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要約

デュアルDNA定規アッセイは、形成されたDNA-mRNA二重鎖の解離力に依存するリボソーム転位時のmRNA位置を決定するために開発される。単一ヌクレオチド分解能とmRNAの両端に到達する能力を備え、リボソーム転位およびプローブ他の核酸変位に関する機械的洞察を提供できる。

要約

リボソーム転位とは、タンパク質合成の中心的なステップである正確に3つのヌクレオチド(nt)によるmRNA上のリボソーム運動を指す。そのメカニズムを調査するには、2 つの重要な技術的要件があります。1つ目は、フレームシフトからの通常の転位を解決できるシングルnt解像度で、その間にリボソームが3nt以外で移動します。2つ目は、mRNAの入口側と出口側の両方を調べ、転移の全体像を解明する能力です。我々は、強制誘発残留磁化分光法(FIRMS)によって得られたDNA-mRNA二重鎖の臨界解離力に基づく二重DNA定規アッセイを報告する。 2-4 pN力分解能を使用すると、デュアルルーラーアッセイは異なる転位ステップを区別するのに十分です。プローブDNに長いリンカーを実装することにより、リボソームの反対側のmRNAに到達できるため、mRNAの位置を両側で決定することができます。したがって、デュアル定規アッセイは、リボソーム転位、および核酸運動全般を調べるのに一意に適している。ループmRNAの立体構造を示し、フレームシフトからの正常な転位を解消した代表的な結果を示す.

概要

生体分子変位は、関連する生物学的機能のメカニズムを研究する上で基本的なパラメータである。1つの特定の例は、リボソーム転位1、2、その間にリボソームがメッセンジャーRNA(mRNA)上で正確に3つのヌクレオチド(nt)によって、および1つ、2つ、または3を除くntの他の数によって移動する。フレームシフト。したがって、異なるステップサイズを区別するために、分子定規システムシングルNT分解能が必要です。より大きな課題は、入口側と出口側の両方でリボソームの動きを調べ取ることです。言い換えれば、デュアルルーラーシステムでのみ、mRNAがリボソームを通してスムーズに通付けされているのか、または両側が異なるステップサイズを持ち、内側のmRNAの立体構造を引き起こしているのかを明らかにすることができます。リボソーム。

リボソームの出口側(mRNAの3'末端)の異なるステップを解決する最初の課題に対処するために、いくつかの方法が開発されました。デュアルルシフェラーゼアッセイは、得られた異なるタンパク質3、4の比率を測定することによって、異なる読み取りフレームを解決します。これは、mRNAの3'末端にのみ適用可能であり、したがって、転位の全体像を提供するには不十分です。質量分析は、対応するコード再配置5の結果として異なるペプチド断片を分析することができる。しかし、リボソームがmRNA上でどれだけのntを動かすかを特定することはできません。つま先印刷アッセイは、3'-遠位端でプライミングされた逆転写酵素を使用して、リボソーム6に向かってmRNAを転写するもう一つの一般的な方法である。しかし、リボソームに入っているmRNAの5'末端には適用できない。単一分子アプローチおよび蛍光法7を含む他の技術は、単一nt分解能を達成することは困難である。

我々は、リボソーム-mRNA複合体における未発見のmRNAの入り口と出口位置の両方を一意に決定できるデュアルDNA定規アッセイを開発した。 定規DNAは、mRNAのどちらの端に関係なく、リボソームによって発見されたmRNAと一定数の塩基対(bp)の二重鎖を形成するDNAオリゴマーである。bp番号は転移の間にmRNAのリボソームの位置を正確に明らかにする。二重鎖のbp数は、力誘発残留磁化分光法(FIRMS)8から得られた重要な解離力によって決定される。2-3 pN力の不確実性では、臨界力は単一nt分解能を提供するのに十分である。DNA定規にリンカー分子を実装することにより、リボソームによるmRNAの立体的に妨げられた側をプローブすることができる。異なるリボソーム変位は、したがって正確に解決することができる。我々は、転移9の間に抗生物質によって捕らえられたmRNAのユニークなループされた立体構造を明らかにし、滑りやすいmRNA配列10上で共存した異なる読み取りフレームを解決した。この記事では、リボソーム複合体の調製、ガラススライドの表面機能化、リボソーム複合体の固定化、磁気標識されたDNA定規によるハイブリダイゼーションを含むデュアルルーラーアッセイの詳細について説明します。分子、磁気検出、およびフォーススペクトル分析を行います。

プロトコル

1. リボソーム複合体の調製

  1. 20 mMトリス-HCl(pH 7.5)、10 mM Mg(OAc)2、30 mM NH4Cl、70 mM KCl、5 mM EDTA、7 mM BME(2-メルカプトエタノール)、および0.05%Tween20で構成されるTAM10バッファの1,000 mLを作ります。
  2. 表 1に示す 5 つの混合物を準備します。
    注:リボソームはMRE600株11からであった。EF-Tu:伸び係数サーモ不安定。EF-Ts:伸び因子サーモ安定。GTP: グアノシン三リン酸.PEP: ホスホ(エノール)ピルビン酸。
  3. リボソーム複合体を作る前に、5つのミックスを37°Cで25分間別々にインキュベートします。表 2に示すように、5 つのリボソーム複合体を準備します。
    注: ポスト: ポスト転移;前:転移前。
  4. 5つのリボソーム複合体をそれぞれ1.1Mスクロースクッションに別々に追加し、容積比は1:1です。超遠心分離機で2時間450,000×gでそれぞれを浄化します。 ピペを使用して上清を除去し、TAM10バッファーでペレットを再懸濁した後-80 °Cでリボソーム複合体を復元します。

2. ビオチンコーティングガラススライドの調製

  1. ガラススライドの予備洗浄
    1. 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 (L × W × T) の短くて広いガラス皿に 12 枚のガラススライドを配置します。
    2. ガラス皿にアセトンと超音波処理器を5分間充填します。その後、5回超純水でスライドを洗浄し、水で皿の3/4を充填します。
    3. 皿を満たすために10 M KOHを追加し、20分間ガラススライドを超音波処理し、水でスライドを5回洗います。
    4. エタノールと超音波を5分間加え、エタノールを注ぎ、3時間300°Cで別々に乾燥させます。
  2. アミノシランコーティング
    1. 12個の洗浄されたスライドをメタノールを含むガラス皿に戻します。5分間超音波処理してメタノールでペジル化フラスコをきれいにし、25 mLメタノール、1.25 mL水、0.125 mL HAc、0.25 mL 3-アミノプロピルトリエトキシシラン(AMEO)で満たします。
    2. すぐに準備されたAMEO溶液でガラス皿のメタノールを交換してください。室温で30分間インキュベートします。
    3. スライドを水で数回すすいでから、窒素パージで乾燥させます。乾燥したスライドを清潔なガラス皿に入れます。
  3. ペグレレーション
    1. NaHCO3溶液(8.4mg/mL)およびペグリング化バッファー(37.5mg PEG、6mgバイオチリン化PEG、150μL NaHCO3溶液)を調出す。6,000 rpmで1分間回転させてよく混ぜます。
    2. 各スライドに25 μLのPEG溶液を配置します。上の他のスライドでそれをカバーします。2 つのスライドの間に気泡がないことを確認します。 スライドを空のピペットチップボックスに入れます。箱が水平にされ、約3時間暗い引き出しに置かれてください。
    3. スライドを水ですすいで、もう一度乾かします。乾燥したスライドを真空下で2週間まで室温で保管します。

3. 磁気および力の測定前のサンプル準備

  1. 寸法4×3×2mm3(L×W×D)でプラスチック試料を十分に加工します。 エポキシを使用して底面にビオチンコーティングガラス(長さ約5mm、セクション2で調製した60mm長いスライドから切り取る)を接着します。
  2. 0.25 mg/mLのストレプトアビジン水溶液を20 μLをサンプルウェルに加え、室温で40分間インキュベートします。次に、TAM10バッファーでサンプルを 2 回よくすすいでいます。
  3. リボソーム複合体を固定します。
    1. 抗生物質なし:ピペットを使用してサンプルウェルからバッファーを除去し、0.1 μMリボソーム複合体(MF-PreまたはMF-Post)の20 μLをサンプルウェルに加えます。リボソーム複合体は、mRNA上の5'エンドビオチンを介して表面上のストレプトアビジンと結合します。37°Cで1時間インキュベートし、TAM10バッファーで1回すすいで下します。
    2. ネオマイシンとフシジン酸の両方を用いて実験を行う場合:MF-Pre複合体をネオマイシンで10分間37°Cでインキュベートする。EF-Gを37°Cでフシジン酸で20分間インキュベートします。濃度は、0.1 μMリボソーム複合体、2 μM EF-G、4 mM GTP、4 mM PEP、0.02 mg/mLピルビン酸キナーゼ、0.2mMネオマイシン、および0.25mMフシジン酸です。
    3. 他の抗生物質実験も同様に行う。濃度は、0.2mMビオマイシン、0.4mMハイグロマイシンB、および0.25mMフシジン酸です。
    4. フレームシフト研究では、滑りやすいモチーフU6Aを含むMFNF-PreおよびMFNF-Post複合体の上記の手順を繰り返し、それぞれ抗生物質フシジン酸とネオマイシン、およびフシジン酸を単独で使用する。
  4. サンプルウェルから緩衝液を取り出し、1μMのビオチン化プローブDNA鎖の20 μLを追加し、室温で一晩インキュベートします。TAM10バッファーで形成されたDNA-mRNAデュプレックスを1回すすいで下します。
  5. サンプルウェルからバッファを取り外します。次に、0.5mg/mLの20 μLをサンプルウェルに加え、室温で2時間インキュベートします。
  6. 慎重にサンプルをホルダーによく挿入し、遠心分離機に入れておきます。84 x gで5分間遠心分離して表面から自由な磁性粒子を取り除きます。

