Томатный корень Преобразование После прививки с Ralstonia Solanacearum для straightforward генетического анализа бактериальной болезни Wilt

Резюме

Здесь мы представляем универсальный метод для преобразования корня томатов после прививки с Ralstonia solanacearum для выполнения простого генетического анализа для изучения бактериального заболевания увядания.

Аннотация

Ralstonia solanacearum является разрушительным почвенных сосудистых патогенов, которые могут инфицировать большой спектр видов растений, вызывая важную угрозу для сельского хозяйства. Тем не менее, модель Ralstonia значительно недостаточно изучена по сравнению с другими моделями с участием бактериальных растительных патогенов, таких как Pseudomonas шприцев в Arabidopsis. Исследования, направленные на понимание взаимодействия между Ralstonia и растениеводства имеет важное значение для разработки устойчивых решений для борьбы с бактериальной болезнью увядания, но в настоящее время препятствует отсутствие простых экспериментальных анализов для характеристики различных компонентов взаимодействия в местных растений-хозяев. В этом сценарии, мы разработали метод для выполнения генетического анализа Ralstonia инфекции помидоров, естественный хозяин Ralstonia. Этот метод основан на агробактерии rhizogenes-опосредоченнойтрансформации томатных корней, а затем Ralstonia почво-заливание прививки результирующих растений, содержащие преобразованные корни, выражающие конструкцию интереса. Универсальность ассея преобразования корня позволяет выполнять либо генную переэкспрессию, либо заглушку генов, опосредованные РНК. В качестве доказательства концепции, мы использовали этот метод, чтобы показать, что РНК-опосредованного замалчивания SlCESA6 в томатных корней присваивал сопротивление Ralstonia. Здесь мы подробно описываем этот метод, позволяющий генетическим подходам понимать бактериальное заболевание увядание за относительно короткое время и с небольшими требованиями оборудования и пространства роста растений.

Введение

Ralstonia solanacearum, причинно-следственный агент бактериального увядания болезни, является разрушительным почвенных сосудистых патогенов с мировым распространением, которые могут заразить широкий спектр видов растений, в том числе картофель, помидоры, табак, банан, перец и баклажаны, среди других^1,2. Потери урожайности, вызванные Ralstonia может достигать 80-90% производства в томате, картофеле или банане, в зависимости от сорта, климата, почвы и других факторов³. Тем не менее, модель Ralstonia значительно недостаточно изучена по сравнению с другими моделями с участием бактериальных растительных патогенов, таких как Pseudomonas шприцев или Xanthomonas spp. Кроме того, большинство исследований в растительно-микробных взаимодействий сосредоточены на модели завода Arabidopsis thaliana. Хотя исследования с использованием этих моделей в значительной степени способствовали нашему пониманию взаимодействия растений и бактерий, они не решают текущую необходимость понять эти взаимодействия в растениеводстве. Исследования, направленные на понимание взаимодействия между Ralstonia и растениеводства имеет важное значение для разработки устойчивых решений для борьбы с бактериальными болезнями увядания, но в настоящее время препятствует отсутствие простых экспериментальных анализов для характеристики различных компонентов взаимодействия. В частности, помидор, естественный хозяин для Ralstonia, является вторым по значимости овощной культурой во всем мире и зависит от множества заболеваний⁴, в том числе бактериальной болезни увядания. В этой работе мы разработали простой метод для выполнения генетического анализа инфекции Ralstonia помидоров. Этот метод основан на Agrobacteriumrhizogenes-опосредоченной трансформации томатных корней, используя DsRed флуоресценции в качестве маркера отбора⁵, а затем Ralstonia почво-залитой прививки результирующих растений, содержащих преобразованные корни, выражающие конструкцию интереса. Универсальность ассея преобразования корня позволяет выполнять либо генную переэкспрессию, либо заглушку генов, опосредованные РНК.

Потенциальное ограничение этого метода заключается в остаточном росте непреобразованных корней. Это особенно важно в тех случаях, когда плазмида используется не хватает репортера гена, который позволяет выбор преобразованных корней. Для решения этой проблемы мы разработали альтернативный метод, основанный на отборе антибиотиков, который тормозит рост непреобразованных корней, позволяя при этом расти здоровыми устойчивыми к антибиотикам трансформированными корнями. Так как A. rhizogenes не вызывает трансформацию побегов, они восприимчивы к антибиотику, и, следовательно, они должны быть отделены от антибиотикосодержащей среды.

