Оценка сексуального поведения мышей мужского пола

Резюме

Эта статья описывает как выполнить сексуальные испытания поведения в мышах мышей мышей.

Аннотация

Сексуальное поведение в полнейось специфическим для видов. Хотя грызуны имеют несколько иное сексуальное поведение, мыши и крысы имеют сходную сексуальную поведенческую модель. Целью данной статьи является описание индуцированной гормонами эструса ovarieactomized женской модели и экспериментальной процедуры для оценки сексуального поведения мышей мужского пола. Наиболее важные элементы сексуального поведения показаны в видео и иллюстрациях. Также объясняются критические шаги, преимущества и ограничения теста на сексуальное поведение. Наконец, представлены параметры поведения, и различаются процессы монтажа, интромиссии и эякуляции при спаривании. Поведенческие параметры оцениваются с точки зрения происшения и количества в течение испытательного периода.

Введение

Сексуальное поведение у зрелых мышей мужского пола является результатом взаимодействия ряда связанных и взаимозависимых гормональных систем и нейронных систем в различных схемах мозга^1. Она также требует опыта развития, обучения, контекста и соответствующего партнера. Поведенческий анализ является важным отражением на нервной или нейрокриной функции. Таким образом, сексуальное поведение исследование на животных моделей широко используется в поведенческой неврологии и других связанных исследований². Этаграмма сексуального поведения у грызунов была объяснена во многих статьях и книгах^1,3,4. Например, описание Scahs и Barfield сексуального поведения в крысе⁵ помогло понять подобную поведенческую картину в мышах^5. Мышь является одним из наиболее часто используемых предметов для поведенческих исследований. Hull et al.⁶ дали детальное введение мыжской мыши сексуального поведения: Когда мыжская мышь встречает женщину, она начинает исследовать аногенитную область женщины. Затем самец прижимает передние лапы к женским флангам, чтобы смонтировать самку с тыла. Самка проявляет характерную сексуально восприимчивую осанку, сгибая позвоночник вниз в лук и перемещая хвост в одну сторону тела, подвергая открытие интроита для сексуального проникновения самца (т.е. лордоза). После монтажа самец делает быстрые, мелкие тазовые тяги, а затем медленные и глубокие вагинальные тяги. После многочисленных интрумиссий, длительная тяга приводит к эякуляции спермы, во время которой мышь мужского пола может замерзнуть около 25 с до демонтажа или падения с самки⁶. При эякуляции мужской мыши аксессуар желез ы может производить смесь, содержащую сперму, которая затвердевает, чтобы сформировать совокупляющуюшти. Наконец, после эякуляции, мужчина начинает генитальный уход и проявляет отсутствие интереса к женщине. Короче говоря, основная последовательность мужского сексуального поведения состоит из нюхать, после, монтаж, введение, эякуляция, и после эякуляции ухода. Мышь сексуального поведения экспонатов деформации различия. Например, семяизвержение колеблется от 594 до 6943 с, а число интромиссий колеблется от 5 до более чем 100. После эякуляции в диапазоне от 17 до 60 мин. Тем не менее, введение романа женщина может уменьшить этот промежуток времени. В некоторых случаях самец эякулирует на первом интромиссии с новой женщиной⁷.

Основными событиями для оценки сексуального поведения являются монтаж, введение и эякуляция. Поведенческие ученые рекомендовали измерять не только частоту каждого действия, но и его задержку и временной интервал^5,8. Некоторые основные показатели измерения в прошлых исследованиях включают в себя: количество креплений, количество интромиссий, задержку крепления, задержку эякуляции, задержку после эякуляции (или постэякуляционные интервалы), задержку после эякуляции, количество серий копуляций и продолжительность копуляторных серий. Park et al.⁸ и Sachs et al.⁵ описали, как определить каждое действие монтажа, интромиссии и эякуляции грызунов. Монтаж определяется как самец монтажа самки с тыла, пальпирования ее фланги с его передних конечностей, и толкая его пенис быстро и неоднократно без полового члена вставки. Введение, также известный как полового члена вставки, определяется одним или более из следующих актов: длинная, глубокая тяга после быстрого мелкого толчки, быстрый удар с одной задней стороны, и отмеченный боковой вывод самца от женщины. Эякуляция определяется терминальной тягой таза, которая медленнее и глубже, чем у интромиссии и снижение высоты задней ноги. Совокупляемые серии определяется каждой последовательности от монтажа до эякуляции. Определения поведенческих параметров, используемые в настоящем исследовании, перечислены следующим образом: 1) Монтаж задержки: время от введения женщины до первого монтажа мужчины; 2) Задержка ввода: время от введения женщины до первой интромиссии; 3) задержка эякуляции: время от первого интромиссии до первой эякуляции (как правило, после последней тазовой тяги); 4) Постэякуляционная задержка крепления: время от эякуляции до следующего монтажа; 5) Постэякуляционная задержка вступительной миссии: время от эякуляции и следующего интромиссии; 6) Количество креплений: количество времени монтажа до первой эякуляции; 7) Количество интромиссий: количество интромиссий до первой эякуляции; 8) Количество копулирующих серий: количество серий копулаторов в период наблюдения; 9) Продолжительность копуляторных серий: время всех копуляторных серий в период наблюдения.

