Erkek Farelerin Cinsel Davranışlarının Değerlendirilmesi

Özet

Bu makalede, erkek farelerde cinsel davranış testleri nasıl yapılacağını açıklamaktadır.

Özet

Cinsel davranış türe özgüdür. Kemirgenler biraz farklı cinsel davranışlara sahip olsalar da, fareler ve sıçanlar benzer bir cinsel davranış düzenine sahiptir. Bu makalenin amacı, hormonkaynaklı estrus ovariectomized kadın modeli ve erkek farelerin cinsel davranışlarının değerlendirilmesi için deneysel prosedürü tanımlamaktır. En önemli cinsel davranış öğeleri video ve resimlerde gösterilmiştir. Cinsel davranış testinin kritik adımları, avantajları ve sınırlamaları da açıklanmıştır. Son olarak, davranış parametreleri sunulur ve montaj, içe dönüklük ve miyonasyonda boşalma süreçleri ayırt edilir. Davranış parametreleri, test döneminde oluşan süre ve sayımlar açısından değerlendirilir.

Giriş

Olgun erkek farelerde cinsel davranış, farklı beyin devrelerinde bir dizi ilgili ve birbirine bağlı hormonal sistemlerin ve sinir sistemlerinin etkileşiminden kaynaklanmaktadır¹. Ayrıca gelişimsel deneyimler, öğrenme, bağlam ve uygun bir ortak gerektirir. Davranışsal analiz nöral veya nörokrin fonksiyonu üzerinde önemli bir yansımasıdır. Bu nedenle, hayvan modelleri üzerinde cinsel davranış çalışması yaygın davranış nörolojive diğer ilgili araştırma²kullanılmıştır . Kemirgenlerde cinsel davranışların ethogram birçok makale ve kitap^1,3,4açıklanmıştır . Örneğin, Scahs ve Barfield'ın fare^5'teki cinsel davranış tanımı farelerde benzer bir davranış paterninin anlaşılmasına yardımcı oldu^5. Fare davranış çalışmaları için en sık kullanılan konulardan biridir. Gövde ve ark.⁶ erkek fare cinsel davranışları ayrıntılı bir giriş verdi: Bir erkek fare bir kadın karşılaştığında, bu kadının anogenital bölge araştırmaya başlar. Daha sonra erkek ön patilerini dişinin yanlarına dayayıp dişinin arkadan monte etmesini eler. Kadın karakteristik bir cinsel alıcı duruş sergiler, bir yay içine omurgasını bükme ve vücudun bir tarafına kuyruğunu hareket ettirerek, erkek cinsel penetrasyon için bir açılış introitus açığa (yani, lordosis). Montaj dan sonra, erkek hızlı yapar, sığ pelvik itmeler, yavaş ve derin vajinal itmeler takip. Çok sayıda intromissions sonra, meni boşalma uzun süreli bir itme sonuçları, sırasında erkek fare sökme veya kadın düşmeden önce yaklaşık 25 s donma olabilir⁶. Boşalma sırasında erkek fare aksesuar bezleri, kohit fişini oluşturmak için sertleşen meni içeren bir karışım oluşturabilir. Son olarak, boşalma sonrasında, erkek genital damat başlar ve kadın ilgi eksikliği gösterir. Kısacası, erkek cinsel davranış temel sırası koklama oluşur, takip, montaj, intromisyon, boşalma, ve sonrası boşalma damat. Fare cinsel davranış gerginlik farklılıkları sergiler. Örneğin, boşalma gecikmeleri 594 ile 6943 s arasında değişir ve intromissions sayısı 5 ile 100'den fazla arasında değişir. Boşalma sonrası gecikmeler 17 ila 60 dakika arasında değişmektedir. Ancak, bir roman kadın giriş bu zaman aralığı azaltabilir. Bazı durumlarda, erkek yeni kadın⁷ile ilk intromission boşalır.

