Bewertung des Sexualverhaltens männlicher Mäuse

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt, wie sexuelle Verhaltenstests bei männlichen Mäusen durchzuführen.

Zusammenfassung

Sexuelles Verhalten ist sehr artspezifisch. Obwohl Nagetiere leicht unterschiedliche sexuelle Verhaltensweisen haben, haben Mäuse und Ratten ein ähnliches Sexualverhalten. Der Zweck dieses Artikels ist es, das hormoninduzierte estrus ovariectomisierte weibliche Modell und das experimentelle Verfahren zur Beurteilung des Sexualverhaltens von männlichen Mäusen zu beschreiben. Die wichtigsten sexuellen Verhaltenselemente werden in den Videos und Illustrationen gezeigt. Die kritischen Schritte, Vorteile und Einschränkungen des Sexualverhaltenstests werden ebenfalls erklärt. Schließlich werden die Verhaltensparameter vorgestellt, und Montage-, Intromission- und Ejakulationsprozesse bei der Paarung werden unterschieden. Verhaltensparameter werden anhand der aufgetretenen Dauer und Anzahl während des Testzeitraums bewertet.

Einleitung

Sexuelles Verhalten bei reifen männlichen Mäusen resultiert aus der Interaktion einer Reihe verwandter und voneinander abhängiger Hormonsysteme und neuronaler Systeme in verschiedenen Gehirnkreisen¹. Es erfordert auch Entwicklungserfahrungen, Lernen, Kontext und einen geeigneten Partner. Verhaltensanalyse ist eine wichtige Reflexion über neuronale oder neurokrine Funktion. Daher wurde Sexualverhaltensstudie an Tiermodellen weit verbreitet in der Verhaltensneurowissenschaft und anderen verwandten^Forschungeneingesetzt 2 . Das Ethogramm des Sexualverhaltens bei Nagetieren wurde in vielen Artikeln und Büchern^1,3,4erklärt. Zum Beispiel hat Scahs und Barfields Beschreibung des Sexualverhaltens in der Ratte⁵ dazu beigetragen, ein ähnliches Verhaltensmuster bei Mäusen zu verstehen⁵. Die Maus ist eines der am häufigsten verwendeten Themen für Verhaltensstudien. Hull et al.⁶ gab eine detaillierte Einführung des männlichen Maus-Sexualverhaltens: Wenn eine männliche Maus auf ein Weibchen trifft, beginnt sie, die anogenitale Region des Weibchens zu untersuchen. Dann drückt das Männchen seine Vorderpfoten gegen die Flanken des Weibchens, um das Weibchen von hinten zu montieren. Das Weibchen zeigt eine charakteristische sexuell empfängliche Haltung, biegt seine Wirbelsäule in einen Bogen und bewegt seinen Schwanz auf eine Seite des Körpers, wodurch ein öffnendes Introitus für die sexuelle Penetration des Männchens (d.h. Lordose) freigelegt wird. Nach der Montage macht das Männchen schnelle, flache Beckenstöße, gefolgt von langsamen und tiefen vaginalen Stößen. Nach zahlreichen Intromissionen, ein lang anhaltender Schub führt zur Ejakulation des Samens, während der die männliche Maus für etwa 25 s einfrieren kann, bevor sie demontiert oder von der weiblichen⁶abfällt. Bei der Ejakulation kann die männliche Maus Zubehör Drüsen eine Mischung mit Sperma produzieren, die aushärtet, um den kopulatorischen Stecker zu bilden. Schließlich, nach der Ejakulation, das Männchen beginnt Genitalpflege und zeigt ein mangelndes Interesse an der frau. Kurz gesagt, die grundlegende Sequenz des männlichen Sexualverhaltens besteht aus Schnüffeln, Folgen, Montage, Intromission, Ejakulation, und Post-Ejakulation Pflege. Das sexuelle Verhalten der Maus weist Dehnungsunterschiede auf. Zum Beispiel, Ejakulation Latencies reichen von 594 bis 6943 s, und die Anzahl der Intromissionen reichen von 5 bis mehr als 100. Post-Ejakulation Latencies reichen von 17 bis 60 min. Die Einführung eines neuartigen Weibchens kann dieses Zeitintervall jedoch verringern. In einigen Fällen ejakuliert das Männchen bei der ersten Intromission mit dem neuen Weibchen⁷.

