שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה רב-תכליתית לשינוי בשורש העגבניות ולאחריה החיסון לביצוע ניתוח גנטי פשוט לחקר מחלות וילט בקטריאלי.

Abstract

Ralstonia solanacearum היא אדמה הרסנית הנישאים פתוגן כלי דם שיכולים להדביק מגוון רחב של מינים צמח, גורם איום חשוב על החקלאות. עם זאת, מודל Ralstonia הוא באופן משמעותי בהשוואה למודלים אחרים מעורבים פתוגנים צמח חיידקי, כגון פסאודומונס Syringae ב arabidopsis. מחקר ממוקד כדי להבין את האינטראקציה בין Ralstonia וצמחים יבול חיוני לפתח פתרונות קיימא להילחם נגד מחלת וילט חיידקי אבל מפריע כיום על ידי חוסר הניסיוני הנסיוני הפשוט לאפיין את המרכיבים השונים של האינטראקציה צמחים מארחים יליד. בתרחיש זה, פיתחנו שיטה לבצע ניתוח גנטי של זיהום Ralstonia של עגבניה, שורה טבעית של ralstonia. שיטה זו מבוססת על Agrobacteriumמתווכת הטרנספורמציה של שורשי עגבניות, ואחריו ralstonia קרקע-drenching החיסון של הצמחים כתוצאה מכך, המכיל שורשים שהפכו המבטא את המבנה של עניין. הרב-תכליתיות של השינוי הבסיסי מאפשר ביצוע או ביטוי היתר גנטית או גנים השתקה על ידי RNAi. כהוכחה למושג, השתמשנו בשיטה זו כדי להראות כי RNAi-תיווך השתקה של SlCESA6 בשורשי עגבניות הענקת עמידות לראסטוניה. כאן, אנו מתארים את השיטה הזאת בפרוטרוט, המאפשר גישות גנטיות להבין מחלות וילט חיידקי בזמן קצר יחסית, עם דרישות קטנות של ציוד ומרחב הצמיחה צמח.

Introduction

Ralstonia solanacearum, הסוכן הסיבתי של מחלת וילט חיידקי, היא קרקע הרסנית הנגרמת פתוגן כלי דם עם התפלגות עולמית שיכולה להדביק מגוון רחב של מינים צמח, כולל תפוחי אדמה, עגבניות, טבק, בננה, פלפל וחציל, בין השאר^1,2. תשואה הפסדים שנגרמו על ידי Ralstonia יכול להגיע 80-90% של הייצור עגבניות, תפוחי אדמה או בננה, בהתאם זנים, אקלים, אדמה וגורמים אחרים³. עם זאת, מודל Ralstonia הוא באופן משמעותי בהשוואה למודלים אחרים מעורבים פתוגנים צמח חיידקי, כגון פסאודומונס syringae או קסטומונס spp. בנוסף, רוב המחקרים באינטראקציות הצמח-חיידק מתמקדים צמח המודל Arabidopsis thaliana. למרות שמחקרים המשתמשים במודלים אלה תרמו במידה רבה להבנת האינטראקציות של הצמחים-חיידקים, הם אינם מטפלים בצורך הנוכחי להבנת האינטראקציות הללו בצמחי היבול. מחקר ממוקד להבנת האינטראקציה בין Ralstonia וצמחים יבול חיוני כדי לפתח פתרונות קיימא להילחם נגד מחלת וילט חיידקי אבל מפריע כיום על ידי חוסר הניסיוני הנסיוני הישיר לאפיין את הרכיבים השונים של האינטראקציה. במיוחד, עגבניה, מארח טבעי עבור Ralstonia, הוא יבול הירקות השני החשוב ביותר ברחבי העולם והוא מושפע שפע של מחלות⁴, כולל מחלת וילט חיידקי. בעבודה זו, פיתחנו שיטה קלה לבצע ניתוח גנטי של זיהום Ralstonia של עגבניה. שיטה זו מבוססת על Agrobacteriumמתווכת הטרנספורמציה של שורשי עגבניות, באמצעות הפלואורסצנטית dsred כסמן בחירה⁵, ואחריו ralstonia קרקע-drenching של הצמחים וכתוצאה מכך, המכיל שורשים שהפכו לבטא את המבנה של עניין. הרב-תכליתיות של השינוי הבסיסי מאפשר ביצוע או ביטוי היתר גנטית או גנים השתקה על ידי RNAi.

