Tomatenwurzeltransformation gefolgt von Impfung mit Ralstonia Solanacearum für einfache genetische Analyse der bakteriellen Wilt-Krankheit

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode zur Tomatenwurzeltransformation, gefolgt von der Impfung mit Ralstonia solanacearum, um eine einfache genetische Analyse für die Untersuchung von bakteriellen Wilt-Erkrankungen durchzuführen.

Zusammenfassung

Ralstonia solanacearum ist ein verheerender, durch den Boden übertragener Vasoren, der eine Große Auswahl an Pflanzenarten infizieren kann und eine wichtige Bedrohung für die Landwirtschaft darstellt. Allerdings ist das Ralstonia-Modell im Vergleich zu anderen Modellen mit bakteriellen Pflanzenpathogenen, wie Pseudomonas syringae in Arabidopsis,erheblich untererforscht. Forschung auf das Verständnis der Wechselwirkung zwischen Ralstonie und Pflanzen ist wichtig, um nachhaltige Lösungen zur Bekämpfung der bakteriellen Wilt-Krankheit zu entwickeln, wird aber derzeit durch das Fehlen von einfachen experimentellen Assays behindert, um die verschiedenen Komponenten der Interaktion in einheimischen Wirtspflanzen zu charakterisieren. In diesem Szenario haben wir eine Methode entwickelt, um eine genetische Analyse der Ralstonie-Infektion von Tomaten durchzuführen, einem natürlichen Wirt von Ralstonien. Diese Methode basiert auf Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Umwandlung von Tomatenwurzeln, gefolgt von Ralstonia Boden-drenching Inokulation der resultierenden Pflanzen, die transformierte Wurzeln, die das Konstrukt des Interesses auszudrücken. Die Vielseitigkeit des Wurzeltransformationstests ermöglicht die Durchführung von Genüberexpression oder Gen-Silencing, die von RNAi vermittelt wird. Als Proof of Concept haben wir diese Methode verwendet, um zu zeigen, dass RNAi-vermitteltes Silencing von SlCESA6 in Tomatenwurzeln RalstonieResistenzverleiht. Hier beschreiben wir diese Methode im Detail, die es genetischen Ansätzen ermöglicht, bakterielle Wildeskrankheiten in relativ kurzer Zeit und mit geringen Anforderungen an Ausrüstung und Pflanzenwachstumsraum zu verstehen.

Einleitung

Ralstonia solanacearum, der Erreger der bakteriellen Wilt-Krankheit, ist ein verheerender bodenübertragener Vasor mit einer weltweiten Verbreitung, die eine große Auswahl an Pflanzenarten infizieren kann, darunter Kartoffeln, Tomaten, Tabak, Banane, Pfeffer und Auberginen, unter anderem^1,2. Ertragsverluste durch Ralstonie können 80-90% der Produktion in Tomaten, Kartoffeln oder Bananen erreichen, abhängig von Sorte, Klima, Boden und anderen Faktoren³. Allerdings ist das Ralstonia-Modell im Vergleich zu anderen Modellen mit bakteriellen Pflanzenpathogenen, wie ....

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Protokoll

HINWEIS: Wichtige Teile dieser Methode umfassen den Umgang mit Pflanzenmaterialien in vitro, und daher ist es wichtig, während all dieser Verfahren sterile Bedingungen beizubehalten, einschließlich der Visualisierung der DsRed-Fluoreszenz. DsRed Während des gesamten Transformationsprozesses wachsen Tomatensämlinge bei 25 bis 28 °C und 16 h/8 h hell/dunkel (130 mol Photonen m^-2s^-1 Licht). Die Platten sind mit Mikroporenband versiegelt, um den Gasaustausch und die Transpiration zu erleichtern.

1. Zubereitung von Tomatenpflanzen und Agrobacterium-Rhizogenen

1. Sterilisieren Sie Tomatensam....

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Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt die Entwicklung von Krankheitssymptomen von Tomatenpflanzen mit Wurzeln, die mit einem leeren Vektor (EV) transformiert wurden, und Pflanzen mit Wurzeln, die mit einem RNAi-Konstrukt transformiert wurden, das auf SlCESA6 (Solyc02g072240) abzielt. Die Krankheitsindexdaten (Abbildung 5A) werden von derselben Versuchseinheit (jede Pflanze) im Laufe der Zeit nach einer beliebigen S.......

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Diskussion

Ralstonia solanacearum stellt eine wichtige Bedrohung für die Landwirtschaft dar; Seine Wechselwirkung mit natürlichen Wirten von landwirtschaftlicher Bedeutung ist jedoch im Vergleich zu anderen bakteriellen Krankheitserregern, insbesondere bei Pflanzenarten, noch immer wenig verstanden. In den meisten Fällen wird die genetische Analyse durch die Zeit und die Kosten behindert, die für die genetische Veränderung von Wirtspflanzen erforderlich sind. Um dieses Problem anzugehen und die genetische Analyse der .......

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm square Petri-dishes
Agar powder	Sigma-Aldrich
Bacto peptone	BD (Becton and Dickinson)
Casamino acids	Sigma-Aldrich
Filter paper
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985	Berthold Technologies
Jiffy pots	Jiffy Products International A.S.
Micropore tape	3M
Murashige and Skoog medium (M519)	Phytotechlab
Pindstrup substrate	Pindstrup Mosebrug A/S
Scalpel and blade
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich
Sterile clean bench
Tweezers
Wahtman paper	Wahtman International Ltd. Maldstone
Yeast extract	OXOID