Cinsel davranışın değerlendirilmesinde önemli olaylar montaj, intromisyon ve boşalma vardır. Davranış bilimciler her eylemin frekansı sadece ölçüm tavsiye var, ama aynı zamanda gecikme ve zaman aralığı^5,8. Geçmiş çalışmalarda bazı önemli ölçüm göstergeleri şunlardır: bağlar sayısı, intromissions sayısı, montaj gecikmesi, intromission gecikmesi, boşalma gecikmesi, boşalma sonrası montaj gecikmesi (veya boşalma sonrası aralıklar), boşalma sonrası intromission gecikmesi, copulatory serisi sayısı ve copulatory serisinin süresi. Park ve ark.⁸ ve Sachs ve ark.^5, kemirgenlerin montaj, intromisyon ve boşalma her eylem tanımlamak için nasıl açıklanmıştır. Montaj erkek arkadan kadın montaj olarak tanımlanır, onun ön ayakları ile onun yanları palpe, ve penisini hızla itme ve tekrar tekrar penis ekleme olmadan. Penil ekleme olarak da bilinen intromission, aşağıdaki eylemlerden biri veya birkaçı ile tanımlanır: hızlı sığ itmelerden sonra uzun, derin itme, bir arka bacakla hızlı bir tekme ve erkeğin dişiden belirgin bir yanal çekilmesi. Boşalma bir intromission ve arka bacak yüksekliği bir azalma daha yavaş ve daha derin bir terminal pelvik itme ile tanımlanır. Bir çiftleşme serisi boşalma montaj her dizi tarafından tanımlanır. Bu çalışmada kullanılan davranışsal parametrelerin tanımları şu şekilde sıralanmıştır: 1) Montaj gecikmesi: dişinin girişinden erkeğin ilk montajına kadar olan süre; 2) Intromisyon gecikmesi: dişinin ilk intromisyona girişinden geçen süre; 3) Boşalma gecikmesi: ilk intromission ilk boşalma (genellikle son pelvik itme aşağıdaki) zaman; 4) Boşalma sonrası montaj gecikmesi: boşalmadan bir sonraki montaja kadar geçen süre; 5) Boşalma sonrası intromission gecikme: boşalma ve bir sonraki intromission zaman; 6) Bağlar sayısı: ilk boşalma önce montaj süreleri sayısı; 7) Giriş sayısı: Ilk boşalmadan önce intromisyonların sayısı; 8) Kohit serilerinin sayısı: Gözlem dönemindeki kopya serisi sayısı; 9) Kohit serisinin süresi: Gözlem süresi boyunca tüm kopya serilerinin zamanıdır.

Cinsel davranış ve ilgili davranış ya erkek ev kafesi ya da kapalı bir alanda yapılabilir, aralarında bir cihaz Rissman'S "No Secrets" aynalı kutu olarak adlandırılan çiftleştirme davranışı gözlemlemek için tanıtıldı³. Bir video kamera aynı anda yanal bir görünümden farelerin eylem kaydetmek için kutunun önüne yerleştirilir ve bir ventral görünümünden eğimli bir ayna ile. Ancak, bu yöntem kaçınılmaz olarak farelerde çevresel stresi ortadan kaldırmak için daha uzun alışmaya yol açan parlak ışıklar gerektirir. Ölçüm yöntemine gelince, davranışı kaydetmek ve ölçmek için video tabanlı davranış analizi önerilir^4. Hızlı fare hareketlerini kaydetmek için önerilen deklanşör hızlarına sahip kare kare video ilerletme seçeneğine sahip bir video kaydedici kullanılabilir. Karanlık bir ortamda kayıt yaparken yüksek çözünürlüklü kızılötesi kamera gereklidir. Filmi analiz etmek için, bilgisayar manipülasyonu için tek tek davranış çerçevelerinin yakalanmasını sağlayacak bir çerçeve tutucusu olan bir bilgisayar gereklidir. Fareler son derece çok yönlüdür ve hemen hemen her tedaviden sonra telafi edici davranışlar sergileyebilirler. Belirsizlik her hareketli vücut parçası⁴hakkında var olabilir. Bu nedenle, bazı davranışların analizi hala daha fazla çözünürlük ve yüksek hız kameraları gerektirebilir.

