番茄根转化后与拉子托尼亚索拉纳卡鲁姆接种，直接遗传分析细菌性威尔特病

摘要

在这里，我们提出了一种用于番茄根转化的通用方法，然后用Ralstonia索兰卡鲁姆接种，对细菌枯萎病的研究进行直接的基因分析。

摘要

拉托尼亚索兰卡鲁姆是一种毁灭性的土壤传播的血管病原体，可以感染大量的植物物种，对农业造成重大威胁。然而，与涉及细菌植物病原体的其他模型相比，Ralstonia模型被开发起来要少得多，例如阿拉伯的伪莫纳斯西林加。旨在了解Ralstonia和作物植物之间的相互作用的研究对于开发对抗细菌枯萎病的可持续解决方案至关重要，但目前由于缺乏简单的实验测定来描述本地宿主植物中相互作用的不同成分，目前受到阻碍。在这种情况下，我们开发了一种方法来对拉子托尼亚的番茄感染进行基因分析，番茄是Ralstonia的天然宿主。该方法基于农业细菌根-介导的番茄根转化，其次是Ralstonia土壤浸湿接种的结果植物，包含转化的根表示利益的构造。根转化测定的多功能性允许执行由RNAi介导的基因过度表达或基因沉默。作为概念的证明，我们用这种方法来证明，在番茄根部，RNAi介导的SlCESA6的沉默对Ralstonia具有抵抗力。在这里，我们详细介绍了这种方法，使遗传方法能够在相对较短的时间内了解细菌枯萎病，对设备和植物生长空间的要求很小。

引言

Ralstonia Solanacearum是细菌枯萎病的病因，是一种毁灭性的土壤传播的血管病原体，其分布范围广泛，可感染多种植物，包括马铃薯、番茄、烟草、香蕉、胡椒和茄子等^。,2根据品种、气候、土壤等因素，马铃薯、马铃薯、香蕉等产量损失可达番茄、马铃薯、香蕉产量^的80-90%。然而，与涉及细菌植物病原体的其他模型相比，Ralstonia模型被开发起来相当不足，例如伪莫纳斯西林加或Xanthomonas spp。此外，大多数植物-微生物相互作用的研究都集中在植物阿拉比多普西斯塔利亚纳模型上。尽管使用这些模型的研究在很大程度上有助于我们理解植物-细菌之间的相互作用，但它们并没有解决目前理解作物植物中这些相互作用的必要性。旨在了解Ralstonia和作物植物之间的相互作用的研究对于开发对抗细菌枯萎病的可持续解决方案至关重要，但目前由于缺乏简单的实验测定来描述相互作用的不同成分，目前受到阻碍。特别是，番茄是Ralstonia的天然宿主，是全球第二大蔬菜作物，受到包括细菌枯萎病在内的^{大量疾病的影响}。在这项工作中，我们开发了一种简单的方法，对番茄的Ralstonia感染进行基因分析。该方法基于甘氏菌根-介导的番茄根转化，使用DsRed荧光作为选择标记^5，然后拉氏土壤浸湿接种的结果植物，包含转化的根表示利益的构造。根转化测定的多功能性允许执行由RNAi介导的基因过度表达或基因沉默。

此方法的潜在限制在于非转化根的残余增长。这在使用的质粒缺少允许选择转化根的报体基因的情况下尤其重要。为了解决这个问题，我们开发了一种基于抗生素选择的替代方法，它抑制了非转化根的生长，同时允许健康耐抗生素转化根的生长。由于A.根茎不诱导芽的转化，它们容易受到抗生素的影响，因此，它们应该与含抗生素的介质分开。

虽然植物对Ralstonia的抗药性并不十分了解，但一些报告将细胞壁改变与细菌枯萎的抵抗力增强有关^{66、7、8、9。7,8,9}有人建议，这些细胞壁改变影响血管发育，在植物¹⁰内，Ralstonia的生活方式的一个重要方面。编码纤维素合成酶CESA4、CESA7和CESA8的基因突变已被证明会损害继发细胞壁的完整性，导致对Ralstonia的抵抗力增强，这似乎与ABA信号⁸有关。 CESA7因此，作为我们方法的概念证明，我们进行了RNAi介导的SlCESA6（Solyc02g072240），一种继细胞壁纤维素合成酶，以及AtCESA8（At4g18780）的正交At4g18780。 SlCESA6 Solyc02g072240随后用Ralstonia进行土壤浸渍的接种表明，沉默SlCESA6增强了对细菌枯萎症状的抵抗力，这表明细胞壁介导的对Ralstonia的抗药性很可能在番茄中得到保存，并验证了我们对番茄根部细菌枯萎耐药性进行基因分析的方法。在这里，我们详细介绍了这种方法，使遗传方法能够在相对较短的时间内了解细菌枯萎病，对设备和植物生长空间的要求很小。

