Transformación de raíz de tomate Seguida de inoculación con Ralstonia Solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de Wilt

Resumen

Aquí, presentamos un método versátil para la transformación de la raíz de tomate seguido de la inoculación con Ralstonia solanacearum para realizar un análisis genético sencillo para el estudio de la enfermedad bacteriana de la enfermedad de wilt.

Resumen

Ralstonia solanacearum es un patógeno vascular devastador que puede infectar a una amplia gama de especies vegetales, causando una amenaza importante para la agricultura. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae en Arabidopsis. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción en las plantas anfitrionas nativas. En este escenario, hemos desarrollado un método para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia de tomate, un huésped natural de Ralstonia. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, seguida de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI. Como prueba de concepto, utilizamos este método para demostrar que el silenciamiento mediado por ARNi de SlCESA6 en raíces de tomate confirió resistencia a Ralstonia. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.

Introducción

Ralstonia solanacearum, agente causal de la enfermedad bacteriana de wilt, es un patógeno vascular devastador transmitido por el suelo con una distribución mundial que puede infectar una amplia gama de especies vegetales, incluyendo papa, tomate, tabaco, plátano, pimienta y berenjena, entre otros^1,2. Las pérdidas de rendimiento causadas por Ralstonia pueden alcanzar el 80-90% de la producción en tomate, patata o plátano, dependiendo del cultivar, clima, suelo y otros factores^3. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae o Xanthomonas spp. Además, la mayoría de los estudios en interacciones entre plantas y microbios se centran en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Aunque la investigación utilizando estos modelos ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de las interacciones entre plantas y bacterias, no abordan la necesidad actual de entender estas interacciones en las plantas de cultivo. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción. Particularmente, el tomate, un huésped natural de Ralstonia,es el segundo cultivo vegetal más importante a nivel mundial y se ve afectado por una plétora de enfermedades^4,incluida la enfermedad bacteriana de wilt. En este trabajo, hemos desarrollado un método fácil para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia del tomate. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, utilizando la fluorescencia DsRed como marcador de selección^5,seguido de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI.

Una limitación potencial de este método consiste en el crecimiento residual de raíces no transformadas. Esto es particularmente importante en los casos en que el plásmido utilizado carece de un gen reportero que permita la selección de raíces transformadas. Para resolver este problema, hemos desarrollado un método alternativo basado en la selección de antibióticos, que inhibe el crecimiento de raíces no transformadas al tiempo que permite el crecimiento de raíces transformadas sanas resistentes a los antibióticos. Dado que A. rhizogenes no induce la transformación de los brotes, son susceptibles al antibiótico y, por lo tanto, deben mantenerse separados del medio que contiene antibióticos.

Aunque la resistencia de las plantas contra Ralstonia no se entiende bien, varios informes han asociado alteraciones de la pared celular a una mayor resistencia a la marchitabacteriana^6,,7,8,9. Se ha sugerido que estas alteraciones de la pared celular afectan el desarrollo vascular, un aspecto esencial para el estilo de vida de Ralstonia dentro de la planta^10. Se ha demostrado que las mutaciones en genes que codifican las sinteas de celulosa CESA4, CESA7 y CESA8 en Arabidopsis thaliana afectan la integridad de la pared celular secundaria, causando una mayor resistencia a Ralstonia,que parece estar vinculada a la señalización ABA^8. Por lo tanto, como prueba de concepto para nuestro método, realizamos silenciamiento de genes mediado por ARNi de SlCESA6 (Solyc02g072240), una celulosa de pared celular secundaria sintasa, y ortolog de AtCESA8 (At4g18780). La posterior inoculación de drenado del suelo con Ralstonia mostró que silenciar SlCESA6 mejoró la resistencia a los síntomas de marchitamiento bacteriano, lo que sugiere que la resistencia mediada por la pared celular a Ralstonia probablemente se conserva en el tomate, y validando nuestro método para llevar a cabo análisis genéticos de la resistencia bacteriana a la marchitamiento en las raíces del tomate. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.