Сексуальное поведение и связанное с ним поведение может быть проведено либо в домашней клетке мужчины или в закрытой арене, среди которых аппарат под названием Rissman в "Нет секретов" зеркальное поле вводится для наблюдения брачного поведения³. Перед окном находится видеокамера, чтобы одновременно записывать действие мышей с бокового зрения и через наклонное зеркало с брюшного вида. Однако этот метод требует ярких огней, что неизбежно приводит к более длительному уживанию, чтобы устранить стресс окружающей среды у мышей. Что касается метода измерения, видео-поведенческий анализ рекомендуется для записи и количественной оценки поведения⁴. Видеомагнитофон, который имеет кадр за кадром видео заранее вариант с рекомендуемой скоростью затвора больше, чем 1/1000 s может быть использован для записи быстрых движений мыши. Инфракрасная камера высокого разрешения необходима при записи в темной среде. Для анализа фильма необходим компьютер с захватом кадров, позволяющий фиксировать отдельные кадры поведения для компьютерных манипуляций. Мыши чрезвычайно универсальны и могут отображать компенсационное поведение после почти любого лечения. Неоднозначность может существовать о каждой движущейся части тела⁴. Таким образом, анализ некоторых моделей поведения может потребовать еще большего разрешения и более высокой скорости камер.

Мужское сексуальное поведение у мышей зависит от многих факторов, в том числе деформации, гормональные изменения, и генные мутантионы^1,3,9,10. McGill и Blight¹¹ иллюстрировали различия напряжения в поведении спаривания мыши. Например, C57BL/6 мужчины обычно получают интромиссии быстро и эякулята примерно в 20 мин¹¹. DBA/2 мужчины медленно, чтобы получить введение, но эякулята быстро. BALB/c мужчины медленно достичь эякуляции (средняя задержка 1 ч) из-за длительного периода ухаживания¹¹. Тестостерон облегчает и поддерживает мужское сексуальное поведение², и изменения в уровнях тестостерона может изменить сексуальное поведение производительности¹². Как хирургическая кастрация и антиандрогенное лечение может снизить уровень тестостерона и привести к быстрому снижению сексуального поведения и даже сексуальной мотивации и сексуального возбуждения¹³. Управляемый тестостерон может восстановить прекопуляторное и совокупляющее поведение у кастрированных мышей. Наконец, нокаут и нокдаун мышей отображать различия в аспектах сексуального поведения по сравнению с дикими мышами типа. Например, мышей мужского пола с целевыми мутациями Adcy3, Cnga2 и Gnao демонстрируют пониженную способность обнаруживать феромоны, в то время как мыши trpc2 нокаутом показывают измененные предпочтения партнеров^14,15,16. Другие эффекты трансгении и нокаутов на сексуальное поведение мышей объясняются Кроули³.

Здесь описывается одна из наиболее распространенных процедур для оценки сексуального поведения в спаривании мужской мыши с овариэктомизированной самкой, которая была гормонально загрунтована для восприимчивости. Представлен экспериментальный протокол для проведения экспериментов на мышах в сексуальном поведении. Кроме того, показан пример изменения моделей сексуального поведения в результате социальной изоляции у мышей CD-1.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с принципами "Принципов лабораторного ухода за животными" (публикация No 80-23, пересмотренный 1996 год) и под руководством Академии экспериментального центра для животных Института медицины Развитие завода (Китай).

1. Животноводство

1. Дом самок и мышей-мужчин при 25 градусах по Цельсию при 12 ч свет/12 ч темных циклов.
2. Обеспечить свободный доступ к воде и стандартную пеллетную диету.
3. Разрешить мышам акклиматизироваться к окружающей среде в течение 7 дней до операции, если транспортируется из другого объекта.

