Valutazione del comportamento sessuale dei topi maschi

Riepilogo

In questo articolo viene descritto come eseguire test di comportamento sessuale nei topi maschi.

Abstract

Il comportamento sessuale è altamente specifico della specie. Anche se i roditori hanno comportamenti sessuali leggermente diversi, topi e ratti hanno un modello comportamentale sessuale simile. Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere il modello femminile estrus ovariato minoratizzato dall'ormone e la procedura sperimentale per la valutazione del comportamento sessuale dei topi maschi. Gli elementi comportamentali sessuali più importanti sono dimostrati nel video e nelle illustrazioni. I passaggi critici, vantaggi, e limitazioni del test di comportamento sessuale sono spiegati pure. Infine, vengono presentati i parametri di comportamento e si distinguono i processi di montaggio, intromissione ed eiaculazione nell'accoppiamento. I parametri comportamentali vengono valutati in termini di durata e conteggi durante il periodo di test.

Introduzione

Il comportamento sessuale nei topi maschi maturi deriva dall'interazione di una serie di sistemi ormonali e sistemi neurali correlati e interdipendenti in circuiti cerebrali diversi¹. Richiede anche esperienze di sviluppo, apprendimento, contesto e un partner appropriato. L'analisi comportamentale è una riflessione importante sulla funzione neurale o neurocrina. Quindi, studio sul comportamento sessuale su modelli animali è stato ampiamente utilizzato nelle neuroscienze comportamentali e altre ricerche correlate². L'etogramma dei comportamenti sessuali nei roditori è stato spiegato in molti articoli e libri^1,3,4. Per esempio, Scahs e Barfield descrizione del comportamento sessuale nel ratto⁵ ha aiutato a capire un modello comportamentale simile nei topi⁵. Il topo è uno dei soggetti più comunemente utilizzati per gli studi comportamentali. Hull et al.⁶ ha dato una presentazione dettagliata dei comportamenti sessuali del topo maschio: Quando un topo maschio incontra una femmina, inizia a indagare la regione anogenitale della femmina. Poi, il maschio preme le zampe anteriori contro i fianchi della femmina per montare la femmina dalla parte posteriore. La femmina presenta una caratteristica postura sessualmente ricettiva, piegando la colonna vertebrale verso il basso in un arco e muovendo la coda su un lato del corpo, esponendo un'introito di apertura per la penetrazione sessuale del maschio (cioè, lordosi). Dopo il montaggio, il maschio produce spinte pelviche rapide e poco profonde, seguite da spinte vaginali lente e profonde. Dopo numerose intromissioni, una spinta di lunga durata si traduce nell'eiaculazione dello sperma, durante la quale il topo maschio può congelare per circa 25 s prima di smontare o cadere dalla femmina⁶. All'eiaculazione le ghiandole accessorie del topo maschio possono produrre una miscela contenente sperma che si indurisce per formare la spina copulatoria. Infine, dopo l'eiaculazione, il maschio inizia la toelettatura genitale e mostra una mancanza di interesse per la femmina. In breve, la sequenza di base del comportamento sessuale maschile consiste nello sniffing, following, montaggio, intromissione, eiaculazione e toelettatura post-eiaculazione. Il comportamento sessuale del topo mostra differenze di tensione. Ad esempio, le latenze di eiaculazione vanno da 594 a 6943 s e il numero di intromissioni varia da 5 a più di 100. Le latenze post-eiaculazione vanno da 17 a 60 min. Tuttavia, l'introduzione di una nuova femmina può diminuire questo intervallo di tempo. In alcuni casi, il maschio eiacula alla prima intromissione con la nuova femmina⁷.