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研究方案

注:该方法的重要部分涉及在体外处理植物材料，因此在所有这些过程中保持无菌条件很重要，包括DsRed荧光的可视化。在所有转化过程中，番茄幼苗生长在25~28°C和16 h/8小时光/暗（130μmol光子^m-2s-1光）。板材用微孔胶带密封，以方便气体交换和蒸腾。

1. 番茄植物和植物菌种的制备

1. 用5%（v/v）次氯酸钠对番茄种子进行消毒（Solanum lycopersicum cv. Moneymaker，LA2706，番茄遗传资源中心），5分钟。用蒸馏无菌水洗涤4-5次，让种子在无菌水中缓慢摇动过夜，以利于发芽。
2. 将番茄种子转移到半强度的Murashige和Skoog（1⁄2 MS）中等，没有蔗糖（2.21克/L MS，8%v agar）。将种子保持在黑暗中 25~28 °C 三天 （图 1A）。
   注:每个构造通常需要大约 40 个种子。
3. 高压灭菌器 8.5 厘米²方形滤纸。将方形滤纸放在9厘米²方形的培养皿内，含有1⁄2 MS中等（将纸张放在agar顶部），并在每个盘子上放置6个发芽番茄种子（图1B）。用微孔胶带密封板，在25~28°C下孵育发芽种子3~4天。
4. 在植物转化前两天，在固体LB介质（使用适当的抗生素）中生长农业菌红杉MSU440。
   注:A. 根基因由胡安·安东尼奥·洛佩斯·雷兹博士提供，EEZ-CSIC，格拉纳达，西班牙。在本文中描述的实验中，使用了含有pK7GWIWG2_II-红根:CESA6或空向量作为对照的A.根基因。pK7GWIWG2_II-RedRoot含有一个报告基因，DsRed，由阿拉伯体素泛素促进剂（pAtUBQ10）驱动，并赋予对石霉素（50微克/米L）的抗药性。有可能使用其他载体进行基因过度表达，如⁵之前报告的那样。在这项工作中，SlCESA6沉默的特定片段的扩增是通过使用从番茄分离的RNA（S. lycopersicum cv. 货币制造者）的反向转录（RT）PCR获得的，并交成p-ENTR/D-TOPO载体（表1）。随后，SlCESA6-RNAi片段被克隆到pK7GWIWG2_II-红根二进制矢量中。

2. 工厂改造和选择

1. 使用无菌手术刀，切割番茄幼苗的下质质（图1C，D）。
2. 使用塑料尖端或手术刀刀片从LB介质表面采集A.根基因生物量，并小心地将切碎的番茄幼苗浸入细菌生物量中（图1E）。
3. 接种A.根茎后，用2厘米×4厘米的半圆形滤纸覆盖番茄幼苗（图1F），以保持高湿度，促进生存和新的根发育。
4. 储存经过改造的番茄苗6-7天。然后，使用无菌手术刀切割新的毛茸茸的根（图1G，H;在这一步，根尚未转换），并允许幼苗产生新的毛茸茸的根。
5. 一旦第二代新的毛茸茸的根出现（图1I），取出幼苗顶部的滤纸，再次用微孔胶带密封板。
   注:此时，变换矢量中存在 DsRed 荧光标记，可以可视化新根中的变换效率。
6. 要可视化 DsRed 荧光，请使用立体显微镜或任何其他设备进行植物体内成像（图 1J）。标记正（红色荧光）转化根，并使用无菌手术刀去除负非转化根（无红色荧光）。
7. 将显示红色荧光的幼苗转移到含有1⁄2 MS介质的新板上，以方便根系作为主根的转化根发育（图1K）。将不显示红色荧光的幼苗放在同一板中，以检查荧根（图1L）在以后的时间点出现。
8. 基于抗生素选择的替代方法
   1. 替代步骤2.5，准备半填充9厘米²方形板含有1⁄2 MS介质与适当的抗生素。在制备过程中将板倾斜约5°，以产生一个没有介质的空白空间（图2A），使芽生长，避免与抗生素接触。
   2. 替代步骤2.6，在切割第一个非转化毛根出现（步骤2.4）后，使用适当尺寸的滤纸将没有根的幼苗转移到半填充的板上（图2B）。
      注:作为阳性对照，建议用含有相同抗生素耐药性的质粒和一个报告基因（在本协议中，pK7GWIWG2_II-红根;卡那霉素50μg/mL）转化几株幼苗。
   3. 替代步骤2.7，让幼苗开发新的毛茸茸的根，并削减那些与过滤三明治纸表面不直接接触的根，因为这些根可能避免抗生素的选择。
      注:由于抗生素效应，根部发育可能比没有抗生素的板块慢。新的经过改造的毛根在将没有根的幼苗转移到半填充的板（步骤2.8.2）（图2C-E）后14-18天内出现。
9. 用2厘米x4厘米的半圆形滤纸盖住幼苗，封印板子，孵育幼苗，使其形成新的毛根。
   注:没有必要使用抗生素消除A.根茎。MS介质顶部的滤纸和蔗糖的缺乏抑制了A.根基因在板⁵上的扩散。
10. 在第一个根选择后五到七天，重复选择过程以选择新的转换根并删除非转换根。将含有转化根的幼苗转移到含有1⁄2 MS介质的新板中。