Farelerde erkek cinsel davranışlar suş farklılıkları, hormon değişiklikleri ve gen mutantions^1,3,9,10dahil olmak üzere birçok faktör, etkilenir. McGill ve Blight^11, fare mitesitleme davranışlarındaki gerinim farklılıklarını gösterdi. Örneğin, C57BL/6 erkekler genellikle hızlı bir şekilde intromisyon kazanmak ve yaklaşık 20 dk¹¹boşalmak . DBA/2 erkekler intromisyon kazanmak için yavaş ama hızla boşalmak. BALB/ c erkekler kur uzun bir süre nedeniyle boşalma elde etmek için yavaş (ortalama gecikme süresi 1 11^. Testosteron kolaylaştırır ve erkek cinsel davranış^{korur 2}, ve testosteron düzeylerinde değişiklikler cinsel davranış performansını değiştirebilir¹². Hem cerrahi hadım ve antiandrojen tedavisi testosteron düzeyini azaltabilir ve cinsel davranışlar ve hatta cinsel motivasyon ve cinsel uyarılma hızlı bir düşüş neden¹³. Uygulanan testosteron hadım farelerde prekopulatory ve çiftleşme davranışları geri yükleyebilirsiniz. Son olarak, nakavt ve nakavt fareler vahşi tip fareler ile karşılaştırıldığında cinsel davranışların yönlerini farklılıkları görüntüler. Örneğin, Adcy3, Cnga2 ve Gnao hedefli mutasyonları ile erkek fareler feromonlar tespit etmek için azaltılmış bir yetenek sergiler, Trpc2 nakavt fareler değiştirilmiş ortak tercihi göstermek ise^14,15,16. Transgenik ve nakavtların farelerin cinsel davranışları üzerindeki diğer etkileri Crawley³ile açıklanmaktadır.

Burada, hormonal olarak alıcı olması için astarlanmış bir ovariectomized kadın ile bir erkek fare eşleştirme cinsel davranışı değerlendirmek için en yaygın yöntemlerden biri anlatılmaktadır. Farelerde cinsel davranış deneyleri yapmak için deneysel bir protokol sunulmuştur. Buna ek olarak, CD-1 farelerde sosyal izolasyondan kaynaklanan değişen cinsel davranış kalıplarının bir örneği gösterilmiştir.

Protokol

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvan Bakımı İlkeleri (NIH Yayın No. 80-23, revize 1996) ve Tıbbi Enstitüsü Deneysel Hayvan Merkezi Akademisi'nin onayı ve gözetiminde yapılmıştır. Bitki Geliştirme (Çin).

1. Hayvancılık

1. Ev dişi ve erkek fareler 25 °C'de 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüler için.
2. Suya ücretsiz erişim ve standart peletli diyet sağlayın.
3. Farklı bir tesisten taşınırsa farelerin operasyondan 7 gün önce ortamlarına uyum sağlamasına izin verin.