Хотя сопротивление растений против Ralstonia не очень хорошо понимается, несколько докладов связаны изменения клеточной стенки к повышенной устойчивости к бактериальной увядание^6,7,8,9. Было высказано предположение, что эти изменения клеточной стенки влияют на развитие сосудов, важным аспектом для образа жизни Ralstonia внутри растения¹⁰. Мутации в генах, кодирующих целлюлозные синтазы CESA4, CESA7 и CESA8 в Arabidopsis thaliana, как было показано, ухудшают целостность вторичной клеточной стенки, вызывая повышенную устойчивость к Ralstonia, который, как представляется, связан с ABA сигнализации⁸. Таким образом, в качестве доказательства концепции для нашего метода, мы выполнили РНК-опосредованного гена глушить SlCESA6 (Solyc02g0722240), вторичные клеточной стенки целлюлозы синтазы, и орфогирование AtCESA8 (At4g18780). Последующие почво-заливание прививки с Ralstonia показали, что заглушая SlCESA6 повышенной устойчивостью к бактериальным симптомам увядания, предполагая, что клеточная стенка опосредованного сопротивления Ralstonia, вероятно, сохраняется в томатах, и проверки нашего метода для проведения генетического анализа бактериальной устойчивости увядания в томатных корней. Здесь мы подробно описываем этот метод, позволяющий генетическим подходам понимать бактериальное заболевание увядание за относительно короткое время и с небольшими требованиями оборудования и пространства роста растений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Важные части этого метода включают обработку растительных материалов in vitro, и поэтому важно поддерживать стерильные условия во время всех этих процедур, включая визуализацию фторесценции DsRed. В течение всего процесса преобразования, саженцы томатов растут на 25-28 c и 16 h/8 h свет/темный (130 фотонов м^-2s^-1 свет). Плиты запечатываются микропорелентной лентой для облегчения газообмена и транспирации.

1. Приготовление томатных растений и агробактерии ризогенов

1. Стерилизовать семена томатов(Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Томатный генетика Ресурсный центр, TGRC) с 5% (v/v) гипохлорит натрия в течение 5 мин. Вымойте 4-5 раз дистиллированной стерильной водой и держать семена медленно трясутся в стерильной воде в течение ночи, чтобы облегчить прорастание.
2. Перенесите семена помидоров в половину прочности Мурашиге и Скуг (1/2 MS) среды без сахарозы (2,21 г / л MS, 8% ж / V агар). Держите семена в темноте при 25-28 градусах По Цельсия в течение трех дней(рисунок 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Около 40 семян, как правило, необходимы для каждой конструкции.
3. Автоклав 8,5 см² квадратных фильтра бумаги. Поместите квадратные фильтровальные бумаги внутри 9 см² квадратных петри блюда, содержащие 1 '2 MS среды (место бумаги на вершине агара) и место шесть проросшие семена помидоров на каждой тарелке(Рисунок 1B). Запечатайте тарелку микропорой лентой и инкубируем проросшие семена при 25–28 градусах Цельсия в течение 3–4 дней.
4. Выращивайте агробактерии rhizogenes MSU440 в твердой среде LB (с соответствующими антибиотиками) при 28 градусах Цельсия за два дня до превращения растений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: A. rhizogenes предоставляется д-р Хуан Антонио Лопес Реес, ЭЭЗ-CSIC, Гранада, Испания. В эксперименте, описанном в этой статье, были использованы а. rhizogenes, содержащий pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 или пустой вектор, как контроль. pK7GWIWG2_II-RedRoot содержит ген репортера, DsRed, движимый арабидопсис thaliana ubiquitin промоутер(pAtUB-10), и придает устойчивость к спектромицин (50 мкг/мл). Можно использовать другие векторы для экспрессии генов, как сообщалось до⁵. В этой работе, усиление конкретного фрагмента для SlCESA6 глушитель был получен путем обратной транскрипции (RT) PCR с использованием РНК изолированы от помидора (S. lycopersicum cv. Moneymaker) и ligated в p-ENTR/D-TOPO вектор (Таблица 1). Впоследствии фрагмент SlCESA6-RNAi был клонирован в бинарный вектор pK7GWIWG2_II-RedRoot.

