שליטי ה-DNA כפול ללמוד את המנגנון של טרנסלוקציה הריבוכמה עם פתרון יחיד נוקלאוטיד

Heng Yin; Shoujun Xu; Yuhong Wang

doi:10.3791/59918

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

שיטת ה-DNA כפול מפותחת כדי לקבוע את מיקום mRNA במהלך הריבוטרנסלוקציה, אשר נשענת על כוחות הדיסוציאציה של דופלקסים DNA-mRNA הנוצר. עם יחיד-נוקלאוטיד החלטה ויכולת להגיע שני הקצוות של mRNA, זה יכול לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוכמה ולחקור אחרים חומצות גרעין displacements.

Abstract

הריבוכמה הטרנסלוקציה מתייחסת לתנועה הריבוזומלית ב-mRNA על-ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt), שהוא השלב המרכזי בסינתזה של חלבונים. כדי לחקור את מנגנון המנגנון, קיימות שתי דרישות טכניות חיוניות. ראשית, רזולוציה בודדת של nt שיכולה לפתור טרנסלוקציה רגילה מ-frameshifting, שבמהלכה הריבוכמה נע על-ידי אחר מ-3 nt. השני הוא היכולת לחקור הן את צדי הכניסה והיציאה של mRNA כדי להבהיר את התמונה כולה של טרנסלוקציה. אנו מדווחים על שיטת ה-DNA הכפולה המבוססת על כוחות הדיסוציאציה הקריטיים של הדופלקסים של DNA-mRNA, המתקבל על ידי שריד מגנטיזציה מגנטית שארית (חברות). עם 2-4 ברזולוציה הכוח pN, הבחינה הסרגל כפול הוא מספיק כדי להבדיל בין שלבי הטרנסלוקציה שונים. על ידי יישום מקשר ארוך על DNAs בדיקה, הם יכולים להגיע mRNA בצד הנגדי של ריבוכמה, כך מיקום mRNA יכול להיקבע עבור שני הצדדים. לכן, השיטת הסרגל הכפולה מתאימה באופן ייחודי לחקירת הטרנסלוקציה הריבומוגית, ולתנועת חומצת גרעין באופן כללי. אנו מראים תוצאות הנציג אשר הצביעו על mRNA בלולאה היווצרות ונפתר טרנסלוקציה נורמלית מ frameshifting.

Introduction

עקירה ביוקולולקולרית היא פרמטר בסיסי בלימוד המנגנון של הפונקציות הביולוגיות הקשורות. דוגמה אחת היא הריבוכמה טרנסלוקציה¹^,², שבמהלכה הריבוכמה נע על ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt) על שליח RNA (mrna) בדרך כלל, ועל ידי אחד, שניים, או מספר אחר של nt מלבד שלושה במקרה של frameshifting. לפיכך, נדרשת רזולוציה יחידה של מערכת שליטה בסרגל מולקולרי כדי להבדיל בין גודלי השלבים השונים. אתגר גדול יותר הוא לחקור את התנועה הריבוחלק הן על הכניסה והן בצד היציאה. במילים אחרות, רק עם מערכת סרגל כפול נוכל לגלות אם mrna הוא משורשר בצורה חלקה דרך ריבוכמה, או יש שלבי ביניים שבו שני הצדדים יש גדלים צעד שונה המוביל לתוך מקוטע או בלולאה mrna היווצרות בפנים ה ריבוזום.