2. Dişi farelerde ovariektomi

1. Dişi (doğumdan sonra 8 hafta, en az 6 haftalık) isofluran (indüksiyon için ~%4−5, bakım için ~%1−2) ile yüz konisi maskesi ile %100 oksijen ile anestezi uygulayın.
2. Uygun solunum hızı (örneğin, 2 s veya daha uzun 1 nefes) ile birlikte, 30 s üzerinde hiçbir gönüllü hareket olduğundan emin olarak uygun anestezi derinliği elde edilmiştir olup olmadığını kontrol edin. Alternatif olarak, farenin arka patilerin ayaklarındaki hafif basınca verdiği yanıtı test edin.
   NOT: Normal solunum hızı ~180/dk'dır. Anestezi sırasında %50 oranında bir düşüş kabul edilebilir^17.
   1. Anestezi altında yken kornea kuruma ve göz travması önlemek için oftalmik merhem kullanın.
   2. Farenin vücut Sıcaklığını 36 °C'de veya üzerinde tutun. Gerektiğinde anestezi döneminde ek ısı desteği sağlayın.
3. Kullanmadan önce ameliyat masasının tüm cerrahi aletlerini ve sert yüzeylerini %75 etanol ile sterilize edin ve dezenfekte edin.
4. Hayvanı steril bir perdeye yerleştirin.
5. Kürkü farenin arka tarafındaki lomber omurganın üzerinde iki taraflı tıraş edin ve cildi ortaya çıkar.
6. % 75 etanol ile maruz kalan cilt sterilize.
7. İki uyluk kökünün merkezinden ~1 cm mesafenin başına doğru arkada tek bir orta hat kesisi (yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda) yapın (konum Şekil 1'degösterilmiştir).
8. Kas tabakasıortaya çıkarmak için altta yatan kas hafifçe serbest deri altı dokusu serbest cilde nüfuz etmek için küçük makas kullanın.
9. Ince kas tabakası altında yumurtalık bulmak ve periton boşluğuna giriş kazanmak için küçük bir kesi (yaklaşık 5 mm uzunluğunda) olun.
   1. Beyaz yağ dokusunun etrafını saran sol el yumurtalığı göstermek için karın boşluğunun sol tarafındaki dokuyu hafifçe çekmek için küçük cımbızkullanın (çıplak gözle görülen yarı saydam, düzensiz bir kütle, Bkz. Şekil 1).
10. Yumurtalık oviduct ortaya çıkarmak için künt forceps ile yumurtalık çevreleyen yumurtalık yağ yastığı geri.
11. Kanamayı önlemek için oviduct çevresinde tek bir ligatür gerçekleştirin.
12. Oviduct yavaşça kesmek ve yumurtalık kaldırmak için küçük makas kullanın.
13. Tüm yumurtalık dokularının kaldırıldığını doğrulamak için oviduct dikkatle kontrol edin. Yumurtalık yüzeyde düzensiz nodüller ile yaklaşık 5 mm × 4 mm × 3 mm'dir.
14. Oviduct geri karın boşluğuna kalan kısmını yerleştirin.
15. Emilebilir dikişler ile kas tabakası dikiş.
16. Sağ tarafta kas tabakası ortaya çıkarmak için sağ tarafa deri çekin ve adımları 2.9-2.16 tekrarlayarak sağ yumurtalık kaldırın.
17. Emilebilir dikişler kullanarak cilt kesisini kapatın.
    1. Enfeksiyonu önlemek için her fareye penisilin sodyum (fare başına 10.000 adet/10 g) enjekte edin.
    2. İnsizyon bölgesi boyunca derinin altına lidokain (4 mg/kg, %1'lik bir çözeltinin 0.4 mL/kg) enjekte edin. Ayrıca ağrı tedavisi için 3 gün boyunca içme suyunda sürekli olarak ibuprofen (50-60 mg/kg/gün; 500 mL suda 10 mL Çocuk Motrini) sağlar.
18. Her fareyi ayrı ayrı sterilize edilmiş bir kafese yerleştirin.
19. Anesteziden tamamen iyileşene kadar yaklaşık 1-2 saat yakın gözlem altında tutun.
    1. Yatak olmadan temiz bir kafeste kağıt havlu üzerinde hayvanları kurtarmak. Bu adım trakeal obstrüksiyon veya pnömoni riskini en aza indirir. Anestezik geri kazanım sırasında ek ısı desteği sağlayın. Yaranın yırtılmasını önlemek için cerrahi bölgeyi izleyin.
20. İyileşme döneminden sonra (ameliyattan yaklaşık 24 saat sonra), fareleri ev kafeslerine geri yerleştirin.
21. Deneyi ameliyattan sonra en az 2 hafta boyunca yapmayın.

3. Kadınlarda hormon kaynaklı estrus

1. McLean ve^{ark. 18'de}açıklandığı gibi vajinal yayma yaparak dişilerin esterev evresini belirleyin. Estrus döngüsü değişikliği, dişinin ovariektomisinin başarılı olduğunu gösterir.
2. Cinsel davranış testinden 48 saat önce estradiol benzoat enjekte edin (fare başına 20 μg, 0,1 mL sterilize zeytinyağı, intraperitoneally) 48 saat önce çözünmüş.
3. Cinsel davranış testinden 4 saat önce progesteron enjekte edin (fare başına 500 μg, 0,1 mL yağda çözünmüş, intraperitoneal)
   NOT: Bir estrus dişinin uygunluğu, bir kafeste cinsel açıdan aktif ve deneyimli bir erkekle birlikte yaşadıklarında, 3 veya daha fazla kez erkek farenin cinsel organa yerleştirimi kabul eden kadın tarafından belirlenir.

4. Cinsel davranış testine hazırlık

1. Fare hareketinin gözlemini sağlayan şeffaf bir ön duvar dışında, siyah pleksiglas duvarlarla dikdörtgen ve açık alan kutusunda (40 cm x 40 cm x 40 cm) erkek farelerin cinsel davranış testini yapın.
2. Genel oda aydınlatmasını 650 lux'a ayarlayın.
   NOT: Fareler anormal davranış kalıplarını önlemek için doğrudan aydınlatılmamalıdır.
3. Farelerin hareketini ve davranışını videoya kaydetmek için bilgisayara bağlı bir dijital kamera kullanın.
4. Karanlık döngünün ilk saatlerinde erkek fareler üzerinde davranış testi yapın.

5. Alışkanlık

1. Deney odasını sessiz tutun.
2. Fareleri açık alan kutusunun ortasına yerleştirerek 30 dakika boyunca çevreyi özgürce keşfetmelerini sağlar.
3. Yeni ortamdan kaynaklanan stresi önlemek için test gününden önce fareleri test gününden 2 gün üst üste cihaza alışın.
   NOT: Fareler stres hissetmeden özgürce hareket etmeli ve keşfetmelidir. Hem erkek hem de dişi farelerin test ortamına alışması gerekir.

