Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

Resumo

O ensaio duplo da régua do ADN é desenvolvido para determinar a posição do mRNA durante a translocação Ribossoma, que confia nas forças da dissociação dos duplexes dados forma do ADN-mRNA. Com a definição e a capacidade single-nucleotide de alcangar ambas as extremidades do mRNA, pode fornecer introspecções mecanicista para o translocação e a sonda Ribossoma outros deslocamentos do ácido nucleico.

Resumo

A translocação Ribossome refere-se ao movimento ribossômico no mRNA por exatamente três nucleotídeos (NT), que é o passo central na síntese proteica. Para investigar o seu mecanismo, existem dois requisitos técnicos essenciais. Primeiro é a resolução de NT único que pode resolver translocação normal de frameshifting, durante o qual o Ribossome move por outros de 3 NT. A segunda é a capacidade de sonda tanto os lados de entrada e saída do mRNA, a fim de elucidar todo o quadro de translocação. Nós relatamos o ensaio duplo da régua do ADN que é baseado nas forças críticas da dissociação de duplexes do ADN-mRNA, obtidos pela espectroscopia de magnetização remanescente força-induzida (FIRMAS).  Com resolução de força de 2-4 pN, o ensaio de régua dupla é suficiente para distinguir diferentes etapas de translocação. Implementando um linker longo nos DNAs de sondagem, podem alcangar o mRNA no lado oposto do ribosome, de modo que a posição do mRNA possa ser determinada para ambos os lados. Conseqüentemente, o ensaio duplo da régua é serido excepcionalmente para investigar a translocação Ribossoma, e o movimento ácido nucleico geralmente. Nós mostramos resultados representativos que indicaram um conformação em loop do mRNA e resolveram o translocação normal do frameshifting.

Introdução

O deslocamento Biomolecular é um parâmetro fundamental no estudo do mecanismo das funções biológicas relacionadas. Um exemplo particular é o translocação Ribossome^1,2, durante que o ribossoma se move por exatamente três nucleotídeos (NT) no RNA do mensageiro (mRNA) normalmente, e por um, dois, ou outros números de NT exceto três no caso de ribossômica. Conseqüentemente, uma definição do único-NT do sistema da régua molecular é exigida para distinguir os tamanhos diferentes da etapa. Um desafio maior é sondar o movimento Ribossome nos lados da entrada e da saída. Em outras palavras, somente com um sistema de régua dupla seremos capazes de revelar se o mRNA é suavemente rosqueado através do Ribossome, ou há etapas intermediárias em que os dois lados têm tamanhos de etapa diferentes levando a uma conformação de mRNA tornada ou em loop dentro do Ribossoma.

Vários métodos foram desenvolvidos para abordar o primeiro desafio de resolver diferentes passos no lado de saída do Ribossome (o 3 ' fim do mRNA). O ensaio de luciferase dupla resolve os diferentes quadros de leitura medindo as proporções das diferentes proteínas resultantes^3,4. Só é aplicável para o 3 ' fim do mRNA e, portanto, insuficiente para fornecer um quadro completo de translocação. A espectrometria de massas pode analisar os diferentes fragmentos de peptídeos como consequência dos rearranjos de código correspondentes⁵. Mas não pode apontar a quantos NT o ribossoma movimentos no mRNA. O teste Toe-Printing é outro método comum que usa uma transcriptase reversa preparada na extremidade 3 '-distal para transacir o mRNA em direção ao Ribossome⁶. No entanto, não é aplicável para o 5 ' fim do mRNA que está entrando no Ribossome. Outras técnicas, incluindo abordagens de molécula única e métodos de fluorescência⁷, são difíceis de alcançar a resolução de NT único.