מספר שיטות פותחו כדי להתמודד עם האתגר הראשון של פתרון צעדים שונים בצד היציאה של ריבוחלק (3 ' הקצה של mRNA). השיטת לוציפראז כפולה פותרת את מסגרות הקריאה השונות על-ידי מדידת היחס בין החלבונים השונים הנובעים ממנה³^,⁴. היא ישימה רק עבור 3 ' סוף mRNA ובכך מספיק כדי לספק תמונה מלאה של טרנסלוקציה. ספקטרומטר מסה יכול לנתח את שברי הפפטיד השונים כתוצאה מסידור הקוד המקביל⁵. אבל זה לא יכול להצביע על כמה nt הריבוכמה נע על mRNA. שיטת ההדפסה הבוהן היא שיטה נפוצה נוספת המשתמשת בטרנסקריפטאז הפוכה שהייתה מועלת ב -3 '-הסוף כדי לתעתור את ה-mRNA לקראת הריבוחלק⁶. עם זאת, היא אינה ישימה עבור 5 ' סוף mRNA כי הוא להזין את ריבוכמה. טכניקות אחרות, כולל גישות מולקולה יחידה ושיטות זריחה⁷, קשה להשיג רזולוציה בודדת-nt.

פיתחנו את שיטת ה-DNA כפול שניתן לקבוע באופן ייחודי הן את מיקומי הכניסה והיציאה של mRNA החשופה ב-מכלולי הריבוכמה-mRNA. DNAs הסרגל הם ה-DNA oligomers שיוצרים דופלקסים של מספר מסוים של זוגות בסיס (bp) עם mRNA חשף על ידי הריבוכמה, ללא קשר לאיזה קצה של mRNA. מספרי bp ולאחר מכן בדיוק לחשוף את מיקום הריבוכמה על mRNA במהלך הטרנסלוקציה. מספרי הלחץ של הדופלקסים נקבעים על ידי כוחות הדיסוציאציה הקריטיים שלהם, שהתקבלו מהספקטרוסקופיית מגנטיזציה (חברות)⁸. עם 2-3 בחוסר ודאות כוח, הכוחות הקריטיים מספיקים כדי להציע רזולוציה בודדת nt. על-ידי יישום מולקולת מקשר על שליטי ה-DNA, הצד הפריע באופן שחור של mRNA על ידי הריבוכמה ניתן לנחקר. הריבוזומdisplacements שונים יכולים ובכך להיפתר במדויק. הצלחנו לחשוף בהצלחה היווצרות בלולאה ייחודית של mRNA לכוד על ידי אנטיביוטיקה במהלך הטרנסלוקציה⁹, ופתרו מסגרות קריאה שונות שנוצרו ברצף mrna חלקלק¹⁰. מאמר זה מתאר את הפרטים של מערך הסרגל הכפול, הכולל הכנת מכלולי ריבוכמה, הפונקציונליות של פני השטח של שקופיות הזכוכית, השתק של מכלולי ריבוכמה והכלאה שלהם עם השליט DNA מגנטית מתויג מולקולות, זיהוי מגנטי וניתוח ספקטרום הכוח של חברות משרדי.

Protocol

1. הכנת הריבוכמה מתחמי

להפוך 1,000 mL של TAM10 מאגר, אשר מורכב 20 מ"מ-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ Mg (OAc)₂, 30 מ"מ NH₄Cl, 70 mm KCL, 5 מ"מ EDTA, 7 מ"מ bme (2-mercaptoethanol), ו 0.05% Tween20.
הכינו את חמשת התערובות שמופיעות בטבלה 1.
הערה: הריבוחלק היה מהזן MRE600¹¹. EF-Tu: גורם התארכות בלתי יציב. EF-Ts: גורם התארכות באורווה. GTP: guanosine triphosphate. פפ: פוספאו (enol) פירובט.
מודטה את חמשת מתערבב בנפרד ב 37 ° c עבור 25 דקות לפני ביצוע הריבוכמה תסביכים. הכן את חמשת הריבוכמה מתחמי לפי שולחן 2.
הערה: לאחר הטרנסלוקציה; מראש: טרום טרנסלוקציה.
הוסף כל אחד מחמשת הריבוכמה מתחמים על 1.1 M כרית סוכרוז בנפרד, עם יחס נפח 1:1. לטהר כל אחד עם 450,000 × g עבור 2 h ב במיוחד צנטריפוגה. השתמש בחיית מחמד כדי להסיר את supernatant ולשחזר את הריבוכמה מתחמי ב-80 ° צ' לאחר השעיית הגלולה עם מאגר TAM10.