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Protocolo

NOTA: Las partes importantes de este método implican la manipulación de materiales vegetales in vitro, y por lo tanto es importante mantener las condiciones estériles durante todos estos procedimientos, incluida la visualización de la fluorescencia DsRed. Durante todo el proceso de transformación, las plántulas de tomate crecen a 25 o28 oC y 16 h/8 h de luz/oscuridad (130 mmol fotones m^-2s^-1 luz). Las placas están selladas con cinta adhesiva de microporos para facilitar el intercambio y la transpiración de gas.

1. Preparación de plantas de tomate y Agrobacterium rhizogenes

1. Esterilizar las semillas de tomate (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Centro de Recursos de Genética del Tomate, TGRC) con 5% (v/v) hipoclorito de sodio durante 5 min. Lavar 4-5 veces con agua estéril destilada y mantener las semillas lentamente temblando en agua estéril durante la noche para facilitar la germinación.
2. Transfiera las semillas de tomate al medio de Murashige y Skoog (1/2 MS) sin sacarosa (2,21 g/L MS, 8% p/v agar). Mantener las semillas en la oscuridad a 25-28 oC durante tres días(Figura 1A).
   NOTA: Por lo general, se necesitan alrededor de 40 semillas para cada construcción.
3. Autoclave 8,5 cm² papeles de filtro cuadrados. Coloque los papeles de filtro cuadrados dentro de 9 cm² platos de petri cuadrados que contengan medio MS (coloque el papel encima del agar) y coloque seis semillas de tomate germinadas en cada plato(Figura 1B). Sellar la placa con cinta adhesiva de microporoe e incubar las semillas germinadas a 25 o 28 oC durante 3 x 4 días.
4. Cultivar Agrobacterium rhizogenes MSU440 en medio sólido de LB (con antibióticos apropiados) a 28 oC dos días antes de la transformación de la planta.
   NOTA: A. rhizogenes es proporcionado por el Dr. Juan Antonio López Ráez, EEZ-CSIC, Granada, España. En el experimento descrito en este artículo, se utilizó A. rhizogenes que contienen pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 o un vector vacío, como control. pK7GWIWG2_II-RedRoot contiene un gen reportero, DsRed, impulsado por el promotor de la ubiquitina Arabidopsis thaliana (pAtUBQ10), y confiere resistencia a la espectromicina (50 g/ml). Es posible utilizar otros vectores para la sobreexpresión genética, como se informó antes de⁵. En este trabajo, la amplificación del fragmento específico para el silenciamiento SlCESA6 se obtuvo mediante transcripción inversa (RT) PCR utilizando ARN aislado de tomate (S. lycopersicum cv. Moneymaker) y ligado en vector p-ENTR/D-TOPO (Tabla 1). Posteriormente, el fragmento SlCESA6-RNAi fue clonado en el vector binario pK7GWIWG2_II-RedRoot.