4. 磁気と力の測定

  1. レーザーをオンにする
    1. キーを使用してレーザーの電源を入れます。次に、電源ボタンを押します。
    2. ロックインアンプ1(LIA1)の感度を500mVに調整し、約2時間待って原子磁力計を温めて安定させます。
  2. 原子磁力計の設定
    1. 計測器制御ソフトウェアを実行し、測定パラメータを設定します。一部のパラメータは、測定ごとに若干異なる場合があります。
      注:原子磁力計は、レーザー(上述)、SR830ロックインアンプ(LIA1と呼ばれる)、SR530ロックインアンプ(LIA2と呼ばれる)、DS345(FG1と呼ばれる)およびATF20B(FG2と呼ばれる)、高解像度の機能発生器で構成されています。モーターとコンピュータ。これらのすべてを、プロトコルのこのステップでオンにする必要があります。
    2. モータ移動モードをノイズに設定し、デフォルトの位置を0に設定します。フロントパネルのロックを押し、LIA1の感度を200mVに戻します。
    3. レーザーの電流と電圧を調整し、適切な共振ピークと信号対雑音レベルを見つけます。前面パネルのスイープを押します。振幅/幅比は 0.5 を超え、位相値は 5 度未満にする必要があります。そうでない場合は、スイープ ステップを再行します。
    4. その周波数をロックするためにレーザーのフィードバックにLIA2の出力をプラグインします。このアンプは、共振12上のレーザー周波数を維持するために補助セシウムセルの光学回転を測定します。状態は測定が終了するまで残ります。
    5. プラグイン機能ジェネレータFG2は、基準信号として正方形波(500mVpp、100mHz)を入力します。正方形波は100 pTに対応し、アンプの現在の出力を磁気信号に変換するために使用されます。関数ジェネレータを取り外します。
    6. モータ移動モードを双方向およびデフォルト位置 260 mm に設定します。
    7. 空のサンプルホルダーの信号を2回測定して、システム全体の安定性を確認します。2 つのトレースを減算した後の安定性とノイズ レベルを評価します。一般的なノイズレベルと変動は、30ミリ秒の積分時に±2 pTである必要があります。
  3. サンプルの磁化
    1. サンプルを磁化ステーションにそっと置き、2分間滞在させます。
      注:磁化ステーションは、永久磁石(〜0.5 T)とプラスチックスペーサーで構成されています。
    2. サンプルをサンプルホルダーに戻します。335.4 × g遠心力を使用して、非特異的に結合した磁性粒子を除去します。
  4. 力を加え後の磁気測定
    1. ピンセットを使用して、サンプルをモーターにロードします。プログラムを実行するには、前面パネルの [ロック] をクリックします。一方、ピンセットを使用して他のサンプルをホルダーにロードし、遠心分離機に置きます。コーティングされたガラス側は遠心分離機の中心に面する必要があります。
      注:力誘発残留磁化分光法(FIRMS)の技術を使用し、原子間磁力計を使用して、サンプル内の分子相互作用に機械的な力を加えた後にサンプルの磁気信号を測定します。ここで、分子相互作用は、リボソーム複合体におけるDNA定規分子とmRNAとの間にある。力は遠心速度を上げることによって段階的に増加する。各力を加える後、モーターは原子センサーにサンプルを翻訳し、後ろに移動する。したがって、2つの磁場プロファイルが得られ、1つは前方スキャン中、もう1つは後方スキャン13中である。信号対雑音比が良いため、後者のみを使用してピーク高さを抽出します。電流(nA)のピーク高さは、キャリブレーションスクエア波に基づいて磁気信号振幅(pT)に変換されます。
    2. すべての測定はおよそ5分続く。モータが 0 に戻ったら、前面パネルの[保存]をクリックします。ピンセットを注意深く使用して、モーターや遠心分離機からサンプルを採取してください。335.4 × g (2000 rpm、材料の表に記載されている遠心分離機の 1 分あたりの回転数) に対応する初期速度を使用します。
    3. 2つのサンプルを交換し、遠心速度を100rpmまたは同様のステップサイズで増加させることによって、より強い力を適用します。徐々に力を高めるために交互に処理します。完全な力スペクトルは10-12データポイントの後に得られる。
  5. 実験の終了
    1. 計画されたすべての実験が完了したら、機器の電源を切り、電源を入れたときに逆の順序で進めます。
    2. ホルダーからサンプルを取り出し、エタノールに浸して洗浄し、将来使用してください。磁気ビーズ汚染の場合は、アセトンでサンプルホルダーをクリーンアップします。
  6. データ分析
    1. Python 分析スクリプトを開き、すべての実験データを入力します。[四角形をロード] をクリックして、四角形を参照として入力します。次に、[ベースラインをロード]をクリックして、残留磁気信号をバックグラウンドとして入力します。
    2. 全体的な磁気信号の減少をB0として定義します。各磁気信号を正規化するとBからB0に減少し、パーセンテージで表現します。パーセント (B/B0)と遠心力をプロットして、企業スペクトルを取得します。
      注:遠心力Fは、磁気ビーズm(4.6×10-15kg)、遠心速度w、遠心rの半径(ここでは7.5cm)の方程式F =m wの浮力質量から計算されます。 2r.典型的な力の決断は2-4 pNであり、力の範囲はこの仕事で15-95 pNである。

