단일 뉴클레오티드 해상도로 리보솜 전좌의 메커니즘을 연구하는 이중 DNA 통치자

Heng Yin; Shoujun Xu; Yuhong Wang

doi:10.3791/59918

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기사 소개

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요약

이중 DNA 눈자 분석은 형성된 DNA-mRNA 이중의 해리력에 의존하는 리보솜 전좌 동안 mRNA 위치를 결정하기 위하여 개발됩니다. 단일 뉴클레오티드 분해능과 mRNA의 양 단에 도달하는 기능을 통해 리보솜 전좌에 대한 기계적 통찰력을 제공하고 다른 핵산 변위를 조사할 수 있습니다.

초록

리보솜 전좌는 단백질 합성에 있는 중앙 단계인 정확하게 3개의 뉴클레오티드 (nt)에 의해 mRNA에 리보솜 운동을 나타납니다. 메커니즘을 조사하기 위해 두 가지 필수 기술 요구 사항이 있습니다. 첫 번째는 리보솜이 3 nt 를 제외한 다른 것으로 이동하는 동안 프레임 변속에서 정상적인 전좌를 해결할 수있는 단일 nt 해상도입니다. 두 번째는 전좌의 전체 그림을 해명하기 위해 mRNA의 입구와 출구 측면을 모두 조사 할 수있는 기능입니다. 우리는 힘 유도된 잔재 자화 분광학에 의해 장악된 DNA-mRNA 이중의 중요한 해리력에 근거를 둔 이중 DNA 통치자 분석법을 보고합니다 (FIRMS). 2-4 pN 힘 분해능을 사용하면 이중 눈자압 분석이 서로 다른 전좌 단계를 구별하기에 충분합니다. 프로빙 DRNA에 긴 링커를 구현함으로써, 그들은 리보솜의 반대편에 있는 mRNA에 도달할 수 있고, 그래서 mRNA 위치는 양측을 위해 결정될 수 있다. 따라서, 이중 눈금자 분석은 리보솜 전좌 및 일반적으로 핵산 운동을 조사하는 데 유일하게 적합하다. 우리는 루프 mRNA 형태와 프레임 변속에서 정상 전좌를 해결 한 대표적인 결과를 보여줍니다.

서문

생체 분자 변위는 관련 생물학적 기능의 메커니즘을 연구하는 근본적인 매개 변수입니다. 한 가지 특별한 예는 리보솜 전좌^1,^2,리보솜이 메신저 RNA(mRNA)에 대해 정확히 3개의 뉴클레오티드(nt)에 의해 정상적으로 이동하는 동안, 그리고 3개를 제외한 1, 2, 또는 다른 수의 nt가 프레임 변속. 따라서, 분자 눈금자 시스템 단일-nt 해상도는 상이한 단계 크기를 구별하는 데 필요하다. 더 큰 과제는 입구와 출구 양쪽 모두에서 리보솜 움직임을 조사하는 것입니다. 즉, 이중 눈금자 시스템으로만 mRNA가 리보솜을 통해 원활하게 스레드되는지, 또는 양측이 서로 다른 단계 크기를 가지는 중간 단계가 있는지 여부를 밝힐 수 있을 것입니다. 리보솜.

리보솜의 출구 측에 있는 다른 단계를 해결하는 첫번째 도전을 해결하기 위하여 몇몇 방법 (mRNA의 3' 끝)를 해결하기 위하여 개발되었습니다. 이중 루시퍼라제 분석기는 생성된 상이한 단백질의 비율을 측정하여상이한 판독 프레임을 3,^4로해결한다. 그것은 단지 mRNA의 3' 끝에 적용 하 고 ....