I principali eventi per la valutazione del comportamento sessuale sono il montaggio, l'intromissione e l'eiaculazione. Gli scienziati comportamentali hanno raccomandato la misurazione non solo della frequenza di ogni azione, ma anche della sua latenza e intervallo di tempo^5,8. Alcuni dei principali indicatori di misurazione negli studi precedenti includono: numero di supporti, numero di intromissioni, latenza di montaggio, latenza intromissione, latenza eiaculazione, latenza di montaggio post-eiaculatoria (o intervalli post-eiaculatori), latenza introtoriale post-eiaculatoria, numero di serie copulatorie e durata della serie coaculatoria. Park et al.⁸ e Sachs et al.⁵ hanno descritto come identificare ogni azione di montaggio, intromissione ed eiaculazione dei roditori. Il montaggio è definito come il maschio che monta la femmina dalla parte posteriore, palpando i fianchi con le zampe anteriori, e spingendo il pene rapidamente e ripetutamente senza inserimento del pene. L'introduzione, nota anche come inserimento del pene, è identificata da uno o più dei seguenti atti: una spinta lunga e profonda dopo rapide spinte poco profonde, un calcio rapido con una zampa posteriore e un marcato ritiro laterale del maschio dalla femmina. L'eiaculazione è identificata da una spinta pelvica terminale che è più lenta e profonda di quella di un'introduzione e una riduzione dell'elevazione della gamba posteriore. Una serie copulatoria è identificata da ogni sequenza dal montaggio all'eiaculazione. Le definizioni dei parametri comportamentali utilizzati nel presente studio sono elencate come segue: 1) Latenza di montaggio: il tempo dall'introduzione della femmina al primo montaggio del maschio; 2) Latenza di intromissione: il tempo dall'introduzione della femmina alla prima intromissione; 3) Latenza dell'eiaculazione: il tempo dalla prima intromissione alla prima eiaculazione (generalmente dopo l'ultima spinta pelvica); 4) Latenza di montaggio post-eiaculatoria: il tempo dall'eiaculazione al montaggio successivo; 5) Latenza intromissione post-eiculatoria: il tempo dall'eiaculazione e la successiva intromissione; 6) Numero di supporti: il numero di tempi di montaggio prima della prima eiaculazione; 7) Numero di intromissioni: il numero di intromissioni prima della prima eiaculazione; 8) Numero di serie copulatorie: il numero di serie copulatorie durante il periodo di osservazione; 9) Durata delle serie copulatorie: il tempo di tutte le serie copulatorie durante il periodo di osservazione.

Il comportamento sessuale e il comportamento correlato possono essere condotti nella gabbia di casa del maschio o in un'arena chiusa, tra i quali viene introdotto un apparato chiamato "No Secrets" scatola speculare di Rissman per osservare il comportamento di^{accoppiamento 3}. Una videocamera viene posizionata davanti alla scatola per registrare contemporaneamente l'azione dei topi da una vista laterale e attraverso uno specchio inclinato da una vista ventrale. Tuttavia, questo metodo richiede luci luminose, che inevitabilmente porta ad un'assuefazione più lunga al fine di eliminare lo stress ambientale nei topi. Per quanto riguarda il metodo di misurazione, si raccomanda l'analisi comportamentale basata su video per registrare e quantificare il comportamento⁴. Un videoregistratore con un'opzione di avanzamento video fotogramma per fotogramma con velocità consigliate per l'otturatore superiori a 1/1000 s può essere utilizzato per registrare i movimenti rapidi del mouse. La fotocamera a infrarossi ad alta risoluzione è necessaria durante la registrazione in un ambiente buio. Per analizzare la pellicola, è necessario un computer con un frame grabber per consentire l'acquisizione dei singoli fotogrammi di comportamento per la manipolazione del computer. I topi sono estremamente versatili e possono mostrare un comportamento compensativo dopo quasi ogni trattamento. Possono esistere ambiguità su ogni parte⁴del corpo in movimento. Quindi, l'analisi di alcuni comportamenti può richiedere una risoluzione ancora maggiore e autovelox.