2. Преобразование и выбор растений

1. Используя стерильный скальпель, вырезать радикль и дно гипокотила саженцев помидоров(рисунок 1C,D).
2. Урожай A. rhizogenes биомассы с поверхности среды LB с помощью пластиковых наконечников или скальпеля лезвие и осторожно окунуть нарезанные саженцы помидоров в бактериальной биомассы (Рисунок 1E).
3. После прививки с A. rhizogenes,покрыть саженцы помидоров с 2 см х 4 см полукруглой фильтровальной бумагой(Рисунок 1F), для того, чтобы сохранить высокую влажность и облегчить выживание и новые корни развития.
4. Храните преображеную саженцы помидоров в течение 6-7 дней. Затем используйте стерильный скальпель, чтобы вырезать новые новые волосатые корни(рисунок 1G,H;на этом этапе корни еще не преобразились) и позвольте саженцы производить новые волосатые корни.
5. Как только появляются новые волосатые корни(рисунок 1I),удалите фильтровальную бумагу поверх саженцев и снова запечатайте тарелку микропоревой лентой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент наличие флуоресцентного маркера DsRed в векторе трансформации позволяет визуализировать эффективность преобразования в новых корнях.
6. Для визуализации dsRed флуоресценции, используйте стереомикроскоп или любое другое оборудование для изображения растительного виво(рисунок 1J). Отметьте положительные (красная флуоресценция) преобразуйте корни и удалите отрицательные непреобразованные корни (без красной флуоресценции) с помощью стерильного скальпеля.
7. Передача саженцев с красной флуоресценцией на новую пластину, содержащую 1/2 MS среды, для того, чтобы облегчить развитие преобразованного корня в качестве основного корня (Рисунок 1K). Держите саженцы, которые не показывают красную флуоресценцию в той же пластине, чтобы проверить появление флуоресцентных корней(Рисунок 1L) в более поздних точках времени.
8. Альтернативный метод, основанный на выборе антибиотиков
   1. Альтернатива шагу 2.5, приготовьте полузаполненные 9 см² квадратных пластины, содержащие 1/2 MS среды с соответствующим антибиотиком. Выщелачивайте пластины примерно на 5 градусов в процессе подготовки для создания пустого пространства без среды(рисунок 2А),что позволяет побегам расти, избегая контакта с антибиотиком.
   2. Альтернатива шагу 2.6, после резки первых непреобразованных волосатых корней появились (шаг 2.4), перенесите саженцы без корней на полузаполненные пластины с помощью фильтровальных бумаг с соответствующим размером(рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве положительного контроля рекомендуется преобразовать несколько саженцев с плазмид, содержащий ту же резистентность к антибиотикам и ген репортера (в этом протоколе, pK7GWIWG2_II-RedRoot; канамицин 50 мкг/мл).
   3. Альтернатива шагу 2.7, пусть саженцы развивать новые волосатые корни и сократить те корни, которые не находятся в непосредственном контакте с поверхностью фильтра сэндвич бумаги, так как эти корни могут избежать выбора антибиотиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за эффекта антибиотика, развитие корня может быть медленнее, чем в тарелках без антибиотиков. Новые преобразованные волосатые корни появляются в течение 14–18 дней после переноса саженцев без корней на полузаполненные пластины (шаг 2.8.2)(рисунок 2C-E).
9. Накройте саженцы полукруговой фильтрующей бумагой 2 см х 4 см, запечатайте тарелку и насижайте саженцы, чтобы дать им развить новые волосатые корни.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости устранять А. rhizogenes с помощью антибиотиков. Фильтровная бумага поверх среды MS и отсутствие сахарозы препятствуют распространению Ризогенов A. на пластине⁵.
10. Через пять-семь дней после первого отбора корней повторите процесс отбора, чтобы выбрать новые преобразованные корни и удалить непреобразованные корни. Перенесите саженцы, содержащие трансформированные корни, в новую пластину, содержащую 1/2 мс среды.