מגבלה פוטנציאלית של שיטה זו מורכבת מגידול שיורית של שורשים שאינם משתנים. זה חשוב במיוחד במקרים שבהם השתמשו בפלסטלינה חסר גן עיתונאי המאפשר את הבחירה של שורשים שהפכו. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה חלופית המבוססת על בחירה אנטיביוטית, אשר מעכב את הצמיחה של שורשים שאינם משתנים תוך מתן אפשרות לצמיחה של שורשים בריאים עמידים לאנטיביוטיקה השתנה. מאז ה -ריזוזוגנים לא מזרז את הטרנספורמציה של נצרי, הם רגישים לאנטיביוטיקה, ולכן הם צריכים להיות מופרדים ממדיום המכיל אנטיביוטיקה.

למרות התנגדות הצמח נגד ralstonia אינו מובן היטב, דיווחים מספר יש הקשורים קיר תא שינויים התנגדות משופרת חיידקים^{וילט 6,7,8,9}.⁶ הוצע כי אלה שינויים קיר התא משפיעים על פיתוח כלי דם, היבט חיוני לאורח החיים של Ralstonia בתוך הצמח¹⁰. מוטציות בגנים קידוד התאית סטנדרטים CESA4, CESA7 ו CESA8 ב arabidopsis thaliana הוכחו לפגוע שלמות הקיר התא המשני, גרימת עמידות משופרת RALSTONIA, אשר נראה קשור ל-ABA איתות⁸. לכן, כהוכחה למושג של השיטה שלנו, ביצעת גן RNAi-תיווך השתקה של SlCESA6 (Solyc02g072240), תא משני הקיר תאית סטנדרטים, ו אורתולוג של AtCESA8 (At4g18780). בעקבות הקרקע-drenching החיסון עם Ralstonia הראה כי השתקה SlCESA6 התנגדות משופרת לתסמינים וילט בקטריאלי, הרומז כי התא התנגדות מתווכת כדי ralstonia סביר להניח בעגבניה, ולאמת את השיטה שלנו כדי לבצע ניתוח גנטי של התנגדות וילט חיידקי בשורשי עגבניות. כאן, אנו מתארים את השיטה הזאת בפרוטרוט, המאפשר גישות גנטיות להבין מחלות וילט חיידקי בזמן קצר יחסית, עם דרישות קטנות של ציוד ומרחב הצמיחה צמח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: חלקים חשובים של שיטה זו כרוכים בטיפול בחומרים צמחיים, ולכן חשוב לשמור על התנאים הסטריליים במהלך כל ההליכים הללו, כולל ההדמיה של הקרינה הפלואורסצנטית של Dsred . במהלך כל תהליך השינוי, שתילי עגבניות לגדול ב 25-28 ° צ' ו 16 h/8 h אור/כהה (130 μm בפוטונים מ^-2s^-1 אור). הצלחות חתומות בסרט מיקרונקבוביות כדי להקל על החלפת הדלק והדיות.