結果

図1は、主要成分の検出スキームと写真を示す。磁気検出は、走査方式(図1A)13を用いて原子磁力計によって達成される。サンプルは線形モーターに取付けられる棒の上に置かれる。モーターは磁気シールドの中の原子センサーにサンプルを運び、それから荷を下すために元の場所に戻る。原子磁力計は、サンプルスキ?...

ディスカッション

私たちのデュアル定規アッセイでは、磁気ビーズは2つの重要な役割を果たしています。まず、遠心力は浮力質量に比例するため、力トランスデューサとして機能します。第二に、ビーズは、現在最も正確な磁気センサである原子磁力計によって検出された信号キャリアです。機械的操作と磁気検出を組み合わせることで、DNA定規の基礎となる重要な解離力に基づいて多数の分子相互作用を解...

開示事項

潜在的な利益相反は著者によって報告されなかった。

謝辞

この研究は、米国国立衛生研究所(R01GM111452、Y.W.、S.X.)によってサポートされています。Y. W. ウェルチ財団(E-1721)からの支援を認めます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Styrene StripCity of IndustryMS-861
Glass slidesEvaporated Coatings60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acidMillipore SigmaA6283-500ML
3-AminopropyltriethoxysilaneUCT specialties21400088
mPEG-SVALaysan Bio154-82
Biotin-PEG-SVALaysan Bio152-84
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761-500G
Epoxy glueDevcon31345
StreptavidinThermoFisher434301
Fusidic AcidMillipore SigmaF0756-1G
Neomycin SulfateMillipore Sigma1458009
Viomycin SulfateMillipore Sigma1715000
Hygromycininvitrogen10687-010
Tris-HClMillipore SigmaT5941-100G
Magnesium acetateMillipore SigmaM5661-50G
Ammonium chlorideMillipore SigmaA9434-500G
Potassium chlorideMillipore SigmaP9333-500G
EDTAGIBCO774750
2-mercaptoethanolMillipore SigmaM6250-500ML
Tween20Millipore SigmaP1379-250ML
GTPMillipore SigmaG8877-100MG
PEPMillipore SigmaP7127-100MG
Pyruvate KinaseMillipore SigmaP1506-5KU
Sucrose Millipore SigmaS7903-5KG
Dynabeads M-280 StreptavidinThermoFisher11205D
mRNA OligoIntegrated DNA Technologies1338997275′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1574686303?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1648453703?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1574686283?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1634727053?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781303?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781313?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781323?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781333?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
CentrifugeEppendorf5427R
Micro UltracentrifugeHitachiCS150FNX
Vortex mixerVWRVM-3000
Lock-in AmplifierStanford Research SystemsSR530
Lock-in AmplifierStanford Research SystemsSR830
LaserNewportTLB-6918-D
Function generatorStanford Research SystemsDS345
Photo detectorsThorlabsDET36A

参考文献

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