Die wichtigsten Ereignisse für die Bewertung des Sexualverhaltens sind Montage, Intromission, und Ejakulation. Verhaltensforscher haben die Messung nicht nur der Häufigkeit jeder Aktion empfohlen, sondern auch deren Latenz und Zeitintervall^5,8. Einige wichtige Messindikatoren in früheren Studien sind: Anzahl der Reittiere, Anzahl der Intromissionen, Mount Latenz, Intromission Latenz, Ejakulation Latenz, post-ejakulation Mount Latenz (oder post-ejakulationsintervalle), post-ejakulation Latenz, Anzahl der kopulatorischen Reihen, und Dauer der kopulatorischen Serie. Park et al.⁸ und Sachs et al.⁵ beschrieben, wie man jede Aktion der Montage, Intromission und Ejakulation von Nagetieren zu identifizieren. Die Montage ist definiert als das Männchen, das das Weibchen von hinten montiert, ihre Flanken mit seinen Vorderbeinen palpatiert und seinen Penis schnell und wiederholt ohne Peniseinfügung schubt. Die Intromission, auch bekannt als Peniseinfügung, wird durch einen oder mehrere der folgenden Handlungen identifiziert: ein langer, tiefer Schub nach schnellen flachen Stößen, ein schneller Tritt mit einem Hinterbein und ein deutlicher seitlicher Rückzug des Männchens vom Weibchen. Ejakulation wird durch eine terminale Beckenschub identifiziert, die langsamer und tiefer als die einer Intromission und eine Verringerung der Höhe des Hinterbeins ist. Eine kopulatorische Serie wird durch jede Sequenz von der Montage bis zur Ejakulation identifiziert. Die Definitionen der Verhaltensparameter, die in der vorliegenden Studie verwendet werden, sind wie folgt aufgeführt: 1) Montagelatenz: die Zeit von der Einführung des Weibchens bis zur ersten Montage des Männchens; 2) Intromission Latenz: die Zeit von der Einführung des Weibchens zur ersten Intromission; 3) Ejakulation Latenz: die Zeit von der ersten Intromission bis zur ersten Ejakulation (in der Regel nach dem letzten Beckenschub); 4) Post-Ejakulation Mount Latenz: die Zeit von der Ejakulation zur nächsten Montage; 5) Post-Ejakulation Intromission Latenz: die Zeit von der Ejakulation und die nächste Intromission; 6) Anzahl der Halterungen: die Anzahl der Montagezeiten vor der ersten Ejakulation; 7) Anzahl der Intromissionen: die Anzahl der Intromissionen vor der ersten Ejakulation; 8) Anzahl der kopulatorischen Reihen: die Anzahl der kopulatorischen Reihen während des Beobachtungszeitraums; 9) Dauer der kopulatorischen Reihen: die Zeit aller kopulatorischen Reihen während des Beobachtungszeitraums.

Sexuelles Verhalten und damit zusammenhängendes Verhalten können entweder im Hauskäfig des Männchens oder in einer geschlossenen Arena durchgeführt werden, unter denen ein Apparat namens Rissmans "No Secrets" gespiegelte Box eingeführt wird, um das Paarungsverhalten zu beobachten³. Eine Videokamera wird vor der Box platziert, um gleichzeitig die Wirkung der Mäuse aus einer seitlichen Ansicht und durch einen geneigten Spiegel aus einer ventralen Ansicht aufzuzeichnen. Diese Methode erfordert jedoch helle Lichter, was unweigerlich zu längeren Gewöhnung führt, um Umweltbelastungen bei Mäusen zu beseitigen. Was die Messmethode betrifft, so wird eine videobasierte Verhaltensanalyse empfohlen, um^dasVerhalten 4 aufzuzeichnen und zu quantifizieren. Ein Videorecorder mit einer Frame-by-Frame-Video-Advance-Option mit empfohlenen Verschlusszeiten größer als 1/1000 s kann verwendet werden, um schnelle Mausbewegungen aufzuzeichnen. Die hochauflösende Infrarotkamera ist bei aufnahmen in einer dunklen Umgebung notwendig. Um den Film zu analysieren, ist ein Computer mit einem Framegrabber erforderlich, damit die einzelnen Verhaltensbilder für computermanipulierte Bilder erfasst werden können. Mäuse sind extrem vielseitig und können nach fast jeder Behandlung kompensatorisches Verhalten zeigen. Mehrdeutigkeit kann über jeden beweglichen Körper Teil⁴existieren. Daher kann die Analyse einiger Verhaltensweisen eine noch höhere Auflösung und höhere Blitzer erfordern.