2. Transformación y selección de plantas

1. Usando un bisturí estéril, corte el radio y la parte inferior del hipocotículo de las plántulas de tomate(Figura 1C,D).
2. Cosecha A. rhizogenes biomasa de la superficie del medio LB utilizando puntas de plástico o una cuchilla de bisturí y sumerja cuidadosamente las plántulas de tomate cortadas en la biomasa bacteriana (Figura 1E).
3. Después de la inoculación con A. rizogenes, cubra las plántulas de tomate con un papel de filtro semicircular de 2 cm x 4 cm(Figura 1F),con el fin de mantener una alta humedad y facilitar la supervivencia y el desarrollo de nuevas raíces.
4. Almacene las plántulas de tomate transformadas durante 6-7 días. Luego, utilice un bisturí estéril para cortar las nuevas raíces peludas emergentes(Figura 1G,H; en este paso, las raíces aún no se transforman) y permitir que las plántulas produzcan nuevas raíces peludas.
5. Una vez que aparezca la segunda generación de nuevas raíces peludas(Figura 1I),retire el papel de filtro en la parte superior de las plántulas y vuelva a sellar la placa con cinta adhesiva de microporo.
   NOTA: En este punto, la presencia del marcador fluorescente DsRed en el vector de transformación permite visualizar la eficiencia de transformación en las nuevas raíces.
6. Para visualizar la fluorescencia DsRed, utilice un estereomicroscopio o cualquier otro equipo para la obtención de imágenes en vivo(Figura 1J). Marque las raíces transformadas positivas (fluorescencia roja) y elimine las raíces negativas no transformadas (sin fluorescencia roja) utilizando un bisturí estéril.
7. Transferir las plántulas que muestren fluorescencia roja a una nueva placa que contenga un medio MS, con el fin de facilitar el desarrollo de la raíz transformada como raíz principal(Figura 1K). Conservar las plántulas que no muestran fluorescencia roja en la misma placa para comprobar la aparición de raíces fluorescentes(Figura 1L)en puntos de tiempo posteriores.
8. Método alternativo basado en la selección de antibióticos
   1. Alternativa al paso 2.5, preparar placas cuadradas de 9 cm² semicargadas que contengan medio DeM con el antibiótico adecuado. Incline las placas aproximadamente 5o durante el proceso de preparación para generar un espacio vacío sin medio(Figura 2A),permitiendo que los brotes crezcan evitando el contacto con el antibiótico.
   2. Alternativa al paso 2.6, después de cortar las primeras raíces peludas no transformadas emergieron (paso 2.4), transfiera las plántulas sin raíces a las placas semicargadas utilizando papeles de filtro con el tamaño adecuado(Figura 2B).
      NOTA: Como control positivo, se recomienda transformar varias plántulas con un plásmido que contenga la misma resistencia a los antibióticos y un gen reportero (en este protocolo, pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamicina 50 g/ml).
   3. Alternativamente al paso 2.7, deje que las plántulas desarrollen nuevas raíces peludas y corten aquellas raíces que no están en contacto directo con la superficie de los papeles de sándwich de filtro, ya que estas raíces pueden evitar la selección de antibióticos.
      NOTA: Debido al efecto antibiótico, el desarrollo de la raíz puede ser más lento que en placas sin antibióticos. Nuevas raíces peludas transformadas aparecen dentro de 14 a 18 días después de transferir las plántulas sin raíces a las placas semillenas (paso 2.8.2)(Figura 2C-E).
9. Cubra las plántulas con un papel de filtro semicírculo de 2 cm x 4 cm, selle la placa e incubar las plántulas para dejarlas desarrollar nuevas raíces peludas.
   NOTA: No es necesario eliminar el A. rizogenes usando antibióticos. El papel filtrante en la parte superior del medio MS y la falta de sacarosa inhiben la propagación de la A. rizogenes en la placa^5.
10. Cinco a siete días después de la primera selección de raíz, repita el proceso de selección para seleccionar nuevas raíces transformadas y eliminar raíces no transformadas. Transfiera las plántulas que contienen raíces transformadas a una placa nueva que contenga un medio MS.

3. Transferencia a macetas de inoculación

1. Preparar macetas de inoculación donde la superficie de las raíces estará expuesta al inóculo bacteriano: remojar las ollas de inoculación con agua, verter cualquier exceso de agua y colocarlas en una bandeja de plantación de plástico. Transfiera las plántulas seleccionadas con raíces transformadas a macetas de inoculación utilizando pinzas(Figura 3A).
2. Cubra la bandeja con una envoltura de plástico o una tapa transparente y manténgala a 25 o28 oC y 65% de humedad (16 h/8 h de luz/oscuridad; 130 mmol fotones m^-2s^-1 luz), para mantener un alto nivel de humedad Figura 3B). Retire la cubierta después de cinco o seis días.
   NOTA: Las plantas de tomate transformadas están listas para la inoculación de dos a tres semanas después de transferirlas al suelo(Figura 3C). Durante el crecimiento en el suelo, las plantas de tomate pueden producir nuevas raíces que no se transforman. Para determinar el alcance de este fenómeno, la fluorescencia roja se visualizó en las raíces de las plantas de tomate transformadas de 3 semanas de edad. La mayoría de las raíces (80%-100%) mostraron fluorescencia roja, lo que indica que efectivamente se transforman(Figura 3D,E).