I comportamenti sessuali maschili nei topi sono influenzati da molti fattori, tra cui differenze di ceppo, cambiamenti ormonali e mutanti genici^1,3,9^,10. McGill e Blight¹¹ hanno illustrato le differenze di deformazione nei comportamenti di accoppiamento del topo. Ad esempio, i maschi C57BL/6 in genere acquisiscono intromissione rapidamente ed eiaculare in circa 20 min¹¹. I maschi DBA/2 sono lenti ad ottenere l'intromissione ma eiaculare rapidamente. I maschi BALB/c sono lenti a raggiungere l'eiaculazione (latenza media di 1 h) a causa di un lungo periodo di corteggiamento¹¹. Il testosterone facilita e mantiene il comportamento sessuale maschile², e cambiamenti nei livelli di testosterone possono alterare le prestazioni di comportamento sessuale¹². Sia la castrazione chirurgica e il trattamento antiandrogeno può ridurre il livello di testosterone e provocare un rapido declino dei comportamenti sessuali e anche la motivazione sessuale e l'eccitazione sessuale¹³. Il testosterone somministrato può ripristinare comportamenti prepulpulatori e copulatori nei topi castrati. Infine, i topi knockout e knockdown mostrano differenze nelle sfaccettature dei comportamenti sessuali rispetto ai topi di tipo selvaggio. Ad esempio, i topi maschi con mutazioni mirate di Adcy3, Cnga2 e Gnao presentano una ridotta capacità di rilevare i feromoni, mentre i topi knockout Trpc2 mostrano alterata preferenza partner^14,15,16. Altri effetti della transgenica e knockout sul comportamento sessuale dei topi sono spiegati da Crawley³.

Qui, viene descritta una delle procedure più comuni per valutare il comportamento sessuale nell'accoppiamento di un topo maschio con una femmina ovarictomizzata che è stata ormonalemente innescata per essere ricettiva. Viene presentato un protocollo sperimentale per condurre esperimenti di comportamento sessuale nei topi. Inoltre, viene mostrato un esempio di cambiamento dei modelli di comportamento sessuale derivanti dall'isolamento sociale nei topi CD-1.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati nel rispetto delle linee guida dei Principi di Cura Animale di Laboratorio (Pubblicazione NIH n. 80-23, rivista 1996) e sotto l'approvazione e la supervisione dell'Accademia del Centro Animale Sperimentale dell'Istituto di Medicinale Sviluppo delle piante (Cina).

1. Allevamento di animali

1. Casa topi di sesso femminile e maschile a 25 gradi centigradi per cicli scuri 12 h luce/12 h.
2. Fornire libero accesso all'acqua e una dieta pelleta standard.
3. Lasciare che i topi si acclimatino al loro ambiente per 7 giorni prima dell'operazione se trasportati da un impianto diverso.