3. Перевод на прививки горшки

1. Приготовьте прививочные горшки, где поверхность корней будет подвергаться воздействию бактериального инокулума: замочите прививочные горшки с водой, слейте излишки воды и поместите их в пластиковый посадочный лоток. Перенесите выбранные саженцы с преобразованными корнями в прививочной горшки с помощью пинцета(рисунок 3А).
2. Обложка лоток с полиэтиленовой пленкой или прозрачной крышкой и держать их на 25-28 C и 65% влажности (16 ч/8 ч свет /темный; 130 моль фотонов м^-2s^-1 свет), для поддержания высокого уровня влажности Рисунок 3B). Снимите крышку через пять или шесть дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразованные томатные растения готовы к прививке через две-три недели после переноса их в почву(рисунок 3C). Во время роста на почве, томатные растения могут производить новые корни, которые не преобразуются. Чтобы определить масштабы этого явления, красная флуоресценция была визуализирована в корнях 3-недельных преобразованных томатных растений. Большинство корней (80%-100%) показал красную флуоресценцию, указывая, что они действительно преобразованы(Рисунок 3D, E).

4. Прививка, пропитанная почвой

1. Расти R. solancearum (напряжение GMI1000 в этом протоколе) в фи жидкой среде(Таблица 2¹¹) в орбитальной шейкер (200 об/ ч) при 28 градусах Цельсия до стационарной фазы.
2. Определить бактериальные числа путем измерения оптической плотности бактериальной культуры на 600 нм (OD₆₀₀). Разбавить бактериальную культуру водой до OD₆₀₀ 0.1 (в условиях, используемых здесь, это соответствует примерно 10⁸ колоний формирования единиц (CFU)/mL).
3. Поместите в прививочной лоток прививки от 16 до 20 см, содержащую преобразованные томатные растения; Рисунок 4А).
4. Налейте 300 мл (15 мл на растение) бактериального инокулума (OD₆₀₀ из 0,1) в лоток, содержащий прививочные горшки. Пусть они впитывают сявок в течение 20 мин(рисунок 4B).
5. Подготовьте новый лоток со слоем почвы для заливки. Переместите привитые горшки в новый лоток(рисунок 4C) и поместите лотки в камеру роста с 75% влажности, 26-28 градусов по Цельсию, и фотопериод 12 ч света и 12 ч темноты (130 фотонов м^-2s^-1 свет).

5. Определение параметров инфекции и статистический анализ

1. Оценка симптомов болезни, как ранее описано^12,13, используя шкалу от 0 (без симптомов) до 4 (полное увядание) (Рисунок 4D-H), каждый день после прививки Ralstonia в течение двух недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данные индекса болезни собираются из одного и того же экспериментального блока (каждого растения) с течением времени.

6. Анализ экспрессии генов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение трансгена или замалчивание гена-мишени может быть определено RT-PCR или количественным RT-PCR (qRT-PCR).

1. Соберите образцы и извлеките РНК из репрезентативной части преобразованной корневой системы (для оценки влияния на ген цели) и листьев (как внутренний контроль).
2. Синтезировать кДНК с использованием 1 мкг общей РТС, обработанной DNase.
3. Анализ экспрессии генов-мишеней по qRT-PCR. Рассчитайте относительные уровни транскрипции, используя метод 2^{-ЗККТ 14}, используя SlEF-1 в качестве гена домашнего хозяйства¹⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Праймер последовательности перечислены в таблице 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 5 показано развитие симптомов заболевания томатных растений с корнями, преобразованных с пустым вектором (EV), а растения с корнями, преобразованные с помощью конструкции РНК, ориентированной на SlCESA6 (Solyc02g072240). Данные индекса болезни<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Ralstonia solanacearum представляет собой серьезную угрозу для сельского хозяйства; однако его взаимодействие с природными хозяевами сельскохозяйственного значения по-прежнему плохо понимается по сравнению с другими бактериальными патогенами, особенно у видов растениеводства. В большин?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm square Petri-dishes
Agar powder	Sigma-Aldrich
Bacto peptone	BD (Becton and Dickinson)
Casamino acids	Sigma-Aldrich
Filter paper
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985	Berthold Technologies
Jiffy pots	Jiffy Products International A.S.
Micropore tape	3M
Murashige and Skoog medium (M519)	Phytotechlab
Pindstrup substrate	Pindstrup Mosebrug A/S
Scalpel and blade
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich
Sterile clean bench
Tweezers
Wahtman paper	Wahtman International Ltd. Maldstone
Yeast extract	OXOID