2. הכנת מגלשות זכוכית מצופות בביוטין

ניקוי ראשוני של מגלשות הזכוכית
1. מקום 12 שקופיות זכוכית עם ממדים של 60.0 × 4.0 × 0.3 mm³ (L × W × T) בצלחת זכוכית קצרה ורחבה.
2. ממלאים את צלחת הזכוכית עם אצטון ו sonicate עבור 5 דקות. ואז לשטוף את השקופיות עם מים באולטרסאונד 5 פעמים ולמלא 3/4 של המנה עם מים.
3. הוסף 10 M KOH למלא את הצלחת ולsonicate את שקופיות זכוכית עבור 20 דקות. שטוף את השקופיות עם מים 5 פעמים.
4. להוסיף אתנול ו sonicate עבור 5 דקות, לשפוך את האתנול ולאחר מכן לייבש אותם בנפרד ב 300 ° c עבור 3 h.
מבנה עמינח
1. הניחו את 12 השקופיות הנקיות בחזרה לצלוחית הזכוכית המכילה את מתנול. נקו את הבקבוקון במתנול באמצעות sonicating במשך 5 דקות, ולאחר מכן מלאו אותו במתנול מ ל, 1.25 מ ל, 0.125 mL, 0.25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
2. מיד להחליף את מתנול בצלחת זכוכית עם פתרון AMEO מוכן. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
3. לשטוף את השקופיות עם מים מספר פעמים, ואז לייבש אותם על ידי לטהר חנקן. מניחים את השקופיות מיובשות במנות זכוכית נקיות.
הפגלוציה
1. להכין נחקו₃ פתרון (8.4 Mg/mL) ו PEGylation מאגר (37.5 mg פג, 6 מ"ג biotinylated פג, 150 Μl שיתוף₃ פתרון). מערבבים היטב על ידי ספינינג 6,000 rpm עבור 1 דקות.
2. מקם 25 μL של פתרון יתד על כל שקופית. . תכסה את זה עם המגלשה השנייה למעלה ודא שאין בועות בין שתי השקופיות. מניחים את השקופיות בתיבה ריקה של מלטף. ודא שהתיבה מוחלקה ומניחים אותה במגירה חשוכה במשך כ-3 שעות.
3. שטפו את השקופיות במים והתייבשו שוב. לאחסן את השקופיות מיובש בטמפרטורת החדר תחת ואקום עד 2 שבועות.

