	5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468630	3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	164845370	3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468628	3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	163472705	3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678130	3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678131	3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678132	3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678133	3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
Centrifuge	Eppendorf	5427R
Micro Ultracentrifuge	Hitachi	CS150FNX
Vortex mixer	VWR	VM-3000
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR530
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR830
Laser	Newport	TLB-6918-D
Function generator	Stanford Research Systems	DS345
Photo detectors	Thorlabs	DET36A