Nós desenvolvemos o ensaio duplo da régua do ADN que pode excepcionalmente determinar as posições da entrada e da saída do mRNA descoberto em complexos de ribosome-mRNA.  Os DNAs da régua são oligômeros do ADN que formam duplex de determinados números dos emparelhadas (BP) com o mRNA descoberto pelo ribosome, não obstante que extremidade do mRNA. Os números BP então revelam precisamente a posição Ribossome no mRNA durante a translocação. Os números de BP dos duplex são determinados por suas forças críticas da dissociação obtidas da espectroscopia de magnetização remanescente induzida pela força (firmas)⁸. Com a incerteza da força de 2-3 pN, as forças críticas são suficientes para oferecer a definição do único-NT. Implementando uma molécula do linker nas réguas do ADN, o lado aberta impedido do mRNA pelo Ribossoma pode ser sonhado. Os deslocamentos ribosomal diferentes podem assim ser resolvidos exatamente. Nós revelamos com sucesso um conformação em loop original do mRNA prendido por antibióticos durante o translocação⁹, e os frames de leitura diferentes resolvidos que coexistiram em uma seqüência escorregadia do mRNA¹⁰. Este artigo descreve os detalhes do ensaio duplo da régua, que incluem a preparação dos complexos Ribossoma, a funcionalização de superfície das corrediças de vidro, a imobilização dos complexos Ribossoma e sua hibridação com a régua magneticamente etiquetada do ADN moléculas, detecção magnética e análise do espectro de força por empresas.

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Protocolo

1. preparação dos complexos ribosalguns

1. Fazer 1.000 mL de tampão TAM10, que consiste de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)₂, 30 mm NH₄CL, 70 mm KCl, 5 mM EDTA, 7 mm Bme (2-Mercaptoetanol), e 0, 5% Tween20.
2. Prepare as cinco misturas indicadas na tabela 1.
   Nota: o Ribossome foi da cepa MRE600¹¹. EF-tu: fator de alongamento termo instável. EF-TS: fator de alongamento Thermo estável. GTP: trifosfato de guanosina. PEP: fosho (enol) piruvato.
3. Incubar as cinco misturas separadamente a 37 ° c por 25 min antes de fazer os complexos ribosalguns. Prepare os cinco complexos ribosalguns de acordo com a tabela 2.
   Nota: Post: post-translocation; Pré: pré-translocação.
4. Adicione cada um dos cinco complexos ribosalguns em um coxim da sacarose de 1,1 M separada, com relação de volume 1:1. Purify cada um com 450.000 × g para 2 h em um ultra-centrifugador. Use um Pipet para remover o sobrenadante e restaure os complexos Ribossoma em-80 ° c após o ressuspensão da pelota com amortecedor TAM10.

2. preparação de lâminas de vidro revestidas com biotina

1. Limpeza preliminar das lâminas de vidro
   1. Coloc 12 corrediças de vidro com dimensões de 60,0 × 4,0 × 0,3 milímetro³ (L × W × T) em um prato de vidro curto e largo.
   2. Encha o prato de vidro com acetona e proceda por 5 min. Em seguida, lave as lâminas com água ultrapura 5 vezes e encha 3/4 do prato com água.
   3. Adicionar 10 M Koh para encher o prato e proceda as lâminas de vidro para 20 min. Lave as lâminas com água 5 vezes.
   4. Adicione etanol e proceda por 5 min, despeje o etanol e, em seguida, seque-os separadamente a 300 ° c por 3 h.
2. Revestimento de aminosilane
   1. Coloque os 12 slides limpos de volta no prato de vidro contendo metanol. Limpe um balão de PEGylation com metanol por sonicating por 5 min, em seguida, preenchê-lo com 25 mL de metanol, 1,25 mL de água, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropiltrietoxisilane (AMEO).
   2. Substitua imediatamente o metanol no prato de vidro com a solução AMEO preparada. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Enxague as lâminas com água várias vezes e seque-as pela purga de nitrogênio. Coloque as lâminas secas em pratos de vidro limpos.
3. O PEGlation
   1. Prepare a solução NaHCO₃ (8,4 mg/ml) e o tampão PEGylation (37,5 mg Peg, 6 mg de Peg biotinilado, 150 μL de solução NaHCO₃ ). Misture bem girando a 6.000 rpm por 1 min.
   2. Coloque 25 μL de solução de PEG em cada slide. Cubra-o com o outro slide no topo. Certifique-se de que não há bolhas entre os dois slides.  Coloque os slides em uma caixa de dica de Pipet vazia. Certifique-se de que a caixa é nivelada e colocá-lo em uma gaveta escura por cerca de 3 h.
   3. Enxágüe as lâminas com água e seque novamente. Armazene as lâminas secas à temperatura ambiente vácuo por até 2 semanas.