3. הכנה לדוגמא לפני מדידות מגנטיות וכוח

מכונת מדגם פלסטיק היטב עם ממדים 4 × 3 × 2 מ"מ³(L × W × D). הדבק חתיכת זכוכית מצופה biotin (כ 5 מ"מ אורך, לגזור מ 60 מ"מ שקופיות ארוכות מוכן בסעיף 2) על המשטח התחתון באמצעות אפוקסי.
הוסף 20 μL של 0.25 mg/mL streptavidin מימית הפתרון לתוך המדגם היטב מודקרת בטמפרטורת החדר עבור 40 דקות. לאחר מכן שטוף את המדגם היטב פעמיים עם מאגר TAM₁₀ .
. לשתק את הריבוכמה תסביכים
1. ללא אנטיביוטיקה: להשתמש בצינורות כדי להסיר מאגר ממדגם היטב, ואז להוסיף 20 μL של 0.1 μM ריבוכמה מורכבים (MF-Pre או MF-Post) למדגם היטב. הריבוכמה מורכבים יהיה לאגד עם הstreptavidin על פני השטח דרך ביוטין 5-סוף על mrna. דגירה ב 37 ° צ' עבור 1 h ולאחר מכן לשטוף פעם אחת עם TAM₁₀ מאגר.
2. עבור הניסוי באמצעות שני neomycin ו חומצה fusidic: הדגירה של MF-Pre מורכבים עם neomycin ב 37 ° c עבור 10 דקות; דגירה EF-G עם חומצה fusidic ב 37 ° c עבור 20 דקות. ריכוזים הם כדלקמן: 0.1 μM ריבוכמה מורכבים, 2 μM EF-G, 4 מ"מ GTP, 4 מ"מ מילימטר, 0.02 mg/mL פירובט קינאז, 0.2 mM neomycin, ו 0.25 חומצה fusidic mM.
3. ביצוע ניסויים אחרים אנטיביוטיקה באופן דומה. ריכוזים הם כדלקמן: 0.2 mM viomycin, 0.4 mM hygromycin B, ו 0.25 mM חומצה fusidic.
4. למחקר frameshifting, לחזור על הצעדים לעיל עבור MFNF-Pre ו-MFNF-Post מתחמי מעורבים מוטיב חלקלק U₆א. השתמש אנטיביוטיקה fusidic חומצה בתוספת neomycin, ו חומצה fusidic לבד, בהתאמה.
הסרת מאגר ממדגם היטב, ולאחר מכן להוסיף 20 μL של 1 μM ביולוגית בדיקת ה-DNA לחטט ו דגירה בטמפרטורת החדר בלילה. לשטוף את ה-DNA-mRNA הנוצר דופלקס פעם עם מאגר TAM₁₀ .
הסר את המאגר מהדוגמה היטב. לאחר מכן להוסיף 20 μL של 0.5 mg/mL streptavidin-מצופה חרוזים מגנטיים לתוך המדגם גם בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
הכנס בזהירות את המדגם גם לתוך המחזיק ולמקם אותו בצנטריפוגה. הסר את החלקיקים המגנטיים חינם מן המשטח על ידי תפרידו ב 84 x g עבור 5 דקות.

