I governanti del DOPPIO DNA studiano il meccanismo della traslocazione del ribosoma con la risoluzione Single-Nucleotide

Riepilogo

L'analisi del doppio righello del DNA viene sviluppata per determinare la posizione dell'mRNA durante la traslocazione del ribosoma, che si basa sulle forze di dissociazione dei duplex DNA-mRNA formati. Con la risoluzione mononucleotide e la capacità di raggiungere entrambe le estremità dell'mRNA, può fornire spunti meccanicistici per la traslocazione del ribosoma e sondare altri spostamenti di acido nucleico.

Abstract

La traslocazione del ribosoma si riferisce al movimento ribosomico sull'mRNA da esattamente tre nucleotidi (nt), che è il passo centrale nella sintesi proteica. Per studiarne il meccanismo, esistono due requisiti tecnici essenziali. Il primo è una risoluzione single-nt che può risolvere la normale traslocazione dal frameshifting, durante il quale il ribosoma si muove di diverso da 3 nt. La seconda è la capacità di sondare i lati di ingresso e uscita dell'mRNA al fine di chiarire l'intero quadro della traslocazione. Riportiamo il doppio saggio del righello del DNA che si basa sulle forze di dissociazione critiche dei duplex DNA-mRNA, ottenuti dalla spettroscopia di magnetizzazione residua indotta dalla forza (FIRMS).  Con la risoluzione della forza 2-4 pN, l'esempio a doppio righello è sufficiente a distinguere i diversi passaggi di traslocazione. Implementando un lungo linker sui DNA di sondaggio, possono raggiungere l'mRNA sul lato opposto del ribosoma, in modo che la posizione dell'mRNA possa essere determinata per entrambi i lati. Pertanto, l'analisi del doppio righello è particolarmente adatta a studiare la traslocazione del ribosoma e il movimento dell'acido nucleico in generale. Mostriamo risultati rappresentativi che indicavano una conformazione di mRNA in loop e risolvevano la normale traslocazione dal frameshifting.

Introduzione

Lo spostamento biomolecolare è un parametro fondamentale nello studio del meccanismo delle funzioni biologiche correlate. Un esempio particolare è la traslocazione ribosoma^1,2, durante la quale il ribosoma si muove esattamente da tre nucleotidi (nt) sull'RNA messaggero (mRNA) normalmente, e da uno, due o altri numeri di nt tranne tre nel caso di frameshifting. Pertanto, è necessario un sistema di righello molecolare a risoluzione a virgola singola per distinguere le diverse dimensioni del passo. Una sfida più grande è quella di sondare il movimento del ribosoma su entrambi i lati di entrata e di uscita. In altre parole, solo con un sistema a doppio righello saremo in grado di rivelare se l'mRNA è filettato senza intoppi attraverso il ribosoma, o ci sono passaggi intermedi in cui i due lati hanno dimensioni di gradino diverse che portano a una conformazione di mRNA piegata o loop all'interno del Ribosoma.

Sono stati sviluppati diversi metodi per affrontare la prima sfida di risolvere diversi passi sul lato di uscita del ribosoma (la fine del 3' dell'mRNA). Il doppio saggio luciferasi risolve i diversi fotogrammi di lettura misurando i rapporti delle diverse proteine risultanti^3,4. È applicabile solo per l'estremità 3' dell'mRNA e quindi insufficiente a fornire un quadro completo della traslocazione. La spettrometria di massa può analizzare i diversi frammenti di peptidi come conseguenza dei corrispondenti riarrangiamenti del codice⁵. Ma non può individuare quanti nt il ribosoma si muove sull'mRNA. Il test di stampa della dito della luce è un altro metodo comune che utilizza una trascrizione inversa innescata all'estremità 3'-distale per trascrivere l'mRNA verso il ribosoma⁶. Tuttavia, non è applicabile per la fine 5' dell'mRNA che sta entrando nel ribosoma. Altre tecniche, tra cui approcci a singola molecola e metodi di fluorescenza⁷, sono difficili da raggiungere una risoluzione a due.

Abbiamo sviluppato il doppio saggio del righello del DNA in grado di determinare in modo univoco sia le posizioni di ingresso che di uscita dell'mRNA scoperto nei complessi di ribosomi-mRNA.  I DNA righelli sono oligomeri di DNA che formano duplex di un certo numero di coppie di base (bp) con l'mRNA scoperto dal ribosoma, indipendentemente dalla fine dell'mRNA. I numeri bp poi rivelano con precisione la posizione del ribosoma sull'mRNA durante la traslocazione. I numeri bp dei duplex sono determinati dalle loro forze critiche di dissociazione ottenute dalla spettroscopia di magnetizzazione della magnetizzazione di residua indotta dalla forza (FIRMS)⁸. Con 2-3 pN di incertezza forza, le forze critiche sono sufficienti per offrire una risoluzione mono-nt. Implementando una molecola del linker sui righelli del DNA, il lato sterically ostacolato dell'mRNA dal ribosoma può essere sondato. Diversi spostamenti di ribosomia possono quindi essere risolti con precisione. Abbiamo rivelato con successo un'unica conformazione loopdiforme di mRNA intrappolata dagli antibiotici durante la traslocazione⁹, e risolto diversi fotogrammi di lettura che coesistevano su una sequenza di mRNA scivolosa¹⁰. Questo articolo descrive i dettagli del saggio a doppio righello, che includono la preparazione dei complessi ribosomi, la funzionalizzazione superficiale dei vetrini di vetro, l'immobilizzazione dei complessi di ribosomi e la loro ibridazione con righello di DNA etichettato magneticamente molecole, rilevamento magnetico e analisi dello spettro di forza da parte di FIRMS.

Protocollo

1. Preparazione dei complessi ribosomi

1. Fare 1.000 mL di TAM10 buffer, che consiste di 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)₂, 30 mM NH₄Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-cap mertoetanolo) e 0,05% Tween20.
2. Preparare le cinque miscele elencate nella Tabella 1.
   NOTA: Il ribosoma era del ceppo MRE600¹¹. EF-Tu: fattore di allungamento terminabile. EF-Ts: fattore di allungamento termo stabile. GTP: guanosina tripofosfato. PEP: fosforo (enol)pyruvate.
3. Incubare le cinque miscele separatamente a 37 gradi centigradi per 25 minuti prima di realizzare i complessi di ribosomi. Preparare i cinque complessi di ribosomi secondo la tabella 2.
   NOTA: Post-traslocazione; Pre:pre-traslocazione.
4. Aggiungere ciascuno dei cinque complessi di ribosomi su un cuscino di saccarosio di 1,1 M separatamente, con rapporto di volume 1:1. Purificare ciascuno con 450.000 g per 2 h in un ultra-centrifuga. Utilizzare un pipet per rimuovere il supernatante e ripristinare i complessi di ribosomi a -80 gradi centigradi dopo la sospensione del pellet con buffer TAM10.

2. Preparazione di vetrini in vetro rivestito di biotina

1. Pulizia preliminare degli scivoli di vetro
   1. Collocare 12 vetrini di vetro con dimensioni pari a 60,0 x 4,0 x 0,3 mm³ (L e T) in un piatto di vetro corto e largo.
   2. Riempire il piatto di vetro con acetone e sonicare per 5 min. Quindi lavare i vetrini con acqua ultrapura 5 volte e riempire 3/4 del piatto con acqua.
   3. Aggiungere 10 M KOH per riempire il piatto e sonicare i vetrini di vetro per 20 min. Lavare i vetrini con acqua 5 volte.
   4. Aggiungere l'etanolo e il sonicato per 5 min, versare l'etanolo e poi asciugarli separatamente a 300 gradi centigradi per 3 h.
2. Rivestimento di ammisorria
   1. Rimettere i 12 vetrini puliti nella teglia di vetro contenente metanolo. Pulire una fiaschetta PEGylation con metanolo sonicando per 5 min, quindi riempirlo con 25 mL di metanolo, 1,25 mL di acqua, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
   2. Sostituire immediatamente il metanolo nella teglia di vetro con la soluzione AMEO preparata. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
   3. Sciacquare gli scivoli con acqua più volte, quindi asciugarli con la purga dell'azoto. Mettere i vetrini secchi in piatti di vetro pulito.
3. PEGlation
   1. Preparare la soluzione NaHCO₃ (8,4 mg/mL) e il buffer PEGylation (37,5 mg PEG, 6 mg di PEG biotinylated, 150 soluzione NaHCO_3). Mescolare bene ruotando a 6.000 giri/mm per 1 min.
   2. Posizionare 25 gradi di soluzione PEG su ogni vetrino. Coprirlo con l'altra diapositiva in cima. Assicurarsi che non vi siano bolle tra le due diapositive.  Posizionare le diapositive in una casella di punta pipetta vuota. Assicurarsi che la scatola è livellata e posizionarla in un cassetto scuro per circa 3 h.
   3. Sciacquare gli scivoli con acqua e asciugare di nuovo. Conservare i vetrini essiccati a temperatura ambiente sotto vuoto per un massimo di 2 settimane.

3. Preparazione del campione prima delle misurazioni magnetiche e della forza

1. Lavorare bene un campione di plastica con le dimensioni 4 x 3 x 2 mm³ (L , W e D). Incollare un pezzo di vetro rivestito di biotina (circa 5 mm di lunghezza, tagliato dai vetrini lunghi 60 mm preparati nella sezione 2) sulla superficie inferiore utilizzando la resina epossidica.
2. Aggiungere nel pozzo del campione una soluzione aquesa di 20 -L di 0,25 mg/mL streptavidin e incubare a temperatura ambiente per 40 min. Quindi risciacquare il campione due volte con TAM₁₀ tampone.
3. Immobilizzare i complessi ribosomi.
   1. Senza antibiotici: utilizzare una pipetta per rimuovere bene il buffer dal campione, quindi aggiungere nel pozzo il complesso di ribosomi 0,1 M (MF-Pre o MF-Post). Il complesso di ribosomi si legherà con la streptavidina sulla superficie attraverso la biotina 5'-end sull'mRNA. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora e poi risciacquare una volta con tam₁₀ tampone.
   2. Per l'esperimento utilizzando sia neomicina che acido fusidico: incubare il complesso MF-Pre con neomicina a 37 s per 10 min; incubare EF-G con acido fusidico a 37 gradi centigradi per 20 min. Le concentrazioni sono le seguenti: 0,1 complesso ribosomiare, 2 M EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/mL di pigiami chinasi, neomicina di 0,2 mM e acido fusidico di 0,25 mM.
   3. Eseguire gli altri esperimenti antibiotici in modo simile. Le concentrazioni sono le seguenti: 0,2 mM di viomicina, 0,4 m di igromicina B e 0,25 mM di acido fusidico.
   4. Per lo studio del frameshifting, ripetere i passaggi precedenti per i complessi MFNF-Pre e MFNF-Post che coinvolgono il motivo scivoloso U₆A. Utilizzare antibiotici acido fusidico più neomicina, e acido fusidico da solo, rispettivamente.
4. Rimuovere il buffer dal pozzo campione, quindi aggiungere 20 . Risciacquare il duplex DNA-mRNA formato una volta con buffer TAM_10.
5. Rimuovere il buffer dal pozzo campione. Aggiungere quindi nel pozzo del campione 20 luna di 0,5 mg/mL di perline magnetiche rivestite con streptavidin e incubare a temperatura ambiente per 2 h.
6. Inserire con attenzione il campione in un supporto e metterlo in una centrifuga. Rimuovere le particelle magnetiche libere dalla superficie centrifugando a 84 x g per 5 min.

4. Misurazioni magnetiche e di forza

1. Accensione del laser
   1. Accendere il laser utilizzando la chiave. Quindi premere il pulsante di accensione.
   2. Regolare la sensibilità dell'amplificatore di bloccaggio 1 (LIA1) a 500 mV e attendere circa 2 h per riscaldare e stabilizzare il magnetometro atomico.
2. Impostazione del magnetometro atomico
   1. Eseguire il software di controllo dello strumento e impostare i parametri di misurazione. Alcuni parametri possono variare leggermente in ogni misura.
      NOTA: Il magnetometro atomico comprende un laser (descritto sopra), un amplificatore di blocco SR830 (noto come LIA1), un amplificatore di bloccaggio SR530 (denominato LIA2), DS345 (noto come FG1) e generatori di funzioni ATF20B (denominati FG2), un generatore di funzioni ad alta risoluzione motore e un computer. Tutti questi dovrebbero essere attivati in questa fase del protocollo.
   2. Impostare la modalità di spostamento del motore su Rumore e la posizione predefinita su 0. Premere Blocca sul pannello anteriore, regolare la sensibilità di LIA1 torna a 200 mV.
   3. Regolare la corrente e la tensione del laser e trovare il picco di risonanza corretto e il livello di segnale-rumore. Premere Sweep sul pannello anteriore. Si noti che il rapporto ampiezza/larghezza deve essere superiore a 0,5 e il valore di fase deve essere inferiore a 5 gradi. In caso contrario, eseguire nuovamente il passaggio di sweep.
   4. Collegare l'uscita di LIA2 al feedback del laser per bloccarne la frequenza. Questo amplificatore misura la rotazione ottica di una cella ausiliaria di cesio per mantenere la frequenza laser in risonanza¹². Lo stato rimane fino alla fine della misurazione.
   5. Generatore di funzioni plug-in FG2 per inserire un'onda quadra (500 mVpp, 100 mHz) come segnale di riferimento. L'onda quadra corrisponde a 100 pT e viene utilizzata per convertire l'uscita corrente dell'amplificatore in segnale magnetico. Scollegare il generatore di funzioni.
   6. Impostare la modalità di movimento del motore su Bidirezionale e posizione predefinita su 260 mm. Controllare lo stato del regolatore di temperatura per garantire la temperatura corretta del sensore atomico.
   7. Controllare la stabilità dell'intero sistema misurando due volte i segnali del supporto campione vuoto. Valutare la stabilità e il livello di rumore dopo aver sottratto le due tracce. Il livello di rumore tipico e la fluttuazione dovrebbe essere di 2 pT a 30 ms tempo di integrazione.
3. Magnetizzazione del campione
   1. Posizionare delicatamente il campione sulla stazione di magnetizzazione e lasciarlo rimanere per 2 min.
      NOTA: La stazione di magnetizzazione è costituita da un magnete permanente (0,5 T) e da un distanziale di plastica.
   2. Rimettere il campione nel supporto del campione. Utilizzare una forza centrifuga di 335,4 x per rimuovere le particelle magnetiche non legate in modo specifico.
4. Misure magnetiche dopo l'applicazione delle forze
   1. Utilizzare una pinzetta per caricare il campione sul motore. Fare clic su Blocca sul pannello anteriore per eseguire il programma. Nel frattempo, utilizzare le pinzette per caricare l'altro campione nel supporto e posizionarlo nella centrifuga. Si noti che il lato in vetro rivestito deve affrontare il centro della centrifuga.
      NOTA: Viene utilizzata la tecnica della spettroscopia di magnetizzazione residua indotta dalla forza (FIRMS), che utilizza un magnetometro atomico per misurare il segnale magnetico del campione dopo aver applicato la forza meccanica sulle interazioni molecolari nel campione. Qui, le interazioni molecolari sono tra le molecole righello del DNA e l'mRNA nel complesso ribosoma. La forza aumenta gradualmente aumentando la velocità centrifuga. Dopo aver applicato ogni forza, il motore traduce il campione nel sensore atomico e quindi si sposta indietro. Quindi, si ottengono due profili di campo magnetico, uno durante la scansione in avanti e l'altro durante la scansione all'indietro¹³. Usiamo solo quest'ultimo per estrarre l'altezza di picco grazie al suo migliore rapporto segnale-rumore. L'altezza di picco nella corrente (nA) viene convertita in ampiezza del segnale magnetico (pT) in base all'onda quadra di calibrazione.
   2. Ogni misura dura circa 5 min. Quando il motore torna a 0, fare clic su Salva sul pannello anteriore. Utilizzare con attenzione le pinzette per prelevare campioni da motore e centrifuga. Utilizzare la velocità iniziale corrispondente a 335,4 g (2000 rpm, rivoluzione al minuto per la centrifuga elencata nella Tabella dei materiali).
   3. Scambiare i due campioni e applicare una forza più forte aumentando la velocità centrifuga di 100 giri/min o dimensioni di passo simili. Elaborare alternativamente per aumentare gradualmente la forza; uno spettro di forza completo si ottiene dopo 10-12 punti dati.
5. Completamento dell'esperimento
   1. Quando tutti gli esperimenti pianificati sono terminati, spegnere l'apparecchiatura, procedendo nell'ordine opposto come è stata attivata.
   2. Rimuovere i campioni dal supporto e immergerli in etanolo per la pulizia e l'uso futuro. Pulire il supporto del campione con acetone in caso di contaminazione magnetica delle perline.
6. Analisi dei dati
   1. Aprire lo script di analisi Python e immettere tutti i dati sperimentali. Fare clic su Carica quadrato per inserire l'onda quadra come riferimento. Quindi fare clic su Carica linea di base per inserire il segnale magnetico residuo come sfondo.
   2. Definire la diminuzione complessiva del segnale magnetico come B₀. Normalizzare ogni segnale magnetico diminuire da B a B₀ ed esprimerlo in percentuale. Tracciare la percentuale (B/B₀) rispetto alla forza centrifuga per ottenere lo spettro FIRMS.
      NOTA: La forza centrifuga F è calcolata dalla massa galleggiante delle perle magnetiche m (4,6 x 10^kg), dalla velocità centrifuga w e dal raggio della centrifuga r (7,5 cm qui) tramite l'equazione F ^{2 Il} nome del sistema r.La risoluzione di forza tipica è 2-4 pN e l'intervallo di forza è 15-95 pN in questo lavoro.

