Avaliação do Comportamento Sexual de Camundongos Machos

Resumo

Este artigo descreve como realizar testes de comportamento sexual em camundongos machos.

Resumo

O comportamento sexual é altamente específico das espécies. Embora os roedores tenham comportamentos sexuais ligeiramente diferentes, ratos e ratos têm um padrão de comportamento sexual semelhante. O objetivo deste artigo é descrever o modelo feminino induzido por hormônios e o procedimento experimental para avaliação do comportamento sexual de camundongos machos. Os elementos comportamentais sexuais mais importantes são demonstrados no vídeo e nas ilustrações. Os passos críticos, as vantagens e limitações do teste de comportamento sexual também são explicados. Finalmente, os parâmetros de comportamento são apresentados, e os processos de montagem, intromissão e ejaculação no acasalamento são distinguidos. Os parâmetros comportamentais são avaliados em termos da duração e contagem ocorridas durante o período de teste.

Introdução

O comportamento sexual em camundongos machos maduros resulta da interação de uma série de sistemas hormonais e sistemas neurais relacionados e interdependentes em diferentes circuitos cerebrais¹. Também requer experiências de desenvolvimento, aprendizado, contexto e um parceiro apropriado. A análise comportamental é uma importante reflexão sobre a função neural ou neurocrina. Assim, o estudo do comportamento sexual em modelos animais tem sido amplamente utilizado na neurociência comportamental e em outras pesquisas relacionadas². O etograma dos comportamentos sexuais em roedores tem sido explicado em muitos artigos e livros^1,3,4. Por exemplo, a descrição de Scahs e Barfield sobre o comportamento sexual no rato⁵ ajudou a entender um padrão comportamental semelhante em camundongos⁵. O rato é um dos sujeitos mais usados para estudos comportamentais. Hull et al.⁶ deram uma introdução detalhada dos comportamentos sexuais do rato masculino: Quando um rato macho encontra uma fêmea, ele começa a investigar a região anogenital da fêmea. Em seguida, o macho pressiona suas patas dianteiras contra os flancos da fêmea para montar a fêmea por trás. A fêmea apresenta uma postura sexualmente receptiva característica, dobrando sua coluna em um arco e movendo sua cauda para um lado do corpo, expondo um introitido de abertura para a penetração sexual do macho (ou seja, lordose). Após a montagem, o macho faz impulsos pélvicos rápidos e rasos, seguidos por impulsos vaginais lentos e profundos. Após inúmeras intromissões, um impulso de longa duração resulta na ejaculação do sêmen, durante o qual o camundongo macho pode congelar por cerca de 25 s antes de desmontar ou cair da fêmea⁶. Na ejaculação, as glândulas acessórias do rato macho podem produzir uma mistura contendo sêmen que endurece para formar o plugue copulatório. Finalmente, após a ejaculação, o macho começa a se arrumar genitalmente e demonstra falta de interesse pela fêmea. Em resumo, a seqüência básica do comportamento sexual masculino consiste em farejar, seguir, montar, intromissão, ejaculação e tratamento pós-ejaculação. O comportamento sexual do rato apresenta diferenças de tensão. Por exemplo, as latências de ejaculação variam de 594 a 6943 s, e os números de intromissões variam de 5 a mais de 100. As latências pós-ejaculação variam de 17 a 60 min. No entanto, a introdução de uma nova fêmea pode diminuir esse intervalo de tempo. Em alguns casos, o macho ejacula na primeira intromissão com a nova fêmea⁷.