4. מדידות מגנטיות וכוח

הפעלת הלייזר
1. . תדליק את הלייזר בעזרת המפתח לאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה.
2. להתאים את הרגישות של מגבר נעילה 1 (LIA1) כדי 500 mV ולחכות כ 2 h כדי לחמם ולייצב את המגנטומטר האטומי.
הקמת מגנטומטר אטומי
1. הפעל את תוכנת בקרת הכלי והגדר את פרמטרי המדידה. פרמטרים מסוימים עשויים להשתנות במקצת בכל מדידה.
  הערה: מגנטומטר אטומי כולל לייזר (המתואר לעיל), מגבר SR830 lock-in (המכונה LIA1), מגבר נעילה SR530 (המכונה LIA2), DS345 (המכונה FG1) ו ATF20B (המכונה FG2) גנרטורים פונקציה, ברזולוציה גבוהה מנוע ומחשב. כל אלה צריכים להיות מופעלים בשלב זה של הפרוטוקול.
2. הגדר מצב מנוע נע למצב רעש וברירת מחדל ל- 0. הקש נעילת בלוח הקדמי, להתאים את הרגישות של LIA1 בחזרה ל 200 mV.
3. התאימו את הזרם והמתח של הלייזר ותמצאו את פסגת התהודה המתאימה ואת רמת האות לרעש. לחצו על ' ניקוי ' בפנל הקדמי. שים לב היחס משרעת/רוחב צריך להיות מעל 0.5 וערך שלב צריך להיות פחות מ 5 מעלות. אם לא, בצע את הסריקה מחדש.
4. הכנס את התפוקה של LIA2 למשוב של הלייזר כדי לנעול את התדר שלו. מגבר זה מודד את הסיבוב האופטי של תא צסיום עזר כדי לשמור על תדר לייזר על תהודה¹². המדינה נותרה עד סוף המדידה.
5. תוסף פונקציה Plug-in מחולל FG2 כדי להזין גל מרובע (500 וירטואלי, 100 mHz) כאות התייחסות. גל מרובע מתאים 100 pT והוא משמש כדי להמיר את הפלט הנוכחי של המגבר לאות מגנטי. נתק את גנרטור הפונקציה.
6. הגדרת מצב הנעה מנוע למיקום דו כיוון וברירת מחדל ל 260 מ"מ. בדוק את מצב בקר הטמפרטורה כדי להבטיח את הטמפרטורה הנכונה (~ 37 ° c) של החיישן האטומי.
7. בדוק את יציבות המערכת כולה על ידי מדידת האותות של מחזיק הדגימה הריקה פעמיים. הערכת יציבות ורמת רעש לאחר חיסור שני עקבות. רמת רעש אופייני תנודות צריך להיות ± 2 pT ב 30 ms זמן האינטגרציה.
מגנטיזציה של המדגם
1. מניחים בעדינות את המדגם על תחנת המגנטיזציה ומניחים לו להישאר למשך 2 דקות.
  הערה: תחנת המגנטיזציה מורכבת ממגנט קבוע (~ 0.5 T) ומרווח פלסטיק.
2. . תחזיר את הדגימה למחזיק הדגימה השתמש בכוח צנטריפוגלי 335.4 × g כדי להסיר את החלקיקים המגנטיים שאינם מאוגדים במפורש.
מדידות מגנטיות לאחר החלת כוחות
1. השתמש בפינצטה כדי לטעון את המדגם על המנוע. לחץ על נעל בלוח הקדמי כדי להפעיל את התוכנית. בינתיים, להשתמש בפינצטה לטעון את המדגם השני במחזיק ולמקם אותו בצנטריפוגה. שימו לב שהצד הזכוכית המצופה צריך להתייצב במרכז הצנטריפוגה.
  הערה: הטכניקה של שארית הנגרמת כתוצאה ממגנטיזציה ספקטרוסקופיה (חברות) משמש, אשר משתמשת מגנטומטר אטומי כדי למדוד את האות המגנטי של המדגם לאחר החלת כוח מכני על האינטראקציות המולקולריות במדגם. כאן, האינטראקציות המולקולריות הן בין מולקולות הסרגל DNA ו-mRNA בקומפלקס הריבוחלק. הכוח חורג מוגבר על ידי. הגברת המהירות הצנטריפוגלי לאחר החלת כל כוח, המנוע מתרגמת את המדגם לחיישן האטומי ולאחר מכן נעה חזרה. מכאן, שני פרופילי שדה מגנטי מתקבלים, אחד במהלך סריקה קדימה והשני במהלך סריקה לאחור¹³. אנו משתמשים רק האחרון כדי לחלץ את גובה השיא בשל היחס הטוב ביותר שלה האות לרעש. גובה השיא בנוכחי (nA) מומר לשרעת אות מגנטית (pT) בהתבסס על גל מרובע הכיול.
2. כל מדידה נמשכת כ-5 דקות. כאשר המנוע חוזר אל 0, לחץ על שמור בלוח הקדמי. השתמשו בפינצטה בקפידה כדי לקחת דגימות מהמנוע ומצנטריפוגה. השתמש במהירות הראשונית המתאימה 335.4 × g (2000 rpm, מהפכה לדקה עבור הצנטריפוגה המפורטים בטבלת החומרים).
3. החלף את שתי הדגימות ויישם כוח חזק יותר על-ידי הגדלת המהירות הצנטריפוגלי באמצעות 100 rpm או גודל שלב דומה. עבד לסירוגין כדי להגביר בהדרגה את הכוח; ספקטרום כוח מלא מתקבל לאחר 10-12 נקודות נתונים.
לסיים את הניסוי
1. כאשר כל הניסויים המתוכננים גמורים, כבו את הציוד והמשיכו בסדר הנגדי כפי שהוא הופעל.
2. הסר את הדגימות מן המחזיק ולטבול אותם באתנול לניקוי ושימוש עתידי. נקה את מחזיק הדגימה עם אצטון במקרה של זיהום חרוזים מגנטיים.
ניתוח מידע
1. פתח את קובץ ה-script לניתוח פייתון וקלט את כל הנתונים הניסיוניים. לחץ על טען ריבוע כדי להזין את גל הריבוע כהפניה. לאחר מכן לחץ על טען תוכנית בסיסית כדי להזין אות מגנטי שיורית כרקע.
2. הגדירו את האות המגנטי הכולל הקטנה כ- B₀. נרמול כל אות מגנטי מצמצם את b ל- b₀ ומבטא אותו כאחוז. התווה את האחוז (B/B₀) לעומת כוח צנטריפוגלי כדי להשיג את הספקטרום של המשרדים.
  הערה: כוח צנטריפוגלי f מחושב מתוך מסה הפרוע של החרוזים מגנטי m (4.6 × 10 על¹⁵ ק ג), מהירות צנטריפוגלי w, ואת רדיוס של צנטריפוגה r (7.5 ס מ כאן) דרך המשוואה F = mw מיכל השני r. הרזולוציה כוח אופייני הוא 2-4 pn ו טווח כוח הוא 15-95 pN בעבודה זו.

