雄性小鼠性行为评估

摘要

本文介绍如何在雄性小鼠身上进行性行为测试。

摘要

性行为是高度物种特异性。虽然啮齿动物的性行为略有不同，但老鼠有相似的性行为模式。本文旨在描述激素引起的雌性细胞化女性模型和雄性小鼠性行为评估的实验程序。最重要的性行为元素在视频和插图中得到证明。还解释了性行为测试的关键步骤、优点和局限性。最后，给出了行为参数，并区分了交配中的安装、内向和射精过程。行为参数根据在测试期间发生的持续时间和计数进行评估。

引言

成熟雄性小鼠的性行为是不同大脑回路中一系列相关和相互依存的荷尔蒙系统和神经系统相互作用的结果^1。它还需要发展经验、学习、背景和适当的合作伙伴。行为分析是神经或神经神经功能的重要反映。因此，动物模型的性行为研究已广泛应用于行为神经科学^{等相关研究中。}啮齿动物性行为的类表已被许多文章和书籍^1，3，4解释。例如，斯卡斯和巴菲尔德对大鼠⁵的性行为的描述帮助理解了小鼠⁵的类似行为模式。鼠标是行为研究最常用的主题之一。赫尔等人^对雄性小鼠的性行为进行了详细的介绍:当雄性小鼠遇到雌性时，它开始调查雌性小鼠的生殖器区域。然后，男性按前爪对女性的侧翼，从后方安装女性。女性表现出典型的性接受姿势，将脊柱弯曲成弓，将尾巴移到身体的一侧，露出男性性渗透的开口（即领口）。安装后，男性进行快速、浅骨盆推力，然后进行缓慢而深的阴道推力。经过无数次的接种，一个持久的推力导致精液射精，在此期间，雄性小鼠可以冻结约25s之前，从雌性^6。在射精时，雄性小鼠附属腺可产生含有精液的混合物，这种混合物会硬化成刺激塞。最后，射精后，男性开始生殖器梳理，并表现出对女性缺乏兴趣。简而言之，男性性行为的基本顺序包括嗅探、跟踪、安装、内化、射精和射精后梳理。老鼠性行为表现出应变差异。例如，射精延迟从594到6943s不等，入院人数从5个到100个以上不等。射精后延迟范围从17至60分钟。然而，引入一个新颖的女性可以减少这个时间间隔。在某些情况下，男性射精在第一次介绍与新的女性^7。

评估性行为的主要事件是增加、介绍和射精。行为科学家建议不仅测量每个动作的频率，而且测量其延迟和时间间隔^5，8。过去研究中的一些主要测量指标包括:安装次数、入院次数、安装延迟、延迟、射精延迟、射电后安装延迟（或接种后间隔）、按摩后住院延迟、共支系列数和共支序列的持续时间。Park等人⁸和Sachs等人⁵描述了如何识别啮齿动物的安装、介绍和射精的每个作用。安装的定义是男性从后方安装女性，用前腿拍打她的侧翼，并快速和反复地推力他的阴茎，没有阴茎插入。内省，也称为插入，由以下一种或多种行为确定:快速浅推力后长而深的推力，一个后腿的快速踢，以及男性从女性明显横向退出。射精由一个终端骨盆推力识别，比内向和后腿高程减少的速度慢、更深。从安装到射精的每个序列都确定了共支序列。本研究中使用的行为参数定义如下:1）安装延迟:从引入女性到首次安装男性的时间;2）介绍延迟:从引入女性到第一次介绍的时间;3）射精延迟:从第一次接种到第一次射精的时间（一般遵循最后骨盆推力）;4）射精后安装延迟:从射精到下一次安装的时间;5） 射精后介绍延迟:从射精到下一次的接种时间;6）安装次数:首次射精前的安装时间数;7）入院次数:第一次射精前的介绍次数;8）共合系列的数量:观察期间共合序列的数量;9）共合序列的持续时间:观察期间所有共合序列的时间。

性行为和相关行为可以在男性的家庭笼子或封闭的竞技场进行，其中介绍一种叫做里斯曼的"无秘密"镜盒的装置来观察交配行为^3。摄像机放置在盒子前面，以同时记录从横向视图和从心室视图的倾斜镜镜中小鼠的动作。然而，这种方法需要明亮的灯光，这不可避免地导致更长的居住时间，以消除小鼠的环境压力。在测量方法方面，建议对基于视频的行为进行分析，以记录和量化行为^4。具有逐帧视频前进选项、建议快门速度大于 1/1000 s 的录像机可用于记录鼠标的快速移动。在黑暗的环境中录制时，高分辨率红外摄像机是必需的。要分析胶片，需要使用帧抓取器的计算机，以便捕获单个行为帧以进行计算机操作。小鼠用途极多，在几乎任何治疗后都能表现出补偿行为。模糊性可能存在于每个移动的身体第⁴部分。因此，分析某些行为可能需要更高的分辨率和更高速的摄像机。