Männliche Sexuelle Verhaltensweisen bei Mäusen werden von vielen Faktoren beeinflusst, einschließlich Dehnungsunterschiede, Hormonveränderungen, und Gen-Mutationen^1,3,9,10. McGill und Blight¹¹ veranschaulichten die Dehnungsunterschiede im Paarungsverhalten der Maus. Zum Beispiel, C57BL/6 Männchen gewinnen in der Regel Intromission schnell und ejakulieren in etwa 20 min¹¹. DBA/2 Männchen sind langsam, um Intromission zu gewinnen, aber schnell ejakulieren. BALB /c Männer sind langsam, um Ejakulation zu erreichen (durchschnittliche Latenz von 1 h) aufgrund einer langen Zeit der Balz¹¹. Testosteron erleichtert und hält männliches Sexualverhalten², und Veränderungen im Testosteronspiegel können sexuelles Verhalten Leistung ändern¹². Sowohl chirurgische Kastration und Antiandrogen-Behandlung kann das Niveau von Testosteron zu reduzieren und führen zu einem schnellen Rückgang des Sexualverhaltens und sogar sexuelle Motivation und sexuelle Erregung¹³. Verabreichtes Testosteron kann präkopulatorisches und kopulatorisches Verhalten bei kastrierten Mäusen wiederherstellen. Schließlich zeigen Knockout- und Knockdown-Mäuse Unterschiede in den Facetten des Sexualverhaltens im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Zum Beispiel zeigen männliche Mäuse mit gezielten Mutationen von Adcy3, Cnga2 und Gnao eine verminderte Fähigkeit, Pheromone zu erkennen, während Trpc2 Knockout-Mäuse veränderte Partnerpräferenz^14,15,16zeigen. Andere Auswirkungen von Transgenen und Knockouts auf das Sexualverhalten von Mäusen werden durch Crawley³erklärt.

Hier wird eines der häufigsten Verfahren zur Beurteilung des Sexualverhaltens in der Paarung einer männlichen Maus mit einem eialisierten Weibchen beschrieben, das hormonell grundiert wurde, um empfänglich zu sein. Ein experimentelles Protokoll wird für die Durchführung von Sexualverhaltensexperimenten an Mäusen vorgelegt. Darüber hinaus wird ein Beispiel für sich verändernde Sexualverhaltensmuster gezeigt, die sich aus der sozialen Isolation von CD-1-Mäusen ergeben.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Prinzipien der Labortierpflege (NIH-Publikation Nr. 80-23, überarbeitet 1996) und unter der Genehmigung und Aufsicht der Akademie für Experimentelle Tierhaltung des Instituts für Medizinische Pflanzenentwicklung (China).

1. Tierhaltung

1. Haus weibliche und männliche Mäuse bei 25 °C für 12 h licht/12 h dunkle Zyklen.
2. Sie bieten freien Zugang zu Wasser und eine Standard-Pellet-Diät.
3. Lassen Sie Mäuse 7 Tage vor dem Einsatz in ihre Umgebung einarbeiten, wenn sie von einer anderen Anlage transportiert werden.