1. הכנת צמחי עגבניות ואגרואכטריום

1. לחטא זרעי עגבניות (Solanum lycopersicum Cv. MONEYMAKER, LA2706, עגבניה מרכז משאבים, TGRC) עם 5% (v/v) היפוכלוריט נתרן עבור 5 דקות. לשטוף 4-5 פעמים עם מים סטרילי מזוקקים ולשמור את הזרעים לרעוד לאט במים סטרילי לאורך הלילה כדי להקל על נביטה.
2. להעביר את זרעי עגבניות מורראשיג בחצי כוח ו Skoog (1/2 MS) בינונית ללא סוכרוז (2.21 g/L MS, 8% w/v אגר). שמרו את הזרעים בחשיכה ב -25 עד 28 ° צ' במשך שלושה ימים (איור 1א).
   הערה: סביב 40 הזרעים נדרשים בדרך כלל עבור כל מבנה.
3. אוטוקלב 8.5 ס מ² מסנן משבצת מסמכים. מניחים את הניירות מסנן ריבוע בתוך 9 ס מ² מנות פטרי מרובע המכיל 1/2 MS בינונית (במקום את הנייר על גבי אגר) ובמקום שש זרעי עגבניות מונבטים על כל צלחת (איור 1B). לאטום את הצלחת עם סרט מיקרונקבוביות ו מודקת את הזרעים מונבטים ב 25-28 ° c עבור 3 לארבעה ימים.
4. גדל Agrobacterium MSU440 בינונית LB מוצק (עם אנטיביוטיקה המתאים) ב 28 ° c יומיים לפני שינוי הצמח.
   הערה: מסופק על ידי ד ר חואן אנטוניו לופז RÁEZ, EEZ-Csic, גרנדה, ספרד. בניסוי המתואר במאמר זה, שימשו את הpK7GWIWG2_II-RedRoot:: CESA6 או וקטור ריק, כפקד, בשימוש. pK7GWIWG2_II-RedRoot מכיל גן עיתונאי, Dsred, מונע על ידי האריידרופסיס thaliana היזם (pAtUBQ10), ו לדון התנגדות Spectinomycin (50 μg/mL). ניתן להשתמש בווקטורים אחרים להבעת גנים, כפי שדווח לפני⁵. בעבודה זו, הגברה של הקטע הספציפי עבור SlCESA6 השתקה הושגה על ידי שעתוק הפוכה (RT) PCR באמצעות RNA מבודדים מעגבניות (S. Lycopersicum cv. moneymaker) ו להכניס לתוך p-ENTR/D-topo וקטור (שולחן 1). לאחר מכן, המקטע SlCESA6-RNAi שוכפל בווקטור הבינארי של PK7GWIWG2_II-RedRoot.