4. Inoculación de desgranación del suelo

1. Crecer R. solancearum (strain GMI1000 en este protocolo) en medio líquido phi(Tabla 2¹¹) en un agitador orbital (200 rpm) a 28oC hasta la fase estacionaria.
2. Determinar los números bacterianos midiendo la densidad óptica del cultivo bacteriano a 600 nm (OD₆₀₀). Diluir el cultivo bacteriano con agua a una Do6₆₀₀ de 0,1 (en las condiciones utilizadas aquí, esto corresponde a aproximadamente 10⁸ unidades formadoras de colonias [CFU]/mL).
3. Colocar macetas de inoculación de 16 a 20 que contengan plantas de tomate transformadas en una bandeja de inoculación (29 cm x 20 cm; Figura 4A).
4. Vierta 300 ml (15 ml por planta) de inóculo bacteriano (OD₆₀₀ de 0,1) en la bandeja que contiene las ollas de inoculación. Dejar los empaparse en el inóculo durante 20 min(Figura 4B).
5. Prepare una nueva bandeja con una capa de tierra para macetas. Mover las macetas inoculadas en la nueva bandeja(Figura 4C)y colocar las bandejas en una cámara de crecimiento con 75% de humedad, 26 x 28 oC, y un fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad (130 mómicos de luz m^-2s^-1).

5. Determinación de parámetros de infección y análisis estadístico

1. Puntuar los síntomas de la enfermedad como se describió anteriormente^12,13, utilizando una escala que va desde 0 (sin síntomas) a 4(marchitamientocompleto) ( Figura 4D-H), cada día después de la inoculación de Ralstonia durante dos semanas.
   NOTA: Los datos del índice de enfermedad se recopilan de la misma unidad experimental (cada planta) a lo largo del tiempo.

6. Análisis de la expresión génica

NOTA: La expresión del transgén o el silenciamiento del gen objetivo puede determinarse mediante RT-PCR o por RT-PCR cuantitativo (qRT-PCR).

1. Recoger muestras y extraer ARN de una parte representativa del sistema radicular transformado (para evaluar el efecto sobre el gen objetivo) y hojas (como control interno).
2. Sintetice el ADNc utilizando 1 g de ARN total tratado con DNase.
3. Analizar la expresión génica de los genes diana por qRT-PCR. Calcule los niveles de transcripción relativos utilizando el método 2^{--CT 14}, utilizando SlIF-1 como gen de limpieza¹⁵.
   NOTA: Las secuencias de imprimación se enumeran en la Tabla 1.

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Resultados

La Figura 5 muestra el desarrollo de síntomas de enfermedad de plantas de tomate con raíces transformadas con un vector vacío (EV), y plantas con raíces transformadas con una construcción de ARNi dirigida a SlCESA6 (Solyc02g072240). Los datos del índice de la enfermedad(Figura 5A)se recopilan de la misma unidad experimental (cada planta) a lo largo del tiempo de acuerdo con una escala arbi...

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Discusión

Ralstonia solanacearum representa una amenaza importante para la agricultura; sin embargo, su interacción con los huéspedes naturales de importancia agrícola todavía se entiende mal en comparación con otros patógenos bacterianos, especialmente en especies de plantas de cultivo. En la mayoría de los casos, el análisis genético se ve obstaculizado por el tiempo y los gastos necesarios para modificar genéticamente las plantas anfitrionas. Para abordar este problema y facilitar el análisis genético de la...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm square Petri-dishes
Agar powder	Sigma-Aldrich
Bacto peptone	BD (Becton and Dickinson)
Casamino acids	Sigma-Aldrich
Filter paper
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985	Berthold Technologies
Jiffy pots	Jiffy Products International A.S.
Micropore tape	3M
Murashige and Skoog medium (M519)	Phytotechlab
Pindstrup substrate	Pindstrup Mosebrug A/S
Scalpel and blade
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich
Sterile clean bench
Tweezers
Wahtman paper	Wahtman International Ltd. Maldstone
Yeast extract	OXOID