2. Ovariektomie bei weiblichen Mäusen

1. Anästhetisieren Sie das Weibchen (8 Wochen postnatal, nicht weniger als 6 Wochen alt) mit Isofluran (bei Induktion 4,5 %, 1 ,2 % für die Wartung) in 100% Sauerstoff über eine Gesichtskegelmaske.
2. Stellen Sie sicher, dass die angemessene Tiefe der Ästhesie erreicht wurde, indem Sie sicherstellen, dass es keine freiwilligen Bewegungen für über 30 s in Kombination mit einer angemessenen Atemfrequenz (z. B. 1 Atemzug pro 2 s oder länger) gibt. Alternativ können Sie die Reaktion der Maus auf sanften Druck auf die Zehen der Hinterpfoten testen.
   HINWEIS: Die normale Atemfrequenz beträgt 180 €/min. Ein Kursrückgang von 50% ist während der Anästhesie¹⁷akzeptabel.
   1. Verwenden Sie ophthalmologische Salbe, um Hornhauttrocknung und Augentrauma während der Anästhesie zu verhindern.
   2. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus bei oder über 36 °C. Bieten Sie zusätzliche Wärmeunterstützung während der Zeit der Anästhesie, wenn nötig.
3. Sterilisieren und desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente und harten Oberflächen des Operationstisches mit 75% Ethanol vor der Verwendung.
4. Das Tier auf einen sterilen Vorhang legen.
5. Rasieren Sie Pelz bilateral über die Lendenwirbelsäule auf der Rückseite der Maus, um die Haut zu belichten.
6. Sterilisieren Sie die exponierte Haut mit 75% Ethanol.
7. Machen Sie einen einzelnen Mittellinienschnitt (ca. 0,5 cm Länge) auf der Rückseite von der Mitte der beiden Oberschenkelwurzeln in Richtung des Kopfes von 1 cm Abstand (Position ist in Abbildung 1dargestellt).
8. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Haut zu durchdringen, um subkutanes Gewebe sanft aus dem darunter liegenden Muskel zu befreien, um die Muskelschicht freizulegen.
9. Suchen Sie den Eierstock unter der dünnen Muskelschicht und machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm länge), um Zugang zur Peritonealhöhle zu erhalten.
   1. Verwenden Sie eine kleine Pinzette, um das Gewebe leicht auf der linken Seite der Bauchhöhle zu ziehen, um die linke Eierstock um das weiße Fettgewebe zu zeigen (eine durchscheinende, unregelmäßige Masse, wie sie mit bloßem Auge gesehen wird, siehe Abbildung 1).
10. Ziehen Sie das Eierstockfettpad, das den Eierstock umgibt, mit stumpfer Zange zurück, um das Eileiterzuband freizulegen.
11. Führen Sie eine einzelne Ligatur um das Eileiterdurchführen aus, um Blutungen zu verhindern.
12. Verwenden Sie eine kleine Schere, um den Oviktiv sanft zu trennen und den Eierstock zu entfernen.
13. Überprüfen Sie das Eileitersorgfältig, um zu bestätigen, dass alle Eierstockgewebe entfernt werden. Der Eierstock ist ca. 5 mm x 4 mm x 3 mm mit unregelmäßigen Knötchen auf der Oberfläche.
14. Legen Sie den restlichen Teil des Eileiters wieder in die Bauchhöhle.
15. Nahn die Muskelschicht mit resorbierbaren Nähten.
16. Ziehen Sie die Haut auf die rechte Seite, um die Muskelschicht auf der rechten Seite freizulegen, und entfernen Sie den rechten Eierstock, indem Sie die Schritte 2.9–2.16 wiederholen.
17. Schließen Sie den Hautschnitt mit resorbierbaren Nähten.
    1. Injizieren Sie jede Maus intraperitoneal mit Penicillin-Natrium (10.000 Einheiten/10 g pro Maus), um eine Infektion zu verhindern.
    2. Injizieren Sie Lidocain (4 mg/kg, 0,4 ml/kg einer 1%-Lösung) unter die Haut entlang der Stelle des Einschnitts. Bieten Sie auch Ibuprofen (50–60 mg/kg/Tag; 10 ml Kindermotrin in 500 ml Wasser) kontinuierlich im Trinkwasser für 3 Tage für die Schmerzbehandlung zur Verfügung.
18. Legen Sie jede Maus einzeln in einen sterilisierten Käfig.
19. Halten Sie unter genauer Beobachtung für etwa 1-2 h, bis vollständig von der Anästhesie erholt.
    1. Erholen Sie Tiere auf Papiertüchern in einem sauberen Käfig ohne Bettwäsche. Dieser Schritt minimiert das Risiko einer Trachealverstopfung oder Lungenentzündung. Bieten zusätzliche Wärmeunterstützung während der Anästhesie-Rückgewinnung. Überwachen Sie die chirurgische Stelle, um den Bruch der Wunde zu verhindern.
20. Nach der Erholungsphase (ca. 24 h nach der Operation) legen Sie die Mäuse wieder in ihren heimischen Käfig.
21. Führen Sie das Experiment nach der Operation mindestens 2 Wochen lang nicht durch.