3. preparação da amostra antes das medições magnéticas e de força

1. Máquina de uma amostra de plástico bem com dimensões 4 × 3 × 2 mm³ (L × W × D). Cole um pedaço de vidro revestido com biotina (aproximadamente 5 mm de comprimento, cortado dos slides de 60 mm de comprimento preparados na seção 2) na superfície inferior usando epóxi.
2. Adicionar 20 μL de 0,25 mg/mL de solução aquosa de estreptavidina no poço da amostra e incubar à temperatura ambiente durante 40 min. Em seguida, enxague a amostra bem duas vezes com TAM₁₀ buffer.
3. Imobilize os complexos ribosalguns.
   1. Sem antibióticos: Use uma pipeta para remover o tampão da amostra bem, a seguir adicione 20 μl do complexo Ribossoma do μm 0,1 (MF-pre ou MF-borne) no poço da amostra. O complexo Ribossome vai ligar com o estreptavidina na superfície através da biotina 5 '-End no mRNA. Incubar a 37 ° c durante 1 h e enxaguar uma vez com o tampão TAM₁₀ .
   2. Para o experimento utilizando neomicina e ácido fusídico: Incubar o complexo MF-pré com neomicina a 37 ° c por 10 min; Incubar EF-G com ácido fusídico a 37 ° c durante 20 min. As concentrações são as seguintes: 0,1 μm complexo Ribossome, 2 μm EF-G, 4 mm GTP, 4 mm Pep, 0, 2 mg/ml piruvato quinase, 0,2 mm neomicina, e 0,25 mm de ácido fusídico.
   3. Realize as outras experiências dos antibióticos similarmente. As concentrações são as seguintes: 0,2 mM viomicina, 0,4 mM higromicina B e 0,25 mM de ácido fusídico.
   4. Para estudo de ribossômica, repita os passos acima para os complexos mfnf-pre e mfnf-post envolvendo o motivo escorregadio U₆A. Use antibióticos ácido fusídico mais neomicina, e ácido fusídico sozinho, respectivamente.
4. Retire o tampão da amostra bem, em seguida, adicione 20 μL de 1 μm biotinylated sondagem DNA vertente e incubar à temperatura ambiente durante a noite. Enxague o duplex DNA-mRNA formado uma vez com o tampão TAM₁₀ .
5. Remova o buffer do poço de amostra. Em seguida, adicione 20 μL de 0,5 mg/mL de grânulos magnéticos revestidos com streptavidina no poço da amostra e incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
6. Insira cuidadosamente a amostra bem em um suporte e coloque-o em uma centrífuga. Retire as partículas magnéticas livres da superfície por centrifugação a 84 x g durante 5 min.

