Evaluación del comportamiento sexual de los ratones machos

Resumen

Este artículo describe cómo realizar pruebas de comportamiento sexual en ratones macho.

Resumen

El comportamiento sexual es muy específico de cada especie. Aunque los roedores tienen comportamientos sexuales ligeramente diferentes, los ratones y las ratas tienen un patrón de comportamiento sexual similar. El propósito de este artículo es describir el modelo femenino ovariectomizado estrus inducido por hormonas y el procedimiento experimental para la evaluación del comportamiento sexual de ratones machos. Los elementos de comportamiento sexual más importantes se muestran en el video y las ilustraciones. También se explican los pasos críticos, las ventajas y las limitaciones de la prueba de comportamiento sexual. Por último, se presentan los parámetros de comportamiento y se distinguen los procesos de montaje, intromisión y eyaculación en el apareamiento. Los parámetros de comportamiento se evalúan en términos de la duración ocurrida y los recuentos durante el período de prueba.

Introducción

El comportamiento sexual en ratones machos machos maduros es el resultado de la interacción de una serie de sistemas hormonales y sistemas neuronales relacionados e interdependientes en diferentes circuitos cerebrales¹. También requiere experiencias de desarrollo, aprendizaje, contexto y un socio adecuado. El análisis conductual es un reflejo importante sobre la función neuronal o neurocrina. Por lo tanto, estudio de comportamiento sexual en modelos animales ha sido ampliamente utilizado en la neurociencia del comportamiento y otras investigaciones relacionadas². El etograma de las conductas sexuales en roedores se ha explicado en muchos artículos y libros^1,3,4. Por ejemplo, la descripción de Scahs y Barfield del comportamiento sexual en la rata⁵ ha ayudado a entender un patrón de comportamiento similar en ratones^5. El ratón es uno de los sujetos más utilizados para estudios conductuales. ⁶ dio una introducción detallada de los comportamientos sexuales del ratón masculino: Cuando un ratón macho se encuentra con una hembra, comienza a investigar la región anogenital de la hembra. Luego, el macho presiona sus patas delanteras contra los flancos de la hembra para montar a la hembra desde la parte trasera. La hembra exhibe una postura sexualmente receptiva característica, doblando su columna vertebral hacia abajo en un arco y moviendo su cola a un lado del cuerpo, exponiendo una apertura introitus para la penetración sexual del macho (es decir, lordosis). Después del montaje, el macho hace impulsos pélvicos rápidos y poco profundos, seguidos de impulsos vaginales lentos y profundos. Después de numerosas intromisiones, un empuje de larga duración resulta en la eyaculación del semen, durante el cual el ratón macho puede congelarse durante unos 25 s antes de desmontar o caer de la hembra^6. En la eyaculación, las glándulas accesorias machos del ratón pueden producir una mezcla que contiene semen que se endurece para formar el tapón copulatorio. Finalmente, después de la eyaculación, el macho comienza el aseo genital y muestra una falta de interés en la hembra. En resumen, la secuencia básica del comportamiento sexual masculino consiste en oler, seguir, montar, intromisión, eyaculación y acicalamiento posterior a la eyaculación. El comportamiento sexual del ratón presenta diferencias de tensión. Por ejemplo, las latencias de eyaculación oscilan entre 594 y 6943 s, y el número de intromisiones oscila entre 5 y más de 100. Las latencias posteriores a la eyaculación oscilan entre 17 y 60 min. Sin embargo, la introducción de una hembra novedosa puede disminuir este intervalo de tiempo. En algunos casos, el macho eyacula en la primera intromisión con la nueva hembra^7.