2. Ovariectomia nei topi femminili

1. Anestesizza la femmina (8 settimane postnatale, non meno di 6 settimane di età) con isoflurano (4-5% per l'induzione, 1-2% per la manutenzione) in ossigeno al 100% tramite una maschera di cono facciale.
2. Verificare che la profondità appropriata dell'estesia sia stata raggiunta assicurandosi che non vi siano movimenti volontari per oltre 30 s, in combinazione con una frequenza respiratoria appropriata (ad esempio, 1 respiro per 2 s o più). In alternativa, testare la risposta del mouse a una leggera pressione sulle punta delle zampe posteriori.
   NOTA: La normale frequenza respiratoria è di 180 USD/min. Un calo del tasso del 50% è accettabile durante l'anestesia¹⁷.
   1. Utilizzare unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione corneale e traumi agli occhi durante l'anestesia.
   2. Mantenere la temperatura corporea del mouse a o superiore a 36 gradi centigradi. Fornire supporto termico supplementare durante il periodo di anestesia quando necessario.
3. Sterilizzare e disinfettare tutti gli strumenti chirurgici e le superfici dure del tavolo operatorio con il 75% di etanolo prima dell'uso.
4. Mettere l'animale su un drappo sterile.
5. Rasare la pelliccia bilateralmente sopra la colonna lombare sul retro del mouse per esporre la pelle.
6. Sterilizzare la pelle esposta con il 75% di etanolo.
7. Fare una singola incisione mediana (circa 0,5 cm di lunghezza) sul retro dal centro delle due radici della coscia verso la testa di 1 cm di distanza (posizione è mostrato nella Figura 1).
8. Utilizzare piccole forbici per penetrare la pelle al tessuto sottocutaneo delicatamente libero dal muscolo sottostante al fine di esporre lo strato muscolare.
9. Individuare l'ovaio sotto il sottile strato muscolare e fare una piccola incisione (circa 5 mm di lunghezza) per ottenere l'ingresso alla cavità peritoneale.
   1. Utilizzare piccole pinzette per tirare leggermente il tessuto sul lato sinistro della cavità addominale per mostrare l'avvolgimento dell'ovaio sinistro intorno al tessuto adiposo bianco (una massa irregolare traslucida come visto dall'occhio nudo, vedi Figura 1).
10. Ritirare il cuscinetto di grasso ovarico che circonda l'ovaio con pinze smussate per esporre l'ovidotto.
11. Eseguire una singola legatura intorno all'oldotto per prevenire il sanguinamento.
12. Utilizzare piccole forbici per recidere delicatamente l'ovidotto e rimuovere l'ovaio.
13. Controllare attentamente l'ovidotto per confermare che tutti i tessuti ovarici siano stati rimossi. L'ovaio è di circa 5 mm x 4 mm e 3 mm con noduli irregolari sulla superficie.
14. Riposizionare la parte restante dell'ovidotto nella cavità addominale.
15. Suturare lo strato muscolare con suture assorbibili.
16. Tirare la pelle sul lato destro per esporre lo strato muscolare sul lato destro e rimuovere l'ovaio destro ripetendo i passi 2.9–2.16.
17. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando suture assorbibili.
    1. Iniettare ogni topo intraperitonealmente con sodio di penicillina (10.000 unità / 10 g per mouse) per prevenire l'infezione.
    2. Iniettare lidocaina (4 mg/kg, 0,4 mL/kg di una soluzione dell'1%)) sotto la pelle lungo il sito dell'incisione. Fornire anche ibuprofene (50-60 mg/kg/giorno; 10 mL di Motrin per bambini in 500 mL di acqua) continuamente in acqua potabile per 3 giorni per il trattamento del dolore.
18. Posizionare ogni topo in una gabbia sterilizzata singolarmente.
19. Tenere sotto stretta osservazione per circa 1-2 h fino a quando completamente recuperato dall'anestesia.
    1. Recuperare gli animali su asciugamani di carta in una gabbia pulita senza biancheria da letto. Questo passaggio riduce al minimo il rischio di ostruzione tracheale o polmonite. Fornire supporto termico supplementare durante il recupero anestetico. Monitorare il sito chirurgico per prevenire la rottura della ferita.
20. Dopo il periodo di recupero (circa 24 h dopo l'intervento chirurgico), riporre i topi nella loro gabbia di casa.
21. Non eseguire l'esperimento per almeno 2 settimane dopo l'intervento chirurgico.

3. Estrus ormonale indotto nelle femmine

1. Determinare lo stadio estrous delle femmine eseguendo uno striscio vaginale come descritto in McLean et al.¹⁸. Nessun cambiamento di ciclo estrus indica che l'ovariectomia della femmina ha avuto successo.
2. Iniettare benzoato estradiol (20 g per topo, disciolto in 0,1 mL di olio d'oliva sterilizzato, intraperitonealmente) 48 h prima del test del comportamento sessuale.
3. Iniettare il progesterone (500 g per topo, sciolto in 0,1 mL di olio, intraperitamente) 4 h prima del test del comportamento sessuale.
   NOTA: L'ammissibilità di una femmina erusiè è determinata dall'inserimento genitale di un topo maschio 3 o più volte, quando convivono con un maschio sessualmente attivo ed esperto in una gabbia.

4. Preparazione per il test del comportamento sessuale

1. Condurre il test di comportamento sessuale dei topi maschi in una scatola di campo rettangolare e aperta (40 cm x 40 cm x 40 cm) con pareti in plexiglass nero, ad eccezione di una parete anteriore trasparente che consente l'osservazione del movimento del mouse.
2. Impostare l'illuminazione generale della stanza a 650 lux.
   NOTA: i topi non devono essere illuminati direttamente per evitare comportamenti anomali.
3. Utilizzare una fotocamera digitale collegata a un computer per registrare il movimento e il comportamento dei mouse.
4. Eseguire il test comportamentale sui topi maschi durante le prime ore del ciclo scuro.

5. L'abitudine

1. Tieni la stanza degli esperimenti tranquilla.
2. Posizionare i topi da testare al centro della scatola di campo aperta, permettendo loro di esplorare l'ambiente liberamente per 30 min.
3. Topi abituati per 2 giorni consecutivi prima della giornata di prova nell'apparecchio per evitare stress dal nuovo ambiente.
   NOTA: I topi dovrebbero muoversi ed esplorare liberamente senza sentire stress. Sia i topi maschi che quelli femminili devono essere abituati all'ambiente di test.