4. medições magnéticas e de força

1. Ligar o laser
   1. Ligue o laser usando a chave. Em seguida, pressione o botão de energia.
   2. Ajuste a sensibilidade do amplificador de bloqueio 1 (LIA1) para 500 mV e aguarde cerca de 2 h para aquecer e estabilizar o magnetometro atômico.
2. Configurando o magnetómetro atômico
   1. Execute o software de controle de instrumento e configure os parâmetros de medição. Alguns parâmetros podem variar ligeiramente em cada medição.
      Nota: o magnetometro atômico compreende um laser (descrito acima), um amplificador SR830 lock-in (referido como LIA1), um amplificador de bloqueio SR530 (referido como LIA2), DS345 (referido como FG1) e ATF20B (referidos como FG2) geradores de função, uma alta resolução motor e um computador. Todos estes devem ser ativados nesta etapa do protocolo.
   2. Configurar o modo de movimento do motor para ruído e posição predefinida para 0. Pressione o fechamento no painel dianteiro, ajusta a sensibilidade de LIA1 de volta a 200 mV.
   3. Ajuste a corrente e a tensão do laser e encontre o pico apropriado da ressonância e o nível do sinal-à-ruído. Pressione Sweep no painel frontal. Note que a relação amplitude/largura deve estar acima de 0,5 e o valor da fase deve ser inferior a 5 graus. Se não, refaça a etapa de varredura.
   4. Encaixe a saída de LIA2 ao gabarito do laser para travar sua freqüência. Este amplificador mede a rotação óptica de uma célula de césio auxiliar para manter a freqüência do laser na ressonância¹². O estado permanece até o final da medição.
   5. Gerador de função plug-in FG2 para introduzir uma onda quadrada (500 mVpp, 100 mHz) como sinal de referência. A onda quadrada corresponde a 100 pinta e é usada para converter a saída atual do amplificador ao sinal magnético. Desligue o gerador de funções.
   6. Configurar o modo de movimento do motor para a posição de dois sentidos e padrão para 260 mm. Verifique o estado do controlador de temperatura para garantir a temperatura adequada (~ 37 ° c) do sensor atômico.
   7. Verifique a estabilidade de todo o sistema medindo os sinais do suporte de amostra vazio duas vezes. Avalie a estabilidade e o nível de ruído depois de subtrair os dois traços. O nível de ruído e a flutuação típicos devem ser ± 2 pT no tempo de integração de 30 ms.
3. Magnetização da amostra
   1. Coloc delicadamente a amostra na estação da magnetização e deixe-a permanecer por 2 minutos.
      Nota: a estação de magnetização é constituída por um íman permanente (~ 0,5 T) e um espaçador de plástico.
   2. Coloque a amostra de volta no suporte da amostra. Use 335,4 × g força centrífuga para remover as partículas magnéticas não especificamente ligadas.
4. Medições magnéticas após a aplicação de forças
   1. Use pinças para carregar a amostra no motor. Clique em Bloquear no painel frontal para executar o programa. Enquanto isso, use pinças para carregar a outra amostra no suporte e colocá-lo na centrífuga. Note que o lado de vidro revestido deve enfrentar o centro da centrífuga.
      Nota: a técnica de espectroscopia de magnetização remanescente induzida pela força (FIRMAS) é utilizada, que utiliza um magnetómetro atômico para medir o sinal magnético da amostra após a aplicação da força mecânica sobre as interações moleculares na amostra. Aqui, as interações moleculares estão entre as moléculas da régua do ADN e o mRNA no complexo ribossoma. A força é aumentada Stepwise aumentando a velocidade centrífuga. Depois de aplicar cada força, o motor traduz a amostra para o sensor atômico e, em seguida, move para trás. Daqui, dois perfis de campo magnético são obtidos, um durante a varredura para diante e o outro durante a varredura atrasada¹³. Nós usamos somente o último para extrair a altura máxima devido a sua melhor relação do sinal-à-ruído. A altura máxima na corrente (nA) é convertida à amplitude do sinal magnético (pinta) baseada na onda quadrada da calibração.
   2. Cada medição dura aproximadamente 5 min. Quando o motor voltar a 0, clique em salvar no painel frontal. Use cuidadosamente pinças para tirar amostras do motor e centrífuga. Use a velocidade inicial correspondente a 335,4 × g (2000 RPM, revolução por minuto para a centrífuga listada na tabela de materiais).
   3. Troque as duas amostras e aplique uma força mais forte aumentando a velocidade centrífuga em 100 rpm ou tamanho de etapa similar. Processe alternadamente para aumentar gradualmente a força; um espectro de força completo é obtido após 10-12 pontos de dados.
5. Terminando o experimento
   1. Quando todas as experiências planejadas estiverem concluídas, desligue o equipamento, procedendo na ordem oposta à medida que ela foi ativada.
   2. Retire as amostras do suporte e mergulhe-as em etanol para limpeza e uso futuro. Limpe o suporte da amostra com acetona em caso de contaminação de grânulos magnéticos.
6. Análise de dados
   1. Abra o script de análise do Python e insira todos os dados experimentais. Clique em carregar quadrado para inserir a onda quadrada como referência. Em seguida, clique em carregar linha de base para entrada sinal magnético residual como fundo.
   2. Defina a diminuição do sinal magnético geral como B₀. Normalizar cada sinal magnético diminuir b para b₀ e expressá-lo como uma porcentagem. Plotar a percentagem (B/B₀) versus força centrífuga para obter o espectro de empresas.
      Nota: a força centrífuga F é calculada a partir da massa flutuante dos grânulos magnéticos m (4,6 × 10^{− 15} kg), velocidade centrífuga w e raio da centrífuga r (7,5 cm aqui) através da equação F = mw ^{2. º} r. a resolução de força típica é 2-4 PN e faixa de força é 15-95 PN neste trabalho.