Os principais eventos para a avaliação do comportamento sexual são a montagem, a intromissão e a ejaculação. Os cientistas comportamentais recomendaram a medição não apenas da frequência de cada ação, mas também de sua latência e intervalo de tempo^5,8. Alguns dos principais indicadores de medição em estudos anteriores incluem: número de montagens, número de intromissões, latência de montagem, latência de ejaculação, latência de montagem pós-ejaculatória (ou intervalos pós-ejaculatórios), latência pós-ejaculatória, número de séries copulatórias e duração de séries copulatórias. Park et al.⁸ e Sachs et al.⁵ descreveram como identificar cada ação de montagem, intromissão e ejaculação de roedores. A montagem é definida como o macho montando a fêmea por trás, palpando seus flancos com suas patas dianteiras, e empurrando seu pênis rapidamente e repetidamente sem inserção peniana. A intromissão, também conhecida como inserção peniana, é identificada por um ou mais dos seguintes atos: um impulso longo e profundo após impulsos rasos rápidos, um chute rápido com uma perna traseira, e uma retirada lateral marcada do macho da fêmea. A ejaculação é identificada por um impulso pélvico terminal que é mais lento e profundo do que o de uma intromissão e uma redução na elevação da perna traseira. Uma série copulatória é identificada por cada seqüência desde a montagem até a ejaculação. As definições de parâmetros comportamentais utilizados no presente estudo estão listadas da seguinte forma: 1) Latência de montagem: o tempo desde a introdução da fêmea até a primeira montagem do macho; 2) Latência de intromissão: o tempo desde a introdução do sexo feminino até a primeira intromissão; 3) Latência ejaculação: o tempo da primeira intromissão à primeira ejaculação (geralmente após o último impulso pélvico); 4) Latência de montagem pós-ejaculatória: o tempo da ejaculação para a próxima montagem; 5) Latência de intromissão pós-ejaculatória: o tempo de ejaculação e a próxima intromissão; 6) Número de montagens: o número de tempos de montagem antes da primeira ejaculação; 7) Número de intromissões: o número de intromissões antes da primeira ejaculação; 8) Número de séries copulatórias: o número de séries copulatórias durante o período de observação; 9) Duração das séries copulatórias: o tempo de todas as séries copulatórias durante o período de observação.

O comportamento sexual e o comportamento relacionado podem ser conduzidos tanto na gaiola do homem quanto em uma arena fechada, entre as quais um aparelho chamado caixa espelhada "Sem Segredos" de Rissman é introduzido para observar o comportamento de acasalamento³. Uma câmera de vídeo é colocada na frente da caixa para gravar simultaneamente a ação dos ratos a partir de uma visão lateral e através de um espelho inclinado a partir de uma visão ventral. No entanto, este método requer luzes brilhantes, o que inevitavelmente leva a uma maior habitação, a fim de eliminar o estresse ambiental em camundongos. Quanto ao método de medição, recomenda-se a análise comportamental baseada em vídeo para registrar e quantificar o comportamento⁴. Um gravador de vídeo que tenha uma opção de avanço de vídeo quadro a quadro com velocidades recomendadas de obturador maiores que 1/1000 s pode ser usado para registrar movimentos rápidos do mouse. A câmera infravermelha de alta resolução é necessária ao gravar em um ambiente escuro. Para analisar o filme, é necessário um computador com um agarrador de quadros para permitir que os quadros individuais de comportamento sejam capturados para manipulação do computador. Os camundongos são extremamente versáteis e podem apresentar comportamento compensatório após quase qualquer tratamento. A ambiguidade pode existir sobre cada parte do corpo em movimento⁴. Assim, a análise de alguns comportamentos pode exigir ainda maior resolução e câmeras de velocidade mais altas.

Os comportamentos sexuais masculinos em camundongos são afetados por muitos fatores, incluindo diferenças de tensão, alterações hormonais e mutantes genéticos^1,3,9,10. McGill e Blight¹¹ ilustraram as diferenças de tensão nos comportamentos de acasalamento do rato. Por exemplo, os machos C57BL/6 normalmente ganham a intromissão rapidamente e ejaculam em cerca de 20 min¹¹. DBA/2 machos são lentos para ganhar intromissão, mas ejaculam rapidamente. Os machos balb/c são lentos para alcançar a ejaculação (latência média de 1 h) devido a um longo período de namoro¹¹. A testosterona facilita e mantém o comportamento sexual masculino², e mudanças nos níveis de testosterona podem alterar o desempenho do comportamento sexual¹². Tanto a castração cirúrgica quanto o tratamento antiandrogênio podem reduzir o nível de testosterona e resultar em um rápido declínio dos comportamentos sexuais e até mesmo motivação sexual e excitação sexual¹³. A testosterona administrada pode restaurar comportamentos pré-copulatórios e copulatórios em camundongos castrados. Por fim, ratos de nocaute e knockdown exibem diferenças nas facetas dos comportamentos sexuais em comparação com ratos do tipo selvagem. Por exemplo, camundongos machos com mutações direcionadas de Adcy3, Cnga2 e Gnao apresentam uma capacidade reduzida de detectar feromôno, enquanto os ratos de nocaute Trpc2 mostram preferência de parceiro alterada^14,15,16. Outros efeitos de transgênicos e nocautes sobre o comportamento sexual de camundongos são explicados por Crawley³.

Aqui, um dos procedimentos mais comuns para avaliar o comportamento sexual na combinação de um camundongo macho com uma fêmea ovariectomizada que foi hormonalmente preparado para ser receptivo é descrito. Um protocolo experimental é apresentado para a realização de experimentos de comportamento sexual em camundongos. Além disso, um exemplo de mudança nos padrões de comportamento sexual resultantes do isolamento social em camundongos CD-1 é mostrado.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes dos Princípios de Cuidados Com Animais Laboratoriais (NI Publication nº 80-23, revisado em 1996) e a aprovação e supervisão da Academia de Centro Experimental de Animais do Instituto de Medicina Desenvolvimento vegetal (China).

1. Criação animal

1. Abrigar camundongos fêmeas e machos a 25 °C para ciclos escuros de 12 h de luz/12 h.
2. Fornecer acesso gratuito à água e uma dieta de pelotas padrão.
3. Permita que os ratos se acostumem ao seu ambiente por 7 dias antes da operação se transportados de uma instalação diferente.

2. Ovariectomia em camundongos femininos

1. Anestesiar a fêmea (8 semanas pós-natal, não menos que 6 semanas de idade) com isoflurano (~4-5% para indução, ~1-2% para manutenção) em 100% de oxigênio através de uma máscara de cone facial.
2. Verifique se a profundidade adequada da anestesia foi alcançada certificando-se de que não há movimentos voluntários para maiores de 30 s, em combinação com uma taxa respiratória adequada (por exemplo, 1 respiração por 2 s ou mais). Alternativamente, teste a resposta do mouse à pressão suave nos dedos das patas traseiras.
   NOTA: A taxa respiratória normal é de ~180/min. Uma queda de taxa de 50% é aceitável durante a anestesia¹⁷.
   1. Use pomada oftálmica para evitar a secagem da córnea e trauma ocular enquanto estiver anestesia.
   2. Mantenha a temperatura corporal do mouse acima de 36 °C. Forneça suporte térmico suplementar durante o período de anestesia quando necessário.
3. Esterilizar e desinfetar todos os instrumentos cirúrgicos e superfícies duras da mesa de operação com 75% de etanol antes do uso.
4. Coloque o animal em uma cortina estéril.
5. Raspe a pele bilateralmente sobre a coluna lombar na parte de trás do camundongo para expor a pele.
6. Esterilizar a pele exposta com 75% de etanol.
7. Faça uma única incisão midline (cerca de 0,5 cm de comprimento) na parte de trás do centro das duas raízes da coxa em direção à cabeça de ~1 cm de distância (a posição é mostrada na Figura 1).
8. Use uma tesoura pequena para penetrar na pele para libertar suavemente o tecido subcutâneo do músculo subjacente, a fim de expor a camada muscular.
9. Localize o ovário a fina camada muscular e faça uma pequena incisão (cerca de 5 mm de comprimento) para entrar na cavidade peritoneal.
   1. Use uma pinça pequena para puxar o tecido ligeiramente no lado esquerdo da cavidade abdominal para mostrar o ovário esquerdo envolvendo em torno do tecido adiposo branco (uma massa translúcida e irregular como visto a olho nu, ver Figura 1).
10. Retraia a almofada de gordura ovariana ao redor do ovário com fórceps contundentes para expor o oviduto.
11. Realize uma única ligadura ao redor do oviduto para evitar sangramento.
12. Use uma tesoura pequena para cortar o oviduto suavemente e remova o ovário.
13. Verifique cuidadosamente o oviduto para confirmar se todos os tecidos ovarianos foram removidos. O ovário é de cerca de 5 mm × 4 mm × 3 mm com nódulos irregulares na superfície.
14. Coloque a parte restante do oviduto de volta na cavidade abdominal.
15. Suturar a camada muscular com suturas absorvíveis.
16. Puxe a pele para o lado direito para expor a camada muscular do lado direito e remova o ovário direito repetindo os passos 2.9-2.16.
17. Feche a incisão cutânea usando suturas absorvíveis.
    1. Injete cada rato intraperitonealmente com sódio penicilina (10.000 unidades/10 g por rato) para prevenir infecções.
    2. Injete lidocaína (4 mg/kg, 0,4 mL/kg de uma solução de 1%) abaixo da pele ao longo do local da incisão. Também forneça ibuprofeno (50-60 mg/kg/dia; 10 mL de Motrin infantil em 500 mL de água) continuamente na água potável por 3 dias para tratamento da dor.
18. Coloque cada rato em uma gaiola esterilizada individualmente.
19. Mantenha-se observação por aproximadamente 1-2 h até que esteja totalmente recuperado da anestesia.
    1. Recupere animais em toalhas de papel em uma gaiola limpa sem roupa de cama. Esta etapa minimiza o risco de obstrução traqueal ou pneumonia. Fornecer suporte térmico suplementar durante a recuperação anestésia. Monitore o local cirúrgico para evitar a ruptura da ferida.
20. Após o período de recuperação (aproximadamente 24 horas após a cirurgia), coloque os ratos de volta à gaiola de casa.
21. Não realize o experimento por pelo menos 2 semanas após a cirurgia.

3. Estrus induzidas por hormônios em fêmeas

1. Determine o estágio estreto das fêmeas realizando uma mancha vaginal como descrito em McLean et al.¹⁸. Nenhuma mudança no ciclo de estrus indica que a ovariectomia da fêmea foi bem sucedida.
2. Injete benzoato estradiol (20 μg por rato, dissolvido em 0,1 mL de azeite esterilizado, intraperitonealmente) 48 h antes do teste de comportamento sexual.
3. Injete progesterona (500 μg por rato, dissolvida em 0,1 mL de óleo, intraperitonealmente) 4 h antes do teste de comportamento sexual.
   NOTA: A elegibilidade de uma fêmea estrus é determinada pela mulher aceitando a inserção genital de um rato masculino 3 ou mais vezes, quando convivem com um macho sexualmente ativo e experiente em uma gaiola.

4. Preparação para o teste de comportamento sexual

1. Realizar o teste de comportamento sexual de ratos machos em uma caixa de campo retangular e aberta (40 cm x 40 cm x 40 cm) com paredes de plexiglass pretas, exceto por uma parede frontal transparente que permite a observação do movimento do rato.
2. Defina a iluminação geral da sala para 650 lux.
   NOTA: Os ratos não devem ser iluminados diretamente para evitar padrões de comportamento anormais.
3. Use uma câmera digital ligada a um computador para filmar o movimento e o comportamento dos ratos.
4. Realize o teste comportamental nos camundongos machos durante as primeiras horas do ciclo escuro.

5. Habitação

1. Mantenha a sala de experiências em silêncio.
2. Coloque os ratos para serem testados no centro da caixa de campo aberto, permitindo que eles explorem o ambiente livremente por 30 min.
3. Habituar ratos por 2 dias consecutivos antes do dia de teste no aparelho para evitar o estresse do novo ambiente.
   NOTA: Os ratos devem se mover e explorar livremente sem sentir estresse. Tanto camundongos machos quanto fêmeas precisam ser habituados ao ambiente de teste.