Risultati

La figura 1 mostra lo schema di rilevamento e le fotografie dei componenti principali. Il rilevamento magnetico è ottenuto da un magnetometro atomico utilizzando lo schema di scansione (Figura 1A)¹³. Il campione viene posto su un'asta montata su un motore lineare. Il motore trasporta il campione al sensore atomico all'interno di uno scudo magnetico, quindi di nuovo al sito originale per lo scarico. Il magnetometro atomic...

Discussione

Nel nostro assaggio doppio righello, le perline magnetiche svolgono due ruoli essenziali. In primo luogo, servono come trasduttori di forza perché la forza centrifuga è proporzionale alla loro massa galleggiante. In secondo luogo, le perline sono vettori di segnale rilevati da un magnetometro atomico, che è attualmente il sensore magnetico più preciso. Combinando la manipolazione meccanica e il rilevamento magnetico, la tecnica FIRMS è in grado di risolvere un gran numero di interazioni molecolari basate sulle loro ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Styrene Strip	City of Industry	MS-861
Glass slides	Evaporated Coatings		60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid	Millipore Sigma	A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane	UCT specialties	21400088
mPEG-SVA	Laysan Bio	154-82
Biotin-PEG-SVA	Laysan Bio	152-84
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761-500G
Epoxy glue	Devcon	31345
Streptavidin	ThermoFisher	434301
Fusidic Acid	Millipore Sigma	F0756-1G
Neomycin Sulfate	Millipore Sigma	1458009
Viomycin Sulfate	Millipore Sigma	1715000
Hygromycin	invitrogen	10687-010
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941-100G
Magnesium acetate	Millipore Sigma	M5661-50G
Ammonium chloride	Millipore Sigma	A9434-500G
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9333-500G
EDTA	GIBCO	774750
2-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-500ML
Tween20	Millipore Sigma	P1379-250ML
GTP	Millipore Sigma	G8877-100MG
PEP	Millipore Sigma	P7127-100MG
Pyruvate Kinase	Millipore Sigma	P1506-5KU
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin	ThermoFisher	11205D
mRNA Oligo	Integrated DNA Technologies	133899727	5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468630	3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	164845370	3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	157468628	3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	163472705	3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678130	3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678131	3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678132	3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?
DNA Oligo	Integrated DNA Technologies	138678133	3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
Centrifuge	Eppendorf	5427R
Micro Ultracentrifuge	Hitachi	CS150FNX
Vortex mixer	VWR	VM-3000
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR530
Lock-in Amplifier	Stanford Research Systems	SR830
Laser	Newport	TLB-6918-D
Function generator	Stanford Research Systems	DS345
Photo detectors	Thorlabs	DET36A