6. Davranışsal tahliller

1. Testbaşlamadan önce kamerayı açın.
2. Fareyi açık alanın ortasına test etmek için test edin, test kutusuna 5 dakika boyunca ücretsiz keşif sağlayarak çevreye alışın.
3. Test kutusuna estrus bir kadın yerleştirin.
4. 30 dakika boyunca erkek ve dişi fareler arasındaki sosyal ve çiftleşme davranışlarını ve etkileşimleri kaydedin.
5. Kamerayı kapatın ve videonun kaydedilip kaydedilenden onaylayın.
6. Test kutusundan kadın alın ve bir vajinal fiş oluşumunu kaydedin.
   NOT: Bir gün içinde, ilişkiyi kabul eden bir kadın fare başka bir cinsel davranış testinde kullanılamaz.
7. Dişiyi ev kafesine geri yerleştirin.
8. Erkeği kafesine geri ver.
9. Cihazın içindeki idrarı, dışkıyı ve dolguyu temizleyin.
10. Test edilmiş farelerin kokusunu %75 etanol ile çıkarın.
11. 6.1-6.10 adımlarını tekrarlayarak bir sonraki erkek farenin testini başlatın.

7. Davranışsal veri çıkarma

1. Video kaydını oynatma ve davranış parametrelerini ayıklayın (bkz. Şekil 2).
   1. 30 dakika içinde bağlar sayısını kaydedin.
   2. 30 dk. Bir pelvik itme intromisyon olarak saymak intromissions sayısını kaydedin.
   3. Dişinin piyasaya sürülmesinden ilk montaja kadar geçen süreyi montaj gecikmesi olarak kaydedin.
   4. Dişinin ilk intromisyona girişinden intromisyon gecikmesi olarak geçen süreyi kaydedin.
   5. Boşalma gecikmesi olarak ilk intromission gelen ilk boşalma için zaman kaydedin.
   6. Boşalmadan bir sonraki montaja kadar geçen süreyi boşalma sonrası montaj gecikmesi olarak kaydedin.
   7. 30 dk içinde copulatory serisi rekor sayıda. Bir çiftleşme serisi boşalma montaj her dizi.
   8. Tüm kopya serisinin süresini 30 dk olarak kaydedin.

Sonuçlar

Cd-1 fareler arasında cinsel davranışın tektek olarak yetiştirilmiş olması ve grup halinde bulunan CD-1 fareleri arasında karşılaştırılması gösterilmiştir. Erkek CD-1 fareler rastgele izolasyon yetiştirilen bir gruba (IS, kafes başına bir fare, n = 30) ve bir grup-ev grubu (GH, kafes başına beş fare, n = 15) olarak atandı. Fareler doğum sonrası 23 günden 93. Daha sonra, her iki fare grubu da cinsel davranış açısından değerlendirildi. Çalışmamızda çiftleşmenin başarı oranının İd ...

Tartışmalar

Sunulan protokolde birkaç kritik adım vardır. Kadınların ovariektomi ile ilgili olarak, arkadan açılan cerrahi kesi karın dan daha az zararlıdır. Yumurtalık pozisyonunun derin olduğu göz önüne alındığında, kesi karından kesildiğinde diğer organların çekilmesi genellikle kanamaya yol açar ve net olmayan cerrahi görme ile sonuçlanır²⁰. Yumurtaya kolayca ulaşmak ve ameliyat süresini kısaltmak ve ameliyatın güvenliğini sağlamak için sırtın kesisini gerçekleştird...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Choral hydrate	Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd.	20160225
Coated VICRYL Plus Sutures	Ethicon, Inc.	missing
Estradiol benzoate	J&K Scientific, Ltd.	L930Q170
Ethanol absolute	Beijing Chemical Works Co., Ltd.	20160715
Ibuprofen (Children's Motrin)	Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd.	160629478
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	217180501
Lidocaine	HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd.	1170506107
Male and female CD-1 mice	Vital River Beijing	SCXK()2013-0023
Olive oil
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd.	F5126420
Progesterone	J&K Scientific, Ltd.	LR50Q07
Sony digital camera	Sony Corporation	HDR-CX290E
Test box			DIY
ThinkStation Computer	Lenovo	S/N PCOGLQKG
Vaporizer for Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	E05904-009M