2. Обариэктомия у самок мышей

1. Анестезия женщин (8 недель послеродового, не менее 6-недельного) с изофлураном (4-5% для индукции, 1-2% для поддержания) в 100% кислорода через маску конуса лица.
2. Убедитесь, что соответствующая глубина атезии была достигнута путем обеспечения того, чтобы не было добровольных движений в течение более 30 с, в сочетании с соответствующей частотой дыхания (например, 1 дыхание на 2 с или более). Кроме того, проверьте реакцию мыши на мягкое давление на носы задних лап.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная частота дыхания составляет 180 евро/мин. Снижение ставки на 50% допустимо при анестезии¹⁷.
   1. Используйте офтальмологическую мазь для предотвращения высыхания роговицы и травмы глаз в состоянии наркоза.
   2. Держите температуру тела мыши на уровне или выше 36 градусов по Цельсию. Обеспечить дополнительную тепловую поддержку в период анестезии, когда это необходимо.
3. Стерилизовать и дезинфицировать все хирургические инструменты и твердые поверхности операционного стола с 75% этанола до использования.
4. Поместите животное на стерильную драпировку.
5. Бритьмеха двусторонней над поясничного отдела позвоночника на задней части мыши, чтобы разоблачить кожу.
6. Стерилизовать обнажённую кожу с помощью 75% этанола.
7. Сделайте один разрез средней линии (длина около 0,5 см) на спине от центра двух корней бедра к голове 1 см расстояния (позиция показана на рисунке 1).
8. Используйте небольшие ножницы, чтобы проникнуть в кожу, чтобы мягко освободить подкожную ткань от основной мышцы, чтобы разоблачить мышечный слой.
9. Найдите яичников под тонким мышечным слоем и сделайте небольшой разрез (около 5 мм в длину), чтобы получить вход в полость перитонеальной полосты.
   1. Используйте небольшие пинцеты, чтобы вытащить ткани немного на левой стороне брюшной полости, чтобы показать левую овчарку обертывания вокруг белой жировой ткани (полупрозрачный, нерегулярные массы, как видно невооруженным глазом, см. Рисунок 1).
10. Утяните яичников жира площадку окружающих яичников с тупыми щипцы подвергать яйц.
11. Выполните одну лигатуру вокруг яйцты, чтобы предотвратить кровотечение.
12. Используйте небольшие ножницы, чтобы разорвать яйцдля мягко и удалить яичник.
13. Тщательно проверьте яйцук, чтобы подтвердить, что все ткани яичников удаляются. Яичник составляет около 5 мм и 4 мм и 3 мм с нерегулярными узелками на поверхности.
14. Поместите оставшуюся часть яйты обратно в брюшную полость.
15. Шов мышечного слоя с усваиваемыми швами.
16. Потяните кожу на правую сторону, чтобы разоблачить мышечный слой на правой стороне и удалить правый яичников, повторяя шаги 2.9-2.16.
17. Закройте разрез кожи с помощью усваиваемых швов.
    1. Впрысните каждую мышь интраперитонеально с пенициллин натрия (10000 единиц / 10 г на мышь), чтобы предотвратить инфекцию.
    2. Вводят лидокаин (4 мг/кг, 0,4 мл/кг раствора 1%) под кожу вдоль участка разреза. Также обеспечить ибупрофен (50-60 мг/кг/день; 10 мл детского мотрина в 500 мл воды) непрерывно в питьевой воде в течение 3 дней для обезболивания.
18. Поместите каждую мышь в стерилизованные клетки по отдельности.
19. Держите под пристальным наблюдением в течение примерно 1-2 ч до полного восстановления после анестезии.
    1. Восстановление животных на бумажных полотенцах в чистой клетке без постельных принадлежностей. Этот шаг сводит к минимуму риск трахеи обструкции или пневмонии. Обеспечить дополнительную тепловую поддержку во время обезвреживания. Мониторинг хирургического участка, чтобы предотвратить разрыв раны.
20. После периода восстановления (примерно 24 ч после операции), место мышей обратно в свою домашнюю клетку.
21. Не выполняйте эксперимент в течение по крайней мере 2 недель после операции.

3. Гормон-индуцированный эструс у женщин

1. Определите эструсидную стадию самок, выполняя мазок влагалища, как описано в McLean et al.¹⁸. Никакие изменения цикла estrus не указывают на то, что овариэктомия самки была успешной.
2. Вводят эстрадиол бензоат (20 мкг на мышь, растворенный в 0,1 мл стерилизованного оливкового масла, интраперитоненалически) 48 ч до теста на сексуальное поведение.
3. Вводят прогестерон (500 мкг на мышь, растворенный в 0,1 мл масла, интраперитонетически) 4 ч до теста на сексуальное поведение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Право на эструс аструс женщины определяется женщины принятия половых вставки мужской мыши 3 или более раз, когда они сожительствуют с сексуально активным и опытным мужчиной в одной клетке.