Los principales eventos para la evaluación del comportamiento sexual son el montaje, la intromisión y la eyaculación. Científicos del comportamiento han recomendado la medición no sólo de la frecuencia de cada acción, sino también de su latencia y intervalo de tiempo^5,8. Algunos de los principales indicadores de medición en estudios anteriores incluyen: número de montajes, número de intromisiones, latencia de montaje, latencia de intromisiones, latencia de eyaculación, latencia de montaje post-eyaculatoria (o intervalos post-eyaculatorios), latencia de intromisiones post-eyaculatoria, número de series de cópula y duración de series de cópula. ⁵ describieron cómo identificar cada acción de montaje, intromisión y eyaculación de roedores. El montaje se define como el macho que monta la hembra desde la parte trasera, palpar sus flancos con sus patas delanteras, y empujar su pene rápida y repetidamente sin inserción del pene. La intromisión, también conocida como inserción del pene, se identifica mediante uno o más de los siguientes actos: un empuje largo y profundo después de rápidos empujes superficiales, una patada rápida con una pata trasera, y una marcada retirada lateral del macho de la hembra. La eyaculación se identifica por un empuje pélvico terminal que es más lento y más profundo que el de una intromisión y una reducción en la elevación de la pata trasera. Cada secuencia, desde el montaje hasta la eyaculación, identifica una serie copulatoria. Las definiciones de parámetros de comportamiento utilizados en el presente estudio se enumeran de la siguiente manera: 1) Latencia de montaje: el tiempo desde la introducción de la hembra hasta el primer montaje del macho; 2) Latencia de intromisión: el tiempo desde la introducción de la hembra hasta la primera intromisión; 3) Latencia de la eyaculación: el tiempo desde la primera intromisión hasta la primera eyaculación (generalmente después del último empuje pélvico); 4) Latencia de montaje post-eyaculatorio: el tiempo de la eyaculación al siguiente montaje; 5) Latencia de intromisión post-eyaculatoria: el tiempo de la eyaculación y la siguiente intromisión; 6) Número de soportes: el número de tiempos de montaje antes de la primera eyaculación; 7) Número de intromisiones: el número de intromisiones antes de la primera eyaculación; 8) Número de series copulatorias: el número de series copulatorias durante el período de observación; 9) Duración de la serie copulatoria: el tiempo de todas las series copulatorias durante el período de observación.

El comportamiento sexual y el comportamiento relacionado se pueden llevar a cabo en la jaula del varón o en una arena cerrada, entre las cuales se introduce un aparato llamado caja espejada "Sin secretos" de Rissman para observar el comportamiento de apareamiento³. Una cámara de vídeo se coloca delante de la caja para grabar simultáneamente la acción de los ratones desde una vista lateral y a través de un espejo inclinado desde una vista ventral. Sin embargo, este método requiere luces brillantes, lo que inevitablemente conduce a una mayor habituación con el fin de eliminar el estrés ambiental en ratones. En cuanto al método de medición, se recomienda el análisis de comportamiento basado en vídeo para registrar y cuantificar el comportamiento⁴. Una grabadora de vídeo que tiene una opción de avance de vídeo fotograma a fotograma con velocidades de obturación recomendadas superiores a 1/1000 s se puede utilizar para grabar movimientos rápidos del ratón. La cámara infrarroja de alta resolución es necesaria cuando se graba en un entorno oscuro. Para analizar la película, se necesita un ordenador con un agarrador de marcos para permitir que los fotogramas individuales de comportamiento se capturen para la manipulación del ordenador. Los ratones son extremadamente versátiles y pueden mostrar un comportamiento compensatorio después de casi cualquier tratamiento. La ambiguidad puede existir sobre cada parte del cuerpo en movimiento⁴. Por lo tanto, el análisis de algunos comportamientos puede requerir una resolución aún mayor y cámaras de mayor velocidad.