6. Saggi comportamentali

1. Accendere la fotocamera prima dell'inizio del test.
2. Posizionare il mouse da testare al centro del campo aperto nella scatola di prova, consentendo l'esplorazione gratuita per 5 min per acclimatarsi all'ambiente.
3. Inserire una femmina in estrus nella scatola di prova.
4. Registrare i comportamenti sociali e di accoppiamento e le interazioni tra i topi maschi e femmine per 30 min.
5. Spegnere la fotocamera e verificare che il video sia stato salvato.
6. Estrarre la femmina dalla scatola di prova e registrare la formazione di un tappo vaginale.
   NOTA: Un topo femmina che ha accettato l'accoppiamento non può essere impiegato in un altro test di comportamento sessuale in un giorno.
7. Riportare la femmina nella sua gabbia di casa.
8. Riporta il maschio alla sua gabbia di casa.
9. Pulire l'urina, le feci e l'imbottitura all'interno dell'apparecchio.
10. Rimuovere l'odore dei topi testati con 75% di etanolo.
11. Avviare il test del topo maschio successivo ripetendo i passaggi da 6.1 a 6,10.

7. Estrazione dei dati comportamentali

1. Riprodurre la registrazione video ed estrarre i parametri comportamentali (vedere Figura 2).
   1. Registrare il numero di supporti in 30 min.
   2. Registrare il numero di intromissioni in 30 min. Conte una spinta pelvica come intromissione.
   3. Registrare il tempo dall'introduzione della femmina al primo montaggio come latenza di montaggio.
   4. Registrare il tempo dall'introduzione della femmina alla prima introduzione come latenza di intromissione.
   5. Registrare il tempo dalla prima intromissione alla prima eiaculazione come latenza di eiaculazione.
   6. Registrare il tempo dall'eiaculazione al montaggio successivo come latenza di montaggio post-eiaculatoria.
   7. Numero record di serie copulatorie in 30 min. Una serie copulatoria è ogni sequenza dal montaggio all'eiaculazione.
   8. Registra il tempo di tutte le serie copulatorie in 30 min come la durata della serie copulatoria.

Risultati

Viene mostrato un confronto del comportamento sessuale tra topi CD-1 allevati in isolamento e topi CD-1 ospitati in gruppo. I topi maschi CD-1 sono stati assegnati in modo casuale in un gruppo allevato in isolamento (IS, un topo per gabbia, n - 30) e un gruppo di gruppo (GH, cinque topi per gabbia, n - 15). I topi sono stati sottoposti ad allevare in isolamento dal giorno postnatale 23 al giorno 93. Quindi, entrambi i gruppi di topi sono stati valutati per il comportamento sessuale. Il nostro studio ha rilevato che il ta...

Discussione

Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo presentato. Per quanto riguarda l'ovariectomia delle femmine, l'apertura dell'incisione chirurgica dalla schiena è meno dannosa di quella dell'addome. Dato che la posizione dell'ovaio è profonda, tirando altri organi quando l'incisione viene tagliata dall'addome spesso porta a sanguinamento e si traduce in visione chirurgica poco chiara²⁰. Abbiamo eseguito l'incisione sulla schiena per raggiungere facilmente l'ovaio e accorciare il tempo chirurgico,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Choral hydrate	Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd.	20160225
Coated VICRYL Plus Sutures	Ethicon, Inc.	missing
Estradiol benzoate	J&K Scientific, Ltd.	L930Q170
Ethanol absolute	Beijing Chemical Works Co., Ltd.	20160715
Ibuprofen (Children's Motrin)	Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd.	160629478
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	217180501
Lidocaine	HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd.	1170506107
Male and female CD-1 mice	Vital River Beijing	SCXK()2013-0023
Olive oil
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd.	F5126420
Progesterone	J&K Scientific, Ltd.	LR50Q07
Sony digital camera	Sony Corporation	HDR-CX290E
Test box			DIY
ThinkStation Computer	Lenovo	S/N PCOGLQKG
Vaporizer for Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	E05904-009M