4. Подготовка к тесту на сексуальное поведение

1. Проведите тест на сексуальное поведение мышей в прямоугольной и открытой поле (40 см х 40 см х 40 см) с черными стенками плексигласа, за исключением прозрачной передней стенки, позволяющей наблюдать за движением мыши.
2. Установите общее освещение комнаты до 650 люкс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши не должны быть освещены непосредственно, чтобы избежать ненормальных моделей поведения.
3. Используйте цифровую камеру, связанную с компьютером, чтобы заснять движение и поведение мышей.
4. Выполните поведенческий тест на мышах мужского пола в первые часы темного цикла.

5. Привычка

1. Держите комнату эксперимента тихой.
2. Поместите мышей для тестирования в центре открытого поля поле, что позволяет им исследовать окружающую среду свободно в течение 30 минут.
3. Привычка мышей в течение 2 дней подряд до дня тестирования в аппарате, чтобы предотвратить стресс от новой среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны двигаться и исследовать свободно, не чувствуя стресса. И мышам-мужчинам, и самке мышей необходимо привыкать к тестированию.

6. Поведенческие анализы

1. Включите камеру до начала теста.
2. Поместите мышь для тестирования в центре открытого поля в испытательном поле, что позволяет бесплатно разведки в течение 5 минут, чтобы акклиматизироваться к окружающей среде.
3. Поместите самку в эструс в испытательный ящик.
4. Запись социального и спаривания поведения и взаимодействия между мужчинами и женщинами мышей в течение 30 минут.
5. Выключите камеру и подтвердите, что видео сохранено.
6. Возьмите самку из испытательного ящика и запишите образование вагинальной вилки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: самка мыши, которая приняла спаривания не может быть использована в другой тест сексуального поведения в один день.
7. Поместите самку обратно в домашнюю клетку.
8. Верните самца в родную клетку.
9. Очистите мочу, кал и обивку внутри аппарата.
10. Удалить запах проверенных мышей с 75% этанола.
11. Начните тест следующей мужской мыши, повторяя шаги 6.1-6.10.

7. Экспоненция данных

1. Воспроизведение видеозаписи и извлечь поведенческие параметры (см. рисунок 2).
   1. Запишите количество креплений за 30 мин.
   2. Запись количества интромиссий в 30 мин. Считайте тазовой тяги, как интромиссии.
   3. Запись времени от введения женщины до первого монтажа, как монтаж задержки.
   4. Запишите время от введения самки до первой интромиссии как задержки ввходе.
   5. Запишите время от первого интромиссии до первой эякуляции как задержка эякуляции.
   6. Запишите время от эякуляции до следующего монтажа, как пост-эякуляция задержки крепления.
   7. Рекордное количество копулирующих серий за 30 мин. Совокупляющий ряд каждой последовательности от монтажа до эякуляции.
   8. Запишите время всех копулирующих серий за 30 минут, как продолжительность копуляторной серии.

Результаты

Показано сравнение сексуального поведения между мышами CD-1, выращенными в изоляции, и групповыми мышами CD-1. Мыши-мужчины CD-1 были случайным образом отнесены в изоляционистую группу (IS, одна мышь на клетку, n - 30) и группу (GH, пять мышей на клетку, n no 15). Мыши прошли изоляцию воспитания от после...

Обсуждение

В представленном протоколе есть несколько важных шагов. Что касается овариэктомии самок, то отверстие разреза со спины менее вредно, чем от живота. Учитывая, что положение яичника глубокое, потянув других органов, когда разрез разрез разрезать из живота часто приводит к кровотечению и ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Choral hydrate	Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd.	20160225
Coated VICRYL Plus Sutures	Ethicon, Inc.	missing
Estradiol benzoate	J&K Scientific, Ltd.	L930Q170
Ethanol absolute	Beijing Chemical Works Co., Ltd.	20160715
Ibuprofen (Children's Motrin)	Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd.	160629478
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	217180501
Lidocaine	HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd.	1170506107
Male and female CD-1 mice	Vital River Beijing	SCXK()2013-0023
Olive oil
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd.	F5126420
Progesterone	J&K Scientific, Ltd.	LR50Q07
Sony digital camera	Sony Corporation	HDR-CX290E
Test box			DIY
ThinkStation Computer	Lenovo	S/N PCOGLQKG
Vaporizer for Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	E05904-009M