6. Ensaios comportamentais

1. Ligue a câmera antes do início do teste.
2. Coloque o mouse para ser testado no centro do campo aberto na caixa de teste, permitindo exploração livre por 5 min para se adaptar ao ambiente.
3. Coloque uma fêmea em estrus na caixa de teste.
4. Registre os comportamentos sociais e de acasalamento e as interações entre camundongos machos e fêmeas por 30 min.
5. Desligue a câmera e confirme se o vídeo está salvo.
6. Tire a fêmea da caixa de teste e registre a formação de um plugvaginal.
   NOTA: Um rato feminino que aceitou o acasalamento não pode ser empregado em outro teste de comportamento sexual em um dia.
7. Coloque a fêmea de volta em sua jaula.
8. Devolva o macho para sua jaula.
9. Limpe a urina, as fezes e o preenchimento dentro do aparelho.
10. Remova o cheiro dos ratos testados com 75% de etanol.
11. Inicie o teste do próximo mouse masculino repetindo os passos 6.1-6.10.

7. Extração de dados comportamentais

1. Reprodução da gravação de vídeo e extraia os parâmetros comportamentais (ver Figura 2).
   1. Registre o número de montagens em 30 min.
   2. Registre o número de intromissões em 30 min. Conte um impulso pélvico como uma intromissão.
   3. Registre o tempo desde a introdução da fêmea até a primeira montagem como latência de montagem.
   4. Registre o tempo desde a introdução da fêmea até a primeira intromissão como latência de intromissão.
   5. Registre o tempo desde a primeira intromissão até a primeira ejaculação como latência de ejaculação.
   6. Registre o tempo da ejaculação até a próxima montagem como latência pós-ejaculatória do monte.
   7. Número recorde de séries copulatórias em 30 min. Uma série copulatória é cada seqüência da montagem à ejaculação.
   8. Registre o tempo de todas as séries copulatórias em 30 min como a duração da série copulatória.

Resultados

Mostra-se uma comparação do comportamento sexual entre camundongos CD-1 criados isoladamente e ratos CD-1 abrigados em grupo. Os camundongos CD-1 masculinos foram aleatoriamente atribuídos a um grupo criado pelo isolamento (IS, um rato por gaiola, n = 30) e um grupo em grupo (GH, cinco ratos por gaiola, n = 15). Os camundongos foram submetidos à criação de isolamento do dia 23 ao dia 93. Em seguida, ambos os grupos de camundongos foram avaliados por comportamento sexual. Nosso estudo constatou que a taxa de sucesso...

Discussão

Existem alguns passos críticos no protocolo apresentado. Em relação à ovariectomia das fêmeas, a abertura da incisão cirúrgica pelas costas é menos prejudicial do que a do abdômen. Dado que a posição do ovário é profunda, puxar outros órgãos quando a incisão é cortada do abdômen muitas vezes leva a sangramento e resulta em visão cirúrgica pouco clara²⁰. Realizamos a incisão nas costas para alcançar o ovário facilmente e encurtar o tempo cirúrgico, bem como garantir a segura...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Choral hydrate	Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd.	20160225
Coated VICRYL Plus Sutures	Ethicon, Inc.	missing
Estradiol benzoate	J&K Scientific, Ltd.	L930Q170
Ethanol absolute	Beijing Chemical Works Co., Ltd.	20160715
Ibuprofen (Children's Motrin)	Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd.	160629478
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	217180501
Lidocaine	HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd.	1170506107
Male and female CD-1 mice	Vital River Beijing	SCXK()2013-0023
Olive oil
Penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd.	F5126420
Progesterone	J&K Scientific, Ltd.	LR50Q07
Sony digital camera	Sony Corporation	HDR-CX290E
Test box			DIY
ThinkStation Computer	Lenovo	S/N PCOGLQKG
Vaporizer for Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	E05904-009M