תוצאות

איור 1 מציג את ערכת האיתור והתצלומים של הרכיבים המרכזיים. זיהוי מגנטי מושגת על ידי מגנטומטר אטומי באמצעות ערכת הסריקה (איור 1א)¹³. המדגם ממוקם על מוט רכוב על מנוע ליניארי. המנוע מסיע את הדגימה לחיישן האטומי בתוך מגן מגנטי, ואז בחזרה לאתר ?...

Discussion

בתוך השליטה הכפולה שלנו, החרוזים המגנטיים לשחק שני תפקידים חיוניים. ראשית, הם משמשים ככוח התמרה כי הכוח הצנטריפוגלי הוא יחסי למסה הפרוע שלהם. שנית, החרוזים הם נושאות איתותים שזוהו על ידי מגנטומטר אטומי, שכרגע הוא החיישן המגנטי המדויק ביותר. שילוב מניפולציה מכנית וזיהוי מגנטי, שיטת המשרדים ...

Disclosures

לא דווח על ניגוד אינטרסים פוטנציאלי על-ידי סופרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (R01GM111452, י, S.X.). י. ו. מאשר תמיכה מקרן וולש (E-1721).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Styrene Strip	City of Industry	MS-861
Glass slides	Evaporated Coatings		60.0 × 4.0 × 0.3 mm³
Acetic acid	Millipore Sigma	A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane	UCT specialties	21400088
mPEG-SVA	Laysan Bio	154-82
Biotin-PEG-SVA	Laysan Bio	152-84
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761-500G
Epoxy glue	Devcon	31345
Streptavidin	ThermoFisher	434301
Fusidic Acid	Millipore Sigma	F0756-1G
Neomycin Sulfate	Millipore Sigma	1458009
Viomycin Sulfate	Millipore Sigma	1715000
Hygromycin	invitrogen	10687-010
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941-100G
Magnesium acetate	Millipore Sigma	M5661-50G
Ammonium chloride	Millipore Sigma	A9434-500G
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9333-500G
EDTA	GIBCO	774750
2-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-500ML
Tween20	Millipore Sigma	P1379-250ML
GTP	Millipore Sigma	G8877-100MG
PEP	Millipore Sigma	P7127-100MG
Pyruvate Kinase	Millipore Sigma	P1506-5KU
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin	ThermoFisher	11205D
mRNA Oligo	Integrated DNA Technologies	133899727	5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468630	3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	164845370	3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468628	3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	163472705	3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678130	3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678131	3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678132	3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678133	3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
Centrifuge	Eppendorf	5427R
Micro Ultracentrifuge	Hitachi	CS150FNX
Vortex mixer	VWR	VM-3000
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR530
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR830
Laser	Newport	TLB-6918-D
Function generator	Stanford Research Systems	DS345
Photo detectors	Thorlabs	DET36A

References

Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149 DNA frameshifting mRNA

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: