Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

Zusammenfassung

Dual DNA Lineal Assay wird entwickelt, um die mRNA-Position während der ribosomen Translokation zu bestimmen, die auf den Dissoziationskräften der gebildeten DNA-mRNA-Duplexe beruht. Mit einer Single-Nukleotid-Auflösung und der Fähigkeit, beide Enden der mRNA zu erreichen, kann es mechanistische Einblicke für ribosome translokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen.

Zusammenfassung

Die Ribosomentranslokation bezieht sich auf die ribosomale Bewegung auf der mRNA durch genau drei Nukleotide (nt), was der zentrale Schritt in der Proteinsynthese ist. Um seinen Mechanismus zu untersuchen, gibt es zwei wesentliche technische Anforderungen. Die erste ist die Single-nt-Auflösung, die die normale Translokation von Frameshifting auflösen kann, während der sich das Ribosom um andere als 3 nt bewegt. Die zweite ist die Fähigkeit, sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA zu untersuchen, um das gesamtbildende Translokation zu erläutern. Wir berichten über den dualen DNA-Lineal-Assay, der auf den kritischen Dissoziationskräften von DNA-mRNA-Duplexen basiert, die durch kraftinduzierte Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS) gewonnen werden.  Mit einer Kraftauflösung von 2-4 pN reicht der Dual-Lineal-Assay aus, um verschiedene Translokationsschritte zu unterscheiden. Durch die Implementierung eines langen Linkers auf den prüfenden DNAs können sie die mRNA auf der gegenüberliegenden Seite des Ribosoms erreichen, so dass die mRNA-Position für beide Seiten bestimmt werden kann. Daher ist der Dual-Lineal-Assay einzigartig geeignet, um die ribosomsome Translokation und Nukleinsäurebewegung im Allgemeinen zu untersuchen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse, die auf eine geschleifte mRNA-Konformation hindeuteten und die normale Translokation von Frameshifting auflösten.

Einleitung

Biomolekulare Verschiebung ist ein grundlegender Parameter bei der Untersuchung des Mechanismus der zugehörigen biologischen Funktionen. Ein besonderes Beispiel ist die Ribosomtranslokation^1,2, bei der sich das Ribosom normalerweise um genau drei Nukleotide (nt) auf der Boten-RNA (mRNA) bewegt, und um eine, zwei oder andere Nt-Zahlen außer drei im Falle von Frameshifting. Daher ist eine einstellige Auflösung des molekularen Linealsystems erforderlich, um die verschiedenen Schrittgrößen zu unterscheiden. Eine größere Herausforderung besteht darin, die Ribosombewegung sowohl auf der Ein- als auch auf der Ausgangsseite zu untersuchen. Mit anderen Worten, nur mit einem Dual-Lineal-System können wir zeigen, ob die mRNA glatt durch das Ribosom gefädelt ist, oder es gibt Zwischenschritte, in denen die beiden Seiten unterschiedliche Schrittgrößen haben, die zu einer geknickten oder geschleiften mRNA-Konformation im Inneren des Ribosom.

Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die erste Herausforderung der Lösung verschiedener Schritte auf der Austrittsseite des Ribosoms (das 3' Ende der mRNA) zu bewältigen. Der duale Luziferase-Assay löst die verschiedenen Leserahmen auf, indem er die Verhältnisse der resultierenden verschiedenen Proteine^3,4misst. Sie gilt nur für das 3' Ende der mRNA und reicht daher nicht aus, um ein vollständiges Bild der Translokation zu liefern. Die Massenspektrometrie kann die verschiedenen Peptidfragmente als Folge der entsprechenden Codeumlagerungen analysieren⁵. Aber es kann nicht genau bestimmen, wie viele nt das Ribosom auf der mRNA bewegt. Der Zehendruck-Assay ist eine weitere gängige Methode, die eine Reverse-Transkriptase verwendet, die am 3'-distalen Ende grundiert ist, um die mRNA in Richtung des Ribosoms⁶zu transkribieren. Es gilt jedoch nicht für das 5' Ende von mRNA, das in das Ribosom eintritt. Andere Techniken, einschließlich Einzelmolekülansätze und Fluoreszenzmethoden⁷, sind schwierig, eine Single-nt-Auflösung zu erreichen.

Wir haben den Dual-DNA-Lineal-Assay entwickelt, der sowohl die Ein- als auch die Ausgangsposition der freigelegten mRNA in Ribosome-mRNA-Komplexen eindeutig bestimmen kann.  Die Lineal-DNAs sind DNA-Oligomere, die Duplexe einer bestimmten Anzahl von Basepairs (bp) bilden, wobei die mRNA vom Ribosom aufgedeckt wird, unabhängig davon, welches Ende der mRNA. Die bp-Zahlen zeigen dann genau die ribosomische Position auf der mRNA während der Translokation. Die bp-Nummern der Duplexe werden durch ihre kritischen Dissoziationskräfte bestimmt, die aus der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS)⁸gewonnen werden. Bei 2-3 pN-Kraftunsicherheit reichen die kritischen Kräfte aus, um eine Single-nt-Auflösung zu bieten. Durch die Implementierung eines Linkermoleküls auf den DNA-Linealen kann die sterisch behinderte Seite der mRNA durch das Ribosom untersucht werden. So lassen sich unterschiedliche ribosomale Verschiebungen genau auflösen. Wir haben erfolgreich eine einzigartige Schleifenkonformation von mRNA aufgedeckt, die von Antibiotika während der Translokation⁹eingeschlossen wurde, und verschiedene Leserahmen aufgelöst, die auf einer rutschigen mRNA-Sequenz¹⁰koexistierten. Dieser Artikel beschreibt die Details des Dual-Lineals-Assays, zu denen die Vorbereitung der Ribosom-Komplexe, die Oberflächenfunktionalisierung der Glasgeuken, die Immobilisierung der Ribosom-Komplexe und deren Hybridisierung mit magnetisch beschrifteten DNA-Linealen gehören. Moleküle, magnetische Detektion und Kraftspektrumanalyse durch FIRMS.

Protokoll

1. Vorbereitung der Ribosom-Komplexe

1. Machen Sie 1.000 ml TAM10 Puffer, der aus 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)₂, 30 mM NH₄Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-Mercaptoethanol) und 0,05% Tween20 besteht.
2. Bereiten Sie die fünf in Tabelle 1aufgeführten Mischungen vor.
   HINWEIS: Das Ribosom stammt e.b. vom MRE600-Stamm¹¹. EF-Tu: Dehnungsfaktor thermo instabil. EF-Ts: Dehnungsfaktor thermostabil. GTP: Guanosintriphosphat. PEP: Phospho(enol)pyruvat.
3. Die fünf Mischungen bei 37 °C für 25 min separat inkubieren, bevor die Ribosom-Komplexe entstehen. Bereiten Sie die fünf Ribosom-Komplexe gemäß Tabelle 2vor.
   HINWEIS: Post: Post-Translocation; Pre: Vortranslokation.
4. Fügen Sie jeden der fünf Ribosom-Komplexe separat auf ein 1,1 M Saccharosekissen mit einem Volumenverhältnis von 1:1 ein. Reinigen Sie jeweils mit 450.000 g für 2 h in einer Ultrazentrifuge. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen und die Ribosom-Komplexe bei -80 °C nach Wiederaufhängung des Pellets mit TAM10-Puffer wiederherzustellen.

2. Herstellung von biotinbeschichteten Glasgletten

1. Vorreinigung der Glasrutschen
   1. Legen Sie 12 Glasschieber mit den Abmessungen 60,0 x 4,0 x 0,3 mm³ (L x W x T) in eine kurze und breite Glasschale.
   2. Füllen Sie die Glasschale mit Aceton und beschallen Sie für 5 min. Dann waschen Sie die Rutschen mit Reinstwasser 5 Mal und füllen Sie 3/4 der Schale mit Wasser.
   3. Fügen Sie 10 M KOH hinzu, um die Schale zu füllen und die Glasgletten für 20 min zu beschallen. Waschen Sie die Dias 5 Mal mit Wasser.
   4. Ethanol hinzufügen und 5 min beschallen, das Ethanol ausgießen und dann bei 300 °C für 3 h separat trocknen.
2. Aminosilan-Beschichtung
   1. Die 12 gereinigten Rutschen wieder in die Glasschale mit Methanol legen. Reinigen Sie einen PEGylationskolben mit Methanol, indem Sie ihn 5 min beschallen, dann mit 25 ml Methanol, 1,25 ml Wasser, 0,125 ml HAc, 0,25 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan (AMEO) füllen.
   2. Ersetzen Sie das Methanol in der Glasschale sofort durch die vorbereitete AMEO-Lösung. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
   3. Spülen Sie die Rutschen mehrmals mit Wasser ab und trocknen Sie sie dann durch Stickstoffspülung. Legen Sie die getrockneten Dias in saubere Glasschalen.
3. PEGlation
   1. Bereiten Sie NaHCO₃ Lösung (8,4 mg/ml) und PEGylationspuffer (37,5 mg PEG, 6 mg biotinylierte PEG, 150 l NaHCO₃ Lösung). Mischen Sie sie gut, indem Sie bei 6.000 U/min für 1 min drehen.
   2. Legen Sie 25 L der PEG-Lösung auf jeden Schlitten. Bedecken Sie es mit der anderen Folie oben. Stellen Sie sicher, dass sich zwischen den beiden Folien keine Blasen befinden.  Platzieren Sie die Dias in einem leeren Pipetten-Spitzenkasten. Stellen Sie sicher, dass die Box nivelliert ist und legen Sie sie in eine dunkle Schublade für ca. 3 h.
   3. Spülen Sie die Rutschen mit Wasser und trocknen Sie wieder. Bewahren Sie die getrockneten Dias bei Raumtemperatur unter Vakuum bis zu 2 Wochen auf.

3. Probenvorbereitung vor Magnet- und Kraftmessungen

1. Maschine eine Kunststoffprobe gut mit den Abmessungen 4 x 3 x 2 mm³ (L x W x D). Mit Epoxid kleben Sie ein Stück biotinbeschichtetes Glas (ca. 5 mm lang, aus den 60 mm langen Dias in Abschnitt 2) auf die Bodenoberfläche schneiden.
2. Fügen Sie 20 l 0,25 mg/ml Streptavidin wässrige Lösung gut in die Probe geben und bei Raumtemperatur für 40 min inkubieren. Dann spülen Sie die Probe gut zweimal mit TAM₁₀ Puffer.
3. Immobilisieren Sie die Ribosom-Komplexe.
   1. Ohne Antibiotika: Verwenden Sie eine Pipette, um Puffer aus der Probe gut zu entfernen, und fügen Sie dann 20 L von 0,1 M Ribosom-Komplex (MF-Pre oder MF-Post) in die Probe gut. Der Ribosom-Komplex bindet mit dem Streptavidin an der Oberfläche über das 5'-Ende-Biotin auf der mRNA. Bei 37 °C für 1 h inkubieren und dann einmal mit TAM₁₀ Puffer ausspülen.
   2. Für das Experiment mit Neomycin und Fusidinsäure: inkubieren Sie den MF-Pre-Komplex mit Neomycin bei 37 °C für 10 min; EF-G mit Fusidinsäure bei 37 °C für 20 min inkubieren. Die Konzentrationen sind wie folgt: 0,1 m Ribosom-Komplex, 2 M EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/ml Pyruvatkinase, 0,2 mM Neomycin und 0,25 mM Fusidinsäure.
   3. Führen Sie die anderen Antibiotika-Experimente ähnlich durch. Die Konzentrationen sind wie folgt: 0,2 mM Viomycin, 0,4 mM Hygromycin B und 0,25 mM Fusidinsäure.
   4. Für Frameshifting-Studie, wiederholen Sie die oben genannten Schritte für die MFNF-Pre und MFNF-Post-Komplexe mit dem rutschigen Motiv U₆A. Verwenden Sie Antibiotika Fusidinsäure plus Neomycin, und Fusidinsäure jeweils
4. Puffer aus der Probe gut entfernen, dann 20 L von 1 'M biotinylierten DNA-Strang hinzufügen und bei Raumtemperatur über Nacht inkubieren. Spülen Sie das gebildete DNA-mRNA-Duplex einmal mit TAM₁₀ Puffer.
5. Entfernen Sie den Puffer aus dem Sample-Brunnen. Dann 20 l von 0,5 mg/ml streptavidin-beschichteten Magnetperlen gut in die Probe geben und bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren.
6. Die Probe vorsichtig gut in einen Halter einlegen und in eine Zentrifuge legen. Entfernen Sie die freien magnetischen Partikel von der Oberfläche durch Zentrifugieren bei 84 x g für 5 min.

4. Magnet- und Kraftmessungen

1. Einschalten des Lasers
   1. Schalten Sie den Laser mit der Taste ein. Drücken Sie dann die Ein-/Aus-Taste.
   2. Stellen Sie die Empfindlichkeit des Einsperrverstärkers 1 (LIA1) auf 500 mV ein und warten Sie etwa 2 h, um das Atommagnetometer aufzuwärmen und zu stabilisieren.
2. Einrichten des Atommagnetometers
   1. Führen Sie die Gerätesteuerungssoftware aus und richten Sie die Messparameter ein. Einige Parameter können in jeder Messung leicht variieren.
      ANMERKUNG: Das Atommagnetometer besteht aus einem Laser (siehe oben), einem SR830-Sperrverstärker (als LIA1), einem SR530-Sperrverstärker (als LIA2 bezeichnet), DS345 (bezeichnet als FG1) und ATF20B (als FG2 bezeichnet), Motor und einem Computer. All diese Sollten in diesem Schritt des Protokolls aktiviert werden.
   2. Richten Sie den Motorbewegungsmodus auf Rauschen und die Standardposition auf 0ein. Drücken Sie Lock auf der Frontplatte, stellen Sie die Empfindlichkeit von LIA1 wieder auf 200 mV ein.
   3. Stellen Sie strom und spannungsfrei den Laser ein und finden Sie die richtige Resonanzspitze und den Signal-Rausch-Pegel. Drücken Sie Sweep auf der Frontplatte. Beachten Sie, dass das Amplituden-Breite-Verhältnis über 0,5 und der Phasenwert kleiner als 5 Grad sein sollte. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie den Sweep-Schritt.
   4. Schließen Sie den Ausgang von LIA2 an das Feedback des Lasers an, um seine Frequenz zu sperren. Dieser Verstärker misst die optische Rotation einer Hilfs-Cäsiumzelle, um die Laserfrequenz auf Resonanz¹²beizubehalten. Der Zustand bleibt bis zum Ende der Messung.
   5. Plug-in-Funktionsgenerator FG2 zur Eingabe einer Rechteckwelle (500 mVpp, 100 mHz) als Referenzsignal. Die rechteckige Welle entspricht 100 pT und wird verwendet, um den Stromausgang des Verstärkers in magnetisches Signal umzuwandeln. Trennen Sie den Funktionsgenerator.
   6. Richten Sie den Motorbewegungsmodus auf Zwei-Wege- und Standardposition auf 260 mm ein. Überprüfen Sie den Status des Temperaturreglers, um die richtige Temperatur (ca. 37 °C) des Atomsensors zu gewährleisten.
   7. Überprüfen Sie die Stabilität des gesamten Systems, indem Sie die Signale des leeren Probenhalters zweimal messen. Bewerten Sie Stabilität und Geräuschpegel, nachdem Sie die beiden Spuren subtrahiert haben. Typischer Geräuschpegel und Fluktuation sollten bei 30 ms Integrationszeit 2 pT betragen.
3. Magnetisierung der Probe
   1. Legen Sie die Probe vorsichtig auf die Magnetisierungsstation und lassen Sie sie 2 min bleiben.
      HINWEIS: Die Magnetisierungsstation besteht aus einem Permanentmagneten (0,5 T) und einem Kunststoffabstandhalter.
   2. Legen Sie die Probe wieder in den Probenhalter. Verwenden Sie 335,4 g Zentrifugalkraft, um die nicht spezifisch gebundenen magnetischen Partikel zu entfernen.
4. Magnetische Messungen nach Demanwendung von Kräften
   1. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Probe auf den Motor zu laden. Klicken Sie auf der Vorderseite auf Sperren, um das Programm auszuführen. In der Zwischenzeit verwenden Pinzette, um die andere Probe in den Halter zu laden und legen Sie es in der Zentrifuge. Beachten Sie, dass die beschichtete Glasseite der Mitte der Zentrifuge gegenüberstehen sollte.
      HINWEIS: Es wird die Technik der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS) verwendet, die ein atomares Magnetometer verwendet, um das magnetische Signal der Probe zu messen, nachdem mechanische Kraft auf die molekularen Wechselwirkungen in der Probe angewendet wurde. Hier liegen die molekularen Wechselwirkungen zwischen den DNA-Linealmolekülen und der mRNA im Ribosom-Komplex. Die Kraft wird schrittweise erhöht, indem die Fliehkrafterhöht wird. Nach dem Anwenden jeder Kraft übersetzt der Motor die Probe in den Atomsensor und bewegt sich dann zurück. Somit werden zwei Magnetfeldprofile erhalten, eines während des Vorwärtsscans und das andere beim Rückwärtsscan¹³. Letzteres verwenden wir nur, um die Spitzenhöhe aufgrund seines besseren Signal-Rausch-Verhältnisses zu extrahieren. Die Spitzenhöhe im Strom (nA) wird basierend auf der Kalibrierquadratwelle in magnetische Signalamplitude (pT) umgewandelt.
   2. Jede Messung dauert ca. 5 min. Wenn der Motor auf 0 zurückkommt, klicken Sie auf der Vorderseite auf Speichern. Verwenden Sie sorgfältig Pinzette, um Proben von Motor und Zentrifuge zu nehmen. Verwenden Sie die Anfangsgeschwindigkeit von 335,4 g (2000 U/min, Umdrehung pro Minute für die zentrifuge, die in der Materialtabelleaufgeführt ist).
   3. Tauschen Sie die beiden Proben aus und wenden Sie eine stärkere Kraft an, indem Sie die Zentrifugalgeschwindigkeit um 100 U/min oder eine ähnliche Schrittgröße erhöhen. Prozess abwechselnd, um die Kraft schrittweise zu erhöhen; nach 10-12 Datenpunkten wird ein komplettes Kraftspektrum erreicht.
5. Abschließen des Experiments
   1. Wenn alle geplanten Experimente abgeschlossen sind, schalten Sie die Ausrüstung aus und gehen Sie in umgekehrter Reihenfolge vor, als sie eingeschaltet wurde.
   2. Entfernen Sie die Proben aus dem Halter und tauchen Sie sie zur Reinigung und zukünftigen Verwendung in Ethanol ein. Reinigen Sie den Probenhalter bei magnetischer Perlenkontamination mit Aceton.
6. Datenanalyse
   1. Öffnen Sie das Python-Analyseskript, und geben Sie alle experimentellen Daten ein. Klicken Sie auf Quadrat laden, um die Rechteckwelle als Referenz einzugeben. Klicken Sie dann auf Basislinie laden, um ein magnetisches Restsignal als Hintergrund einzugeben.
   2. Definieren Sie die allgemeine magnetische Signalabnahme als B₀. Normalisieren Sie jede magnetische Signalabnahme B bis B₀ und drücken Sie sie als Prozentsatz aus. Plotten Sie den Prozentsatz (B/B₀) im Vergleich zu der Zentrifugalkraft, um das FIRMS-Spektrum zu erhalten.
      ANMERKUNG: Die Zentrifugalkraft F wird aus der Schwimmmasse der Magnetperlen m (4,6 x 10^{x 15} kg), der Zentrifugalgeschwindigkeit w und dem Radius der Zentrifuge r (7,5 cm hier) über Gleichung F = mw ² r. Die typische Kraftauflösung beträgt 2-4 pN und der Kraftbereich beträgt 15-95 pN in dieser Arbeit.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das Erkennungsschema und die Fotos der hauptwichtigsten Komponenten. Die magnetische Detektion wird durch ein atomares Magnetometer mit dem Scanschema erreicht (Abbildung 1A)¹³. Die Probe wird auf einer Stange platziert, die auf einem Linearmotor montiert ist. Der Motor transportiert die Probe zum Atomsensor innerhalb eines magnetischen Schildes und dann zurück zum ursprünglichen Ort zum Entladen. Das ...

Diskussion

In unserem Doppelherrscher-Assay spielen die magnetischen Perlen zwei wesentliche Rollen. Erstens dienen sie als Kraftgeber, weil die Fliehkraft proportional zu ihrer Auftriebsmasse ist. Zweitens sind die Perlen Signalträger, die von einem Atommagnetometer erfasst werden, das derzeit der genaueste Magnetsensor ist. Durch die Kombination von mechanischer Manipulation und magnetischer Detektion ist die FIRMS-Technik in der Lage, eine große Anzahl molekularer Wechselwirkungen auf der Grundlage ihrer kritischen Dissoziatio...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Styrene Strip	City of Industry	MS-861
Glass slides	Evaporated Coatings		60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid	Millipore Sigma	A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane	UCT specialties	21400088
mPEG-SVA	Laysan Bio	154-82
Biotin-PEG-SVA	Laysan Bio	152-84
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761-500G
Epoxy glue	Devcon	31345
Streptavidin	ThermoFisher	434301
Fusidic Acid	Millipore Sigma	F0756-1G
Neomycin Sulfate	Millipore Sigma	1458009
Viomycin Sulfate	Millipore Sigma	1715000
Hygromycin	invitrogen	10687-010
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941-100G
Magnesium acetate	Millipore Sigma	M5661-50G
Ammonium chloride	Millipore Sigma	A9434-500G
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9333-500G
EDTA	GIBCO	774750
2-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-500ML
Tween20	Millipore Sigma	P1379-250ML
GTP	Millipore Sigma	G8877-100MG
PEP	Millipore Sigma	P7127-100MG
Pyruvate Kinase	Millipore Sigma	P1506-5KU
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin	ThermoFisher	11205D
mRNA Oligo	Integrated DNA Technologies	133899727	5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468630	3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	164845370	3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468628	3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	163472705	3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678130	3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678131	3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678132	3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678133	3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
Centrifuge	Eppendorf	5427R
Micro Ultracentrifuge	Hitachi	CS150FNX
Vortex mixer	VWR	VM-3000
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR530
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR830
Laser	Newport	TLB-6918-D
Function generator	Stanford Research Systems	DS345
Photo detectors	Thorlabs	DET36A