2. התמרת ובחירת צמחים

1. באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך את הרדילה ואת החלק התחתון של ההיפוטיל של שתילי עגבניות (איור 1ג, ד).
2. בציר A. ריזוזוגנים ביומסה מפני השטח של מדיום LB באמצעות עצות פלסטיק או להב אזמל ולטבול בזהירות את שתילי עגבניות לחתוך ביומסה חיידקי (איור 1E).
3. לאחר החיסון עם . ריזוזוגנס, כסו את שתילי העגבניות בנייר מעגלי בגודל 2 ס"מ וחצי עגול (איור 1F), על מנת לשמור על לחות גבוהה ולהקל על ההישרדות ופיתוח השורש החדש.
4. לאחסן את שתילי העגבניות השתנו במשך 6-7 ימים. לאחר מכן, השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך את השורשים המתעוררים החדשים (איור 1G, H; בשלב זה, השורשים אינם משתנים עדיין) ולאפשר לשתילים לייצר שורשים חדשים שעירים.
5. לאחר הדור השני של השורשים השעירים החדשים מופיעים (איור 1I), להסיר את נייר הסינון על גבי השתילים, ולחתום את הצלחת עם קלטת מיקרונקבובית שוב.
   הערה: בשלב זה, הנוכחות של סמן הפלורסנט DsRed בווקטור השינוי מאפשרת להמחיש את יעילות השינוי בשורשים החדשים.
6. כדי להמחיש את הקרינה הפלואורסצנטית האדום, השתמש stereomicroscope או כל ציוד אחר עבור המפעל vivo הדמיה (איור 1J). סמן את חיובי (פלואורסצנטית אדום) הופך שורשים ולהסיר את השורשים הלא משתנה שלילית (אין זריחה אדומה) באמצעות אזמל סטרילי.
7. להעביר את השתילים מראה פלואורסצנטית אדום לצלחת חדשה המכילה 1/2 MS בינונית, כדי להקל על פיתוח של השורש ההפוך כמו השורש הראשי (איור 1K). שמור את השתילים שאינם מראים ניאון אדום באותה צלחת כדי לבדוק את הופעתה של שורשי פלורסנט (איור 1L) בנקודות זמן מאוחרות יותר.
8. שיטה חלופית המבוססת על בחירה אנטיביוטית
   1. חלופה לשלב 2.5, להכין חצי מלא^{9 ס מ} לוחיות הריבוע המכיל 1/2 MS בינוני עם אנטיביוטיקה המתאים. שיפוע לוחות כ 5 ° במהלך תהליך ההכנה כדי ליצור חלל ריק ללא בינונית (איור 2א), המאפשר נצרי לצמוח להימנע ממגע עם אנטיביוטיקה.
   2. חלופה לשלב 2.6, לאחר חיתוך השורשים השעיר הראשון שאינו שינוי התפתחה (שלב 2.4), להעביר את השתילים ללא שורשים הצלחות חצי מלא באמצעות ניירות מסנן עם הגודל המתאים (איור 2B).
      הערה: בתור שליטה חיובית, מומלץ להפוך מספר שתילים עם פלסטלינה המכיל את העמידות לאנטיביוטיקה זהה גן עיתונאי (בפרוטוקול זה, pK7GWIWG2_II-RedRoot; כולל 50 μg/mL).
   3. חלופה לשלב 2.7, לתת לשתילים לפתח שורשים שעירים חדשים ולגזור אלה שורשים שאינם במגע ישיר עם פני השטח של מסנן סנדוויץ הניירות, מאז שורשים אלה יכולים להימנע בחירה אנטיביוטית.
      הערה: בשל אפקט האנטיביוטיקה, פיתוח השורש עשוי להיות איטי יותר מאשר בצלחות ללא אנטיביוטיקה. שורשים שעירים חדשים מופיעים בתוך 14 עד 18 ימים לאחר העברת השתילים ללא שורשים ללוחות חצי מלאים (שלב 2.8.2) (איור 2ג-ה).
9. מכסים את השתילים עם נייר 2 ס"מ x 4 ס מ מסנן לחצי עיגול, לאטום את הצלחת ואת השתילים שתילים לתת להם לפתח שורשים חדשים שעירים.
   הערה: אין צורך לחסל את הא. ריזוזוגנים באמצעות אנטיביוטיקה. נייר הסינון על גבי המדיום הטרשת הנפוצה והיעדר הסוכות מעכבים את התפשטות החלק העליון של מבנה ה-"לוחית ⁵".
10. חמישה עד שבעה ימים לאחר בחירת השורש הראשונה, חזור על תהליך הבחירה כדי לבחור שורשים חדשים שעברו טרנספורמציה ולהסיר שורשים שאינם משתנים. להעביר את השתילים המכילים שורשים השתנה לצלחת חדשה המכילה 1/2 MS מדיום.

3. העברה לחיסונים

1. הכינו את משטח השורשים לפני שהמשטחים ייחשפו לחיידק החיידקי: משרים את כלי החיסונים במים, יוצקים את כל המים העודפים, ומניחים אותם במגש לזריעת פלסטיק. העבירו את השתילים הנבחרים עם שורשים שהפכו לחיסונים בעזרת מלקחיים (איור 3א).
2. כסו את המגש עם עטיפת ניילון או מכסה שקוף ושמרו אותם בגובה 25 עד 28 ° צ' ו 65% לחות (16 h/8 שעות^אור/ כהה; 130^μ:00), כדי לשמור על רמה גבוהה של לחות באיור 3B). הסירו את הכיסוי. לאחר חמישה או שישה ימים
   הערה: צמחי העגבנייה הפכו להיות מוכנים לחיסונים שבועיים-שלושה לאחר העברתם לקרקע (איור 3ג). במהלך הגידול על הקרקע, צמחי עגבניות עשויים לייצר שורשים חדשים שאינם משתנים. כדי לקבוע את מידת התופעה, הפלואורסצנטית האדום היה דמיינו בשורשים של שלושה שבועות בן צמחים עגבניות שהפכו. רוב השורשים (80%-100%) הראה פלואורסצנטית אדום, המציין כי הם אכן הפכו (איור 3D, E).