3. 转移到接种罐

1. 准备接种盆，使根部表面暴露在细菌接种中:用水浸泡接种罐，倒出多余的水，并将其放入塑料种植托盘中。使用钳子将具有转化根的选定幼苗转移到接种盆中（图3A）。
2. 用塑料包装或透明盖盖住托盘，使其保持在25~28°C和65%湿度（16 h/8 h浅/暗;130 μmol光子^m-2s-1光），以保持高湿度图3B。五、六天后取下盖子。
   注:转化后的番茄植物在转移到土壤后两到三周内准备接种（图3C）。在土壤生长过程中，番茄植物可能产生新的根，不转化。为了确定这种现象的程度，红色荧光在3周大转化番茄植物的根部中可视化。大多数根 （80%-100%）显示红色荧光，表明它们确实被转化（图3D，E）。

4. 浸土接种

1. 在28°C的轨道振动器（200Table 2^rpm）下，在phi液体介质中生长R.索兰萨鲁姆（本协议中的GMI1000株），直到静止相。
2. 通过测量细菌培养物在600nm（OD_600）的光学密度来确定细菌数量。用水稀释细菌培养物，OD₆₀₀为 0.1（在此使用的条件中，这对应于大约 10⁸个菌落形成单位 [CFU]/mL）。
3. 将16~20个含有转化番茄植物的接种罐放入接种盘（29厘米×20厘米）;图 4A。
4. 将300 mL（每株约15mL）细菌化菌（OD₆₀₀表示 0.1）倒入包含接种罐的托盘中。让他们浸泡在水泡20分钟（图4B）。
5. 准备一个新的托盘与一层盆栽土壤。将接种的锅放入新托盘（图 4C），并将托盘放入湿度为 75%、26°C 和 12 小时光和 12 小时暗光（130 μmol 光子^m-2s-1光）的生长室中。

5. 确定感染参数和统计分析

1. 评分疾病症状，如先前描述的^12，13，使用范围从0（无症状）到4（完全^12,枯萎）（图4D-H），每天后，Ralstonia接种两周。
   注:随着时间的推移，疾病指数数据从同一实验单元（每个植物）收集。

6. 基因表达分析

注:转基因的表达或靶基因的沉默可以通过RT-PCR或定量RT-PCR（qRT-PCR）来确定。

1. 从转化根系的代表性部分采集样品并提取RNA（以评估对靶基因的影响）和叶子（作为内部控制）。
2. 使用1μg总DNase处理RNA合成cDNA。
3. 通过qRT-PCR分析目标基因的基因表达。使用SlEF_-1作为内^-ΔΔCT务基因¹⁵计算^相对转录水平。
   注: 表1中列出了引素序列。

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结果

图5显示了根部用空载体（EV）转化的番茄植物的疾病症状的发展，以及根部以SlCESA6（Solyc02g072240）为对象进行根部转化的植物。 SlCESA6 Solyc02g072240疾病指数数据（图5A）是随着时间的推移根据从0到4的任意比例从同一实验单元（每个植物）收集的，并且不遵循高斯分布，排除了使用标准测试进行参数化?...

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讨论

拉尔斯托尼亚·索纳萨鲁姆对农业构成重要威胁;然而，与其他细菌病原体相比，它与其他细菌病原体（特别是在作物植物物种中）相比，与具有农业重要性的自然宿主的相互作用仍然知之甚少。在大多数情况下，基因分析受到基因改造宿主植物所需的时间和费用的阻碍。为了解决这个问题，促进番茄中拉索纳卡鲁姆感染的基因分析，我们开发了一种基于植物原体-番茄根介导转...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm square Petri-dishes
Agar powder	Sigma-Aldrich
Bacto peptone	BD (Becton and Dickinson)
Casamino acids	Sigma-Aldrich
Filter paper
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985	Berthold Technologies
Jiffy pots	Jiffy Products International A.S.
Micropore tape	3M
Murashige and Skoog medium (M519)	Phytotechlab
Pindstrup substrate	Pindstrup Mosebrug A/S
Scalpel and blade
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich
Sterile clean bench
Tweezers
Wahtman paper	Wahtman International Ltd. Maldstone
Yeast extract	OXOID