3. Hormoninduzierte Estrus bei Frauen

1. Bestimmen Sie das estre Stadium der Weibchen, indem Sie einen vaginalen Abstrich durchführen, wie in McLean et al.¹⁸beschrieben. Keine Estrus-Zyklusänderung deutet darauf hin, dass die Ovariektomie des Weibchens erfolgreich war.
2. Injizieren Sie Estradiolbenzoat (20 g pro Maus, gelöst in 0,1 ml sterilisiertem Olivenöl, intraperitoneal) 48 h vor dem Sexualverhaltenstest.
3. Progesteron (500 g pro Maus, gelöst in 0,1 ml Öl, intraperitoneal) 4 h vor dem Sexualverhaltenstest injizieren.
   HINWEIS: Die Berechtigung eines Estrus-Weibchens wird dadurch bestimmt, dass das Weibchen die Genitaleinfügung einer männlichen Maus 3 oder mehr Mal akzeptiert, wenn sie mit einem sexuell aktiven und erfahrenen Männchen in einem Käfig zusammenleben.

4. Vorbereitung auf den Sexualverhaltenstest

1. Führen Sie den Sexualverhaltenstest männlicher Mäuse in einem rechteckigen und offenen Feldkasten (40 cm x 40 cm x 40 cm) mit schwarzen Plexiglaswänden durch, mit Ausnahme einer transparenten Frontwand, die die Beobachtung von Mausbewegungen ermöglicht.
2. Stellen Sie die allgemeine Raumbeleuchtung auf 650 Lux ein.
   HINWEIS: Die Mäuse sollten nicht direkt beleuchtet werden, um abnormale Verhaltensmuster zu vermeiden.
3. Verwenden Sie eine Miteinem Computer verbundene Digitalkamera, um die Bewegung und das Verhalten der Mäuse zu bedecken.
4. Führen Sie den Verhaltenstest an den männlichen Mäusen während der ersten Stunden des dunklen Zyklus durch.

5. Gewöhnung

1. Halten Sie den Experimentierraum ruhig.
2. Platzieren Sie die zu testenden Mäuse in der Mitte des offenen Feldkastens, so dass sie die Umgebung 30 min frei erkunden können.
3. Habituate Mäuse für 2 aufeinander folgende Tage vor dem Testtag im Gerät, um Stress aus der neuen Umgebung zu verhindern.
   HINWEIS: Mäuse sollten sich frei bewegen und erkunden, ohne Stress zu empfinden. Sowohl männliche als auch weibliche Mäuse müssen an die Testumgebung gewöhnt werden.