Las conductas sexuales masculinas en ratones se ven afectadas por muchos factores, incluyendo diferencias de tensión, cambios hormonales y mutanticiones genéticas^1,3,9,10. McGill y Blight¹¹ ilustraron las diferencias de tensión en los comportamientos de acoplamiento del ratón. Por ejemplo, los machos C57BL/6 suelen obtener intromisión rápidamente y eyacular en unos 20 min^11. Los machos DBA/2 tardan en obtener intromisión, pero eyaculan rápidamente. Los machos BALB/c son lentos para lograr la eyaculación (latencia media de 1 h) debido a un largo período de cortejo¹¹. Testosterona facilita y mantiene el comportamiento sexual masculino², y los cambios en los niveles de testosterona pueden alterar el rendimiento del comportamiento sexual¹². Tanto la castración quirúrgica como el tratamiento antiandrógeno pueden reducir el nivel de testosterona y resultar en una rápida disminución de las conductas sexuales e incluso la motivación sexual y la excitación sexual^13. La testosterona administrada puede restaurar comportamientos precopulatorios y copulatorios en ratones castrados. Por último, los ratones noqueadores y knockdowns muestran diferencias en las facetas de los comportamientos sexuales en comparación con los ratones de tipo salvaje. Por ejemplo, los ratones machos con mutaciones específicas de Adcy3, Cnga2 y Gnao exhiben una capacidad reducida para detectar feromonas, mientras que los ratones noqueadores Trpc2 muestran la preferencia alterada de la pareja^14,15,16. Otros efectos de los transgénicos y nocauts en el comportamiento sexual de los ratones se explican por Crawley³.

Aquí, se describe uno de los procedimientos más comunes para evaluar el comportamiento sexual en el emparejamiento de un ratón masculino con una hembra ovariectomizada que ha sido preparada hormonalmente para ser receptiva. Se presenta un protocolo experimental para llevar a cabo experimentos de comportamiento sexual en ratones. Además, se muestra un ejemplo de cambio de patrones de comportamiento sexual resultantes del aislamiento social en ratones CD-1.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de conformidad con las directrices de los Principios de Cuidado Animal de Laboratorio (NiH Publication No 80-23, revisada en 1996) y bajo la aprobación y supervisión del Centro Animal Experimental del Instituto de Medicamentos Desarrollo Vegetal (China).

1. La cría de animales

1. Casa de ratones hembra y macho a 25oC durante ciclos oscuros de 12 h de luz/12 h.
2. Proporcionar acceso gratuito al agua y una dieta estándar de pelleted.
3. Permita que los ratones se aclimaten a su entorno durante 7 días antes de la operación si son transportados desde una instalación diferente.