小鼠的男性性行为受多种因素影响，包括菌株差异、激素变化和基因突变体^{1、3、9、10。}麦吉尔和布莱特¹¹说明了小鼠交配行为中的应变差异。例如，C57BL/6雄性通常快速获得内向和射精在大约20分钟^11。DBA/2 男性获得内省速度很慢，但射精速度很快。BALB/c男性缓慢实现射精（平均延迟1小时），由于长期求爱^11。睾丸激素促进和维护男性性行为^2，睾丸激素水平的变化可以改变性行为表现¹².手术割礼和抗雄激素治疗可以降低睾丸激素水平，并导致性行为，甚至性动机和性兴奋迅速下降^13。施用的睾丸激素可以恢复在割礼小鼠的预刺激和共亲行为。最后，与野生型小鼠相比，淘汰和击倒小鼠在性行为方面存在差异。例如，具有Adcy3、Cnga2和Gnao靶向突变的雄性小鼠检测信息素的能力降低，而Trpc2敲除小鼠表现出改变的伙伴偏好14，15，16。克劳利³解释了转基因和敲除对小鼠性行为的其他影响。

在这里，描述了评估雄性小鼠与卵巢细胞化女性配对时性行为的最常见程序之一，该女性已被激素准备接受。提出了在小鼠进行性行为实验的实验方案。此外，还展示了CD-1小鼠社会隔离引起的性行为模式改变的一个例子。

研究方案

所有实验都是按照《实验室动物护理原则》（NIH第80-23号出版物，1996年修订）的指导方针进行的，并在医学研究所实验动物中心委员会的批准和监督下进行。工厂开发（中国）。

1. 畜牧业

1. 在25°C下容纳雌性小鼠和雄性小鼠，温度为12小时光/12小时暗循环。
2. 提供免费用水和标准颗粒饮食。
3. 如果从其他设施运输，允许小鼠在手术前 7 天适应其环境。

2. 雌性小鼠的卵巢切除术

1. 通过面锥面膜将雌性（产后8周，6周大）与同一雌性麻醉（诱导4~5%，维护1~2%）。
2. 检查是否达到了适当的麻醉深度，确保超过30s没有自愿运动，同时结合适当的呼吸速率（例如，每2 s或更长呼吸1次）。或者，测试鼠标对后爪脚趾的温和压力的反应。
   注:正常呼吸速率为+180/分钟。麻醉期间，50%的率下降^{是可以接受的。}
   1. 使用眼科药膏，防止角膜干燥和眼外伤，而麻醉。
   2. 将鼠标的体温保持在 36 °C 或以上。必要时在麻醉期间提供补充热支持。
3. 使用前用75%乙醇对手术台的所有手术器械和硬表面进行消毒和消毒。
4. 把动物放在无菌窗帘上。
5. 在老鼠的背上，将毛皮双发在腰椎上，露出皮肤。
6. 用75%的乙醇对暴露的皮肤进行消毒。
7. 从两个大腿根的中心朝 ±1 厘米距离的头部（如图所示），在背面进行单个中线切口（约 0.5 厘米长）。
8. 使用小剪刀穿透皮肤，从底层肌肉中轻轻释放皮下组织，以暴露肌肉层。
9. 找到薄肌肉层下的卵巢，并做一个小切口（约5毫米长），以获得进入圆锥腔。
   1. 使用小钳子将组织稍微拉在腹腔左侧，以显示在白色脂肪组织周围包裹的左侧卵巢（肉眼看到的半透明、不规则的质量，见图1）。
10. 用钝力收回卵巢周围的卵巢脂肪垫，以暴露排卵管。
11. 在排卵管周围执行单个连字，以防止出血。
12. 使用小剪刀轻轻切断排卵并去除卵巢。
13. 仔细检查卵巢，确认所有卵巢组织都已切除。卵巢约 5 毫米 × 4 毫米 × 3 毫米，表面结节不规则。
14. 将排卵的剩余部分放回腹腔。
15. 用可吸收的缝合缝合肌肉层。
16. 将皮肤拉到右侧，露出右侧的肌肉层，并通过重复步骤 2.9_2.16 去除右卵巢。
17. 使用可吸收缝合线关闭皮肤切口。
    1. 向每只小鼠注射青霉素钠（每只小鼠10，000单位/10克），以防止感染。
    2. 沿切口部位在皮肤下方注射利多卡因（4毫克/千克，0.4 mL/kg溶液）。还提供布洛芬（50~60毫克/千克/天;10mL的儿童Motrin在500mL水中）连续在饮用水中持续3天进行疼痛治疗。
18. 将每只小鼠单独放入消毒笼中。
19. 保持密切观察约1⁄2小时，直到完全从麻醉中恢复。
    1. 用纸巾将动物放在干净的笼子里，没有床上用品。此步骤将气管阻塞或肺炎的风险降至最低。在麻醉恢复期间提供补充热支持。监控手术部位，防止伤口破裂。
20. 恢复期过后（手术后约24小时），将小鼠放回家中的笼子。
21. 手术后至少2周不要进行实验。

3. 女性激素诱导的雌性雌性雌性

1. 通过进行阴道涂片，如麦克莱恩等人¹⁸所述，确定女性的最刺激阶段。没有雌性周期变化表明女性的卵巢切除术是成功的。
2. 注射雌二醇苯甲酸酯（每只小鼠20微克，溶解在0.1 mL消毒橄榄油中，内腹）48小时前进行性行为测试。
3. 在性行为测试前4小时注射黄体酮（每只小鼠500微克，溶解在0.1 mL油中，内腹） 4小时。
   注:雌性小鼠的资格由女性接受男性小鼠生殖器插入3次或3次以上，当她们与性活跃和有经验的男性在一个笼子里同居时，由她们决定。

4. 准备性行为测试

1. 在带有黑色Plexiglass墙壁的矩形和开放式场盒（40 厘米 x 40 厘米 x 40 厘米）中对雄性小鼠进行性行为测试，但允许观察小鼠运动的透明前墙除外。
2. 将一般房间照明设置为 650 lux。
   注:不应直接照亮小鼠，以避免异常行为模式。
3. 使用连接到计算机的数码相机来录影鼠标的运动和行为。
4. 在暗周期的最初几个小时对雄性小鼠进行行为测试。

5. 居住

1. 保持实验室安静。
2. 将要测试的小鼠放在开放式盒子的中心，让他们自由探索环境 30 分钟。
3. 在仪器中连续2天对小鼠进行食用，以防止来自新环境的压力。
   注:老鼠应该自由移动和探索，而不会感到压力。雄性小鼠和雌性小鼠都需要适应测试环境。

6. 行为测定

1. 在测试开始之前打开相机。
2. 将要测试的鼠标放在测试箱中的开放字段中央，允许 5 分钟自由探索，以适应环境。
3. 将雌性放入测试盒中。
4. 记录30分钟的社会和交配行为以及雄性小鼠和雌性小鼠之间的相互作用。
5. 关闭摄像机并确认视频已保存。
6. 将女性带出测试盒，记录阴道塞的形成。
   注:接受交配的雌性小鼠不能在一天内用于另一个性行为测试。
7. 把雌性放回笼子里。
8. 把雄性送回家里的笼子里
9. 清洁仪器内的尿液、粪便和衬垫。
10. 用75%的乙醇去除被测试小鼠的气味。
11. 通过重复步骤 6.1_6.10 开始测试下一只雄性小鼠。

7. 行为数据提取

1. 播放视频录制并提取行为参数（参见图 2）。
   1. 在 30 分钟内记录装载次数。
   2. 在30分钟内记录内向次数。
   3. 将引入母级到首次安装的时间记录为安装延迟。
   4. 将引入女性到第一次介绍的时间记录为内费延迟。
   5. 将从第一次介绍到第一次射精的时间记录为射精延迟。
   6. 将从射精到下一次安装的时间记录为接种后安装延迟。
   7. 30 分钟内记录的共合系列数量。从安装到射精的每个序列都是一个共支系列。
   8. 将所有共合系列的时间记录在 30 分钟中作为共合系列的持续时间。

结果

显示了被隔离饲养的CD-1小鼠和组安置的CD-1小鼠的性行为的比较。雄性CD-1小鼠被随机分配成隔离饲养组（IS，每个笼子一只老鼠，n = 30）和一组组（GH，每个笼子5只老鼠，n = 15）。这些小鼠从产后23天到第93天进行了隔离饲养。然后，对两组小鼠的性行为进行评估。我们的研究发现，在IS组，交配的成功率往往低于GH组（IS:80.0%，GH:86.7%），尽管观察到各组之间没有统计学显著差异（p = 0.458）。IS 组?...

讨论

在介绍的协议中有一些关键步骤。关于女性的卵巢切除术，背部的手术切口开口比腹部的切口没有危害。鉴于卵巢的位置是深的，拉其他器官，当切口从腹部切开时往往导致出血，并导致手术视力不明^20。我们的背部进行切口，以容易地到达卵巢，缩短手术时间，并确保手术安全。

手术期间维持无菌条件对生存很重要。在外科手术中考虑了四个主要变量:手?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Choral hydrate	Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd.	20160225
Coated VICRYL Plus Sutures	Ethicon, Inc.	missing
Estradiol benzoate	J&K Scientific, Ltd.	L930Q170
Ethanol absolute	Beijing Chemical Works Co., Ltd.	20160715
Ibuprofen (Children's Motrin)	Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd.	160629478
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	217180501
Lidocaine	HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd.	1170506107
Male and female CD-1 mice	Vital River Beijing	SCXK()2013-0023
Olive oil
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd.	F5126420
Progesterone	J&K Scientific, Ltd.	LR50Q07
Sony digital camera	Sony Corporation	HDR-CX290E
Test box			DIY
ThinkStation Computer	Lenovo	S/N PCOGLQKG
Vaporizer for Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	E05904-009M