6. Verhaltensbezogene Assays

1. Schalten Sie die Kamera vor Beginn des Tests ein.
2. Platzieren Sie die zu prüfende Maus in der Mitte des offenen Feldes in der Testbox, so dass sie 5 min lang kostenlos an die Umwelt gegnet werden kann.
3. Legen Sie ein Weibchen in Estrus in den Testkasten.
4. Zeichnen Sie das soziale und Paarungsverhalten und die Wechselwirkungen zwischen den männlichen und weiblichen Mäusen für 30 min auf.
5. Schalten Sie die Kamera aus, und bestätigen Sie, dass das Video gespeichert ist.
6. Nehmen Sie das Weibchen aus der Testbox und zeichnen Sie die Bildung eines Vaginalsteckers auf.
   HINWEIS: Eine weibliche Maus, die paarte akzeptiert nicht in einem anderen Sexualverhaltenstest an einem Tag verwendet werden kann.
7. Legen Sie das Weibchen wieder in seinen Heimischen Käfig.
8. Bringen Sie das Männchen in seinen heimischen Käfig zurück.
9. Reinigen Sie den Urin, den Kot und die Polsterung im Gerät.
10. Entfernen Sie den Geruch der getesteten Mäuse mit 75% Ethanol.
11. Starten Sie den Test der nächsten männlichen Maus, indem Sie die Schritte 6.1–6.10 wiederholen.

7. Verhaltensdatenextraktion

1. Wiedergeben Sie die Videoaufzeichnung und extrahieren Sie die Verhaltensparameter (siehe Abbildung 2).
   1. Notieren Sie die Anzahl der Halterungen in 30 min.
   2. Notieren Sie die Anzahl der Intromissionen in 30 min. Zählen Sie einen Beckenschub als Intromission.
   3. Zeichnen Sie die Zeit von der Einführung des Weibchens bis zur ersten Montage als Montagelatenz auf.
   4. Zeichnen Sie die Zeit von der Einführung des Weibchens bis zur ersten Intromission als Intromission Latenz auf.
   5. Zeichnen Sie die Zeit von der ersten Intromission bis zur ersten Ejakulation als Ejakulation Latenz.
   6. Zeichnen Sie die Zeit von der Ejakulation bis zur nächsten Montage als post-ejakulation Mount Latenz.
   7. Rekordzahl der kopulatorischen Serie in 30 min. Eine kopulatorische Serie ist jede Sequenz von der Montage bis zur Ejakulation.
   8. Zeichnen Sie die Zeit aller kopulatorischen Serien in 30 min als Dauer der kopulatorischen Serie auf.

Ergebnisse

Ein Vergleich des Sexualverhaltens zwischen CD-1-Mäusen, die isoliert aufgezogen werden, und gruppengegnetten CD-1-Mäusen wird gezeigt. Männliche CD-1-Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip einer isolierten Gruppe (IS, eine Maus pro Käfig, n = 30) und einer Gruppengruppe (GH, fünf Mäuse pro Käfig, n = 15) zugeordnet. Die Mäuse wurden vom postnatalen Tag 23 bis zum Tag 93 isoliert aufgezogen. Anschließend wurden beide Gruppen von Mäusen auf sexuelles Verhalten untersucht. Unsere Studie ergab, dass die Erfolgsrate...

Diskussion

Es gibt einige wichtige Schritte im vorgestellten Protokoll. In Bezug auf die Eizellenvon Frauen ist die sich von hinten öffnende Operationsschnittöffnung weniger schädlich als die des Bauches. Da die Position des Eierstocks tief ist, führt das Ziehen anderer Organe, wenn der Schnitt aus dem Bauch herausgeschnitten wird, oft zu Blutungen und führt zu unklarem chirurgischen Sehvermögen²⁰. Wir führten den Schnitt auf dem Rücken durch, um den Eierstock leicht zu erreichen und die Operationsze...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Choral hydrate	Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd.	20160225
Coated VICRYL Plus Sutures	Ethicon, Inc.	missing
Estradiol benzoate	J&K Scientific, Ltd.	L930Q170
Ethanol absolute	Beijing Chemical Works Co., Ltd.	20160715
Ibuprofen (Children's Motrin)	Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd.	160629478
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	217180501
Lidocaine	HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd.	1170506107
Male and female CD-1 mice	Vital River Beijing	SCXK()2013-0023
Olive oil
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd.	F5126420
Progesterone	J&K Scientific, Ltd.	LR50Q07
Sony digital camera	Sony Corporation	HDR-CX290E
Test box			DIY
ThinkStation Computer	Lenovo	S/N PCOGLQKG
Vaporizer for Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	E05904-009M