2. Ovariectomía en ratones hembra

1. Anestesia rinde a la hembra (8 semanas después del natal, no menos de 6 semanas de edad) con isoflurano (4-5% para la inducción, -1-2% para el mantenimiento) en oxígeno del 100% a través de una máscara de cono facial.
2. Compruebe que se ha alcanzado la profundidad adecuada de la estesia asegurándose de que no haya movimientos voluntarios durante más de 30 s, en combinación con una frecuencia respiratoria adecuada (por ejemplo, 1 respiración por 2 s o más). Alternativamente, pruebe la respuesta del ratón a una presión suave en los dedos de los pies de las patas traseras.
   NOTA: La frecuencia respiratoria normal es de 180 euros/min. Una caída de la tasa del 50% es aceptable durante la anestesia¹⁷.
   1. Use pomada oftálmica para prevenir el secado de la córnea y traumatismo ocular mientras está bajo anestesia.
   2. Mantenga la temperatura corporal del ratón a 36 oC o por encima de ella. Proporcionar soporte térmico suplementario durante el período de anestesia cuando sea necesario.
3. Esterilice y desinfecte todos los instrumentos quirúrgicos y superficies duras de la mesa de operación con 75% de etanol antes de su uso.
4. Coloque el animal sobre una cortina estéril.
5. Afeitar el pelaje bilateralmente sobre la columna lumbar en la parte posterior del ratón para exponer la piel.
6. Esterilice la piel expuesta con 75% de etanol.
7. Haga una sola incisión de la línea media (alrededor de 0,5 cm de longitud) en la parte posterior desde el centro de las dos raíces del muslo hacia la cabeza de 1 cm de distancia (la posición se muestra en la Figura 1).
8. Utilice tijeras pequeñas para penetrar la piel para liberar suavemente el tejido subcutáneo del músculo subyacente con el fin de exponer la capa muscular.
9. Localice el ovario debajo de la capa muscular delgada y haga una pequeña incisión (alrededor de 5 mm de longitud) para entrar en la cavidad peritoneal.
   1. Utilice pinzas pequeñas para tirar del tejido ligeramente en el lado izquierdo de la cavidad abdominal para mostrar el envoltorio del ovario de la mano izquierda alrededor del tejido adiposo blanco (una masa translúcida e irregular como se ve a simple vista, ver Figura 1).
10. Retirar la almohadilla de grasa ovárica que rodea el ovario con fórceps contundentes para exponer el oviducto.
11. Realice una sola ligadura alrededor del oviducto para prevenir el sangrado.
12. Use tijeras pequeñas para cortar el oviducto suavemente y retire el ovario.
13. Revise el oviducto cuidadosamente para confirmar que se extraen todos los tejidos ováricos. El ovario es de unos 5 mm a 4 mm a 3 mm con nódulos irregulares en la superficie.
14. Coloque la parte restante del oviducto de nuevo en la cavidad abdominal.
15. Sutura rinde la capa muscular con suturas absorbibles.
16. Tire de la piel hacia el lado derecho para exponer la capa muscular en el lado derecho y retire el ovario derecho repitiendo los pasos 2.9–2.16.
17. Cierre la incisión cutánea utilizando suturas absorbibles.
    1. Inyectar cada ratón por vía intraperitoneal con penicilina sódica (10.000 unidades/10 g por ratón) para evitar la infección.
    2. Inyectar lidocaína (4 mg/kg, 0,4 ml/kg de una solución al 1%) debajo de la piel a lo largo del sitio de la incisión. También proporcionar ibuprofeno (50–60 mg/kg/día; 10 ml de Motrin para niños en 500 ml de agua) continuamente en el agua potable durante 3 días para el tratamiento del dolor.
18. Coloque cada ratón en una jaula esterilizada individualmente.
19. Mantener bajo observación cercana durante aproximadamente 1-2 h hasta que se recupere completamente de la anestesia.
    1. Recuperar animales con toallas de papel en una jaula limpia sin ropa de cama. Este paso minimiza el riesgo de obstrucción traqueal o neumonía. Proporcionar soporte térmico suplementario durante la recuperación anestésica. Supervise el sitio quirúrgico para evitar la rotura de la herida.
20. Después del período de recuperación (aproximadamente 24 h después de la cirugía), coloque los ratones de vuelta a su jaula de origen.
21. No realice el experimento durante al menos 2 semanas después de la cirugía.

3. Estrus inducido por hormonas en las hembras

1. Determinar la etapa estrosa de las hembras mediante la realización de un frotis vaginal como se describe en McLean et al.¹⁸. Ningún cambio en el ciclo de estrus indica que la ovariectomía de la hembra tuvo éxito.
2. Inyectar benzoato de estradiol (20 g por ratón, disuelto en 0,1 ml de aceite de oliva esterilizado, intraperitonealmente) 48 h antes de la prueba de comportamiento sexual.
3. Inyectar progesterona (500 g por ratón, disuelto en 0,1 ml de aceite, intraperitoneal) 4 horas antes de la prueba de comportamiento sexual.
   NOTA: La elegibilidad de una hembra estrus está determinada por la hembra que acepta la inserción genital de un ratón macho 3 o más veces, cuando conviven con un macho sexualmente activo y experimentado en una jaula.

4. Preparación para la prueba de comportamiento sexual

1. Realizar la prueba de comportamiento sexual de ratones machos en una caja rectangular y de campo abierto (40 cm x 40 cm x 40 cm) con paredes de plexiglás negro, a excepción de una pared frontal transparente que permite la observación del movimiento del ratón.
2. Ajuste la iluminación general de la habitación a 650 lux.
   NOTA: Los ratones no deben iluminarse directamente para evitar patrones de comportamiento anormales.
3. Utilice una cámara digital conectada a un ordenador para grabar en vídeo el movimiento y el comportamiento de los ratones.
4. Realizar la prueba de comportamiento en los ratones machos durante las primeras horas del ciclo oscuro.

5. Habituación

1. Mantenga la sala de experimentos en silencio.
2. Coloque los ratones a probar en el centro de la caja de campo abierto, lo que les permite explorar el entorno libremente durante 30 minutos.
3. Habituate ratones durante 2 días consecutivos antes del día de prueba en el aparato para evitar el estrés del nuevo entorno.
   NOTA: Los ratones deben moverse y explorar libremente sin sentir estrés. Tanto los ratones machos como los machos deben habituarse en el entorno de pruebas.

6. Ensayos conductuales

1. Encienda la cámara antes del comienzo de la prueba.
2. Coloque el ratón que se va a probar en el centro del campo abierto en el cuadro de prueba, lo que permite una exploración gratuita durante 5 minutos para aclimatarse al entorno.
3. Coloque una hembra en estrus en la caja de prueba.
4. Registre los comportamientos sociales y de apareamiento y las interacciones entre los ratones masculinos y femeninos durante 30 min.
5. Apague la cámara y confirme que el vídeo está guardado.
6. Saque a la hembra de la caja de prueba y registre la formación de un tapón vaginal.
   NOTA: Un ratón femenino que aceptó el apareamiento no puede ser empleado en otra prueba de comportamiento sexual en un día.
7. Coloque a la hembra de vuelta a su jaula.
8. Devuelva al macho a su jaula.
9. Limpie la orina, las heces y el relleno dentro del aparato.
10. Elimine el olor de los ratones probados con un 75% de etanol.
11. Comience la prueba del siguiente ratón macho repitiendo los pasos 6.1–6.10.

7. Extracción de datos conductuales

1. Reproduzca la grabación de vídeo y extraiga los parámetros de comportamiento (consulte la figura 2).
   1. Registre el número de monturas en 30 min.
   2. Registre el número de intromisiones en 30 min. Cuente un empuje pélvico como una intromisión.
   3. Registre el tiempo desde la introducción de la hembra hasta el primer montaje como latencia de montaje.
   4. Registre el tiempo desde la introducción de la hembra hasta la primera intromisión como latencia de intromisión.
   5. Registre el tiempo desde la primera introducción hasta la primera eyaculación como latencia de eyaculación.
   6. Registre el tiempo desde la eyaculación hasta el siguiente montaje como latencia de montaje post-eyaculatorio.
   7. Número récord de series de cópula en 30 min. Una serie copulatoria es cada secuencia desde el montaje hasta la eyaculación.
   8. Registre el tiempo de todas las series de cópulatos en 30 minutos como la duración de la serie de cópulatorio.

Resultados

Se muestra una comparación del comportamiento sexual entre ratones CD-1 criados en aislamiento y ratones CD-1 alojados en grupo. Los ratones CD-1 machos fueron asignados aleatoriamente a un grupo de aislamiento (IS, un ratón por jaula, n a 30) y a un grupo alojado en grupo (GH, cinco ratones por jaula, n a 15). Los ratones se sometieron a una crianza aislada desde el día 23 postnatal hasta el día 93. Luego, ambos grupos de ratones fueron evaluados por comportamiento sexual. Nuestro estudio encontró que la tasa de é...

Discusión

Hay algunos pasos críticos en el protocolo presentado. En cuanto a la ovariectomía de las hembras, la apertura de la incisión quirúrgica desde la espalda es menos perjudicial que la del abdomen. Dado que la posición del ovario es profunda, tirar de otros órganos cuando la incisión se abre desde el abdomen a menudo conduce a sangrado y resulta en una visión quirúrgica poco clara²⁰. Realizamos la incisión en la espalda para llegar al ovario fácilmente y acortar el tiempo quirúrgico, así...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Choral hydrate	Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd.	20160225
Coated VICRYL Plus Sutures	Ethicon, Inc.	missing
Estradiol benzoate	J&K Scientific, Ltd.	L930Q170
Ethanol absolute	Beijing Chemical Works Co., Ltd.	20160715
Ibuprofen (Children's Motrin)	Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd.	160629478
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	217180501
Lidocaine	HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd.	1170506107
Male and female CD-1 mice	Vital River Beijing	SCXK()2013-0023
Olive oil
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd.	F5126420
Progesterone	J&K Scientific, Ltd.	LR50Q07
Sony digital camera	Sony Corporation	HDR-CX290E
Test box			DIY
ThinkStation Computer	Lenovo	S/N PCOGLQKG
Vaporizer for Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	E05904-009M