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Resultados

A Figura 1 mostra o esquema de detecção e as fotografias dos componentes principais. A detecção magnética é alcançada por um magnetómetro atômico utilizando o esquema de digitalização (Figura 1a)¹³. A amostra é colocada sobre uma haste montada em um motor linear. O motor transporta a amostra ao sensor atômico dentro de um escudo magnético, a seguir de volta ao local original para descarregar. O magnetometro ...

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Discussão

Em nosso ensaio duplo da régua, os grânulos magnéticos jogam dois papéis essenciais. Primeiro, eles servem como os transdutores de força porque a força centrífuga é proporcional à sua massa flutuante. Em segundo lugar, os grânulos são portadores do sinal detectados por um magnetometer atômico, que seja atualmente o sensor magnético o mais exato. Combinando manipulação mecânica e detecção magnética, a técnica de empresas é capaz de resolver um grande número de interações moleculares com base em sua...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Styrene Strip	City of Industry	MS-861
Glass slides	Evaporated Coatings		60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid	Millipore Sigma	A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane	UCT specialties	21400088
mPEG-SVA	Laysan Bio	154-82
Biotin-PEG-SVA	Laysan Bio	152-84
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761-500G
Epoxy glue	Devcon	31345
Streptavidin	ThermoFisher	434301
Fusidic Acid	Millipore Sigma	F0756-1G
Neomycin Sulfate	Millipore Sigma	1458009
Viomycin Sulfate	Millipore Sigma	1715000
Hygromycin	invitrogen	10687-010
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941-100G
Magnesium acetate	Millipore Sigma	M5661-50G
Ammonium chloride	Millipore Sigma	A9434-500G
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9333-500G
EDTA	GIBCO	774750
2-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-500ML
Tween20	Millipore Sigma	P1379-250ML
GTP	Millipore Sigma	G8877-100MG
PEP	Millipore Sigma	P7127-100MG
Pyruvate Kinase	Millipore Sigma	P1506-5KU
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin	ThermoFisher	11205D
mRNA Oligo	Integrated DNA Technologies	133899727	5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468630	3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	164845370	3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468628	3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	163472705	3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678130	3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678131	3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678132	3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678133	3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
Centrifuge	Eppendorf	5427R
Micro Ultracentrifuge	Hitachi	CS150FNX
Vortex mixer	VWR	VM-3000
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR530
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR830
Laser	Newport	TLB-6918-D
Function generator	Stanford Research Systems	DS345
Photo detectors	Thorlabs	DET36A