4. אדמה-החיסון

1. לגדול ר solancearum (זן GMI1000 בפרוטוקול זה) במדיום נוזלי פי (שולחן 2¹¹) ב שייקר מסלולית (200 rpm) ב 28 ° צ' עד השלב הנייח.
2. לקבוע מספרים חיידקיים על ידי מדידת הדחיסות האופטית של התרבות החיידקית ב 600 ננומטר (OD₆₀₀). לדלל את התרבות החיידקית עם מים כדי OD₆₀₀ של 0.1 (בתנאים המשמשים כאן, זה מתאים כ 10⁸ יחידות המושבה ויוצרים [cfu]/ml).
3. מניחים 16-20 מפעלי עגבניות שעברו שינוי במגש (29 ס מ x 20 ס מ; איור 4א).
4. יוצקים 300 mL (~ 15 מ"ל לכל מפעל) של חיידקים (OD₆₀₀ של 0.1) לתוך המגש המכיל את החיסונים. תנו להם לטבול באינוסינה במשך 20 דקות (איור 4ב').
5. הכינו מגש חדש עם שכבה של אדמת השתילה. להעביר את הסירים מחוסן לתוך המגש החדש (איור 4ג) ומניחים את המגשים בחדר הגידול עם 75% לחות, 26-28 ° c, ו photoperiod של 12 h אור ו 12 h החושך (130 μ:4 מתוך הפוטונים m^-1 אור).

5. קביעת פרמטרים לזיהום וניתוח סטטיסטי

1. ציון תסמיני המחלה כפי שתוארו בעבר^12,13, באמצעות סולם החל מ -0 (אין סימפטומים) כדי 4 (להשלים ווילטינג) (איור 4D-H), כל יום אחרי ralstonia החיסון לשבועיים.
   הערה: נתוני אינדקס המחלה נאספים מאותה יחידה ניסיונית (כל צמח) לאורך זמן.

6. ביטוי גנטי ניתוח

הערה: הביטוי של הטרנסוגן או השתקה של גן היעד ניתן לקבוע על ידי RT-PCR או על ידי RT-pcr כמותי (רביעיית-PCR).

1. לאסוף דגימות ולחלץ RNA מחלק נציג של מערכת השורש השתנה (כדי להעריך את ההשפעה על הגן היעד) ועלים (כמו שליטה פנימית).
2. לסנתז cDNA באמצעות 1 μg של הכולל מטופלים DNase-RNA.
3. לנתח את הביטוי הגנטי של גנים היעד על ידי רביעיית-PCR. לחשב את רמות התמלול יחסית באמצעות 2^-ΔΔCT שיטה¹⁴, באמצעות slefα-1 כתחזוקת גן¹⁵.
   הערה: רצף תחל מופיע בטבלה 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 5 מראה את ההתפתחות של תסמיני המחלה של צמחי עגבניות עם שורשים שהפכו עם וקטור ריק (EV), וצמחים עם שורשים השתנה עם בניית rnai מיקוד SlCESA6 (Solyc02g072240). נתוני מדד המחלה (איור 5א) נאספים מאותה יחידה ניסיונית (כל צמח) לאורך זמן, בהתאם ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ralstonia סולאליום מהווה איום חשוב לחקלאות; עם זאת, האינטראקציה שלה עם המארחים הטבעי של החשיבות החקלאית הוא עדיין הבין באופן גרוע לעומת פתוגנים חיידקיים אחרים, במיוחד בגידולים מינים צמח. ברוב המקרים, ניתוח גנטי מפריע הזמן וההוצאות הדרושות כדי לשנות גנטית צמחים מארחים. כדי לטפל בבעיה זו ול...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm square Petri-dishes
Agar powder	Sigma-Aldrich
Bacto peptone	BD (Becton and Dickinson)
Casamino acids	Sigma-Aldrich
Filter paper
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985	Berthold Technologies
Jiffy pots	Jiffy Products International A.S.
Micropore tape	3M
Murashige and Skoog medium (M519)	Phytotechlab
Pindstrup substrate	Pindstrup Mosebrug A/S
Scalpel and blade
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich
Sterile clean bench
Tweezers
Wahtman paper	Wahtman International Ltd. Maldstone
Yeast extract	OXOID