세균성 윌트 질병의 간단한 유전 분석을 위한 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 접종에 이어 토마토 뿌리 변환

요약

여기에서, 우리는 세균성 wilt 질병의 연구 연구를 위한 간단한 유전 분석을 능력을 발휘하기 위하여 랄스토니아 solanacearum를 가진 접종에 선행된 토마토 뿌리 변환을 위한 다재다능한 방법을 제시합니다.

초록

랄스토니아 솔라나세아룸은 광범위한 식물 종을 감염시켜 농업에 중요한 위협을 야기할 수 있는 파괴적인 토양 매개 혈관 병원체입니다. 그러나, Ralstonia 모형은 애기장대에있는 슈도모나스 주사기와 같은 세균성 식물 병원체를 관련시키는 그밖 모형에 비해 상당히 미개척입니다. 랄스토니아와 작물 식물 사이의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 연구는 세균성 wilt 질병에 맞서 싸울 수있는 지속 가능한 솔루션을 개발하는 데 필수적이지만 현재 네이티브 호스트 식물에서 상호 작용의 다른 구성 요소를 특성화하는 간단한 실험 분석의 부족에 의해 방해된다. 이 시나리오에서는, 우리는 토마토의 랄스토니아 감염의 유전 분석을 수행하는 방법을 개발했다, 랄스토니아의자연 호스트. 이 방법은 아그로박테리움 뿌리줄기-매개형질전환, 그 다음에 생성된 식물의 랄스토니아 토양-흠뻑 적시성 접종, 관심의 구성을 표현하는 형질전환 뿌리를 함유한다. 근형 형질분석법의 다양성은 RNAi에 의해 매개된 유전자 과발현 또는 유전자 침묵을 능력을 발휘할 수 있게 한다. 개념의 증거로, 우리는 RNAi 매개 토마토 뿌리에서 SlCESA6의 침묵이 랄스토니아에저항을 부여 것을 보여주기 위해이 방법을 사용 . 여기에서는 이 방법을 자세히 설명하여 비교적 짧은 시간 및 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 세균성 질병을 이해하는 유전 적 접근법을 가능하게합니다.

서문

Ralstonia solanacearum,세균성 wilt 질병의 인과 에이전트는, 감자, 토마토, 담배, 바나나, 후추 및 가지를 포함하여 식물 종의 큰 범위를 감염시킬 수 있는 세계적인 분포를 가진 파괴적인 토양 품어진 혈관 병원체, 그 외의 사이에서^1,,2. 랄스토니아에 의한 수율 손실은 품종, 기후, 토양 및 기타 요인에 따라 토마토, 감자 또는 바나나생산의 80-90 %에 도달 할 수 있습니다³. 그러나, 랄스토니아 모델은 슈도모나스 주사기 또는 산토모나스 종과같은 세균성 식물 병원균을 포함하는 다른 모델과 비교하여 상당히 미개척이다. 추가적으로, 식물 미생물 상호 작용에 있는 대부분의 연구 결과는 모델 식물 애기장대 탈리아나에 집중됩니다. 비록 이러한 모델을 사용 하 여 연구는 크게 식물-박테리아 상호 작용의 우리의 이해에 기여, 그들은 작물 식물에서 이러한 상호 작용을 이해 하는 현재 필요성을 해결 하지 않습니다. 랄스토니아와 작물 식물 사이의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 연구는 세균성 wilt 질병에 맞서 싸울 수있는 지속 가능한 솔루션을 개발하는 데 필수적이지만 현재 상호 작용의 다른 구성 요소를 특성화하는 간단한 실험 분석의 부족에 의해 방해된다. 특히, 랄스토니아의천연 숙주인 토마토는 전 세계적으로 두 번째로 중요한 채소 작물이며 세균성 질병을 포함한 과다한 질병^4의영향을 받습니다. 이 작품에서, 우리는 토마토의 랄스토니아 감염의 유전자 분석을 수행하는 쉬운 방법을 개발했다. 이 방법은 Agrobacterium 뿌리 줄기-중재 된 토마토 뿌리의 매개 형질에 기초하여, 선택 마커^5로DsRed 형광을 사용하여, 그 결과 식물의 랄스토니아 토양 흠뻑 접종, 관심의 구성을 표현하는 변형 뿌리를 포함. 근형 형질분석법의 다양성은 RNAi에 의해 매개된 유전자 과발현 또는 유전자 침묵을 능력을 발휘할 수 있게 한다.

이 방법의 잠재적 제한은 변형되지 않은 뿌리의 잔류 성장에 있습니다. 이것은 플라스미드가 사용된 경우에 특히 중요합니다 형질전환된 뿌리의 선택을 허용하는 리포터 유전자가 결여됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 건강한 항생제 내성 형질전환 뿌리의 성장을 허용하면서 비 형질전환 뿌리의 성장을 억제하는 항생제 선택에 기초한 대체 방법을 개발했습니다. A. 뿌리 줄기 유전자는 싹의 변형을 유발하지 않기 때문에 항생제에 취약하므로 항생제 함유 배지와 분리되어 보관해야합니다.

랄스토아에 대한 식물 저항이 잘 이해되지 않지만, 여러 보고서는 세균 윌트^{6,7,7,8,,9에}대한 향상된 저항에 세포벽 변경을 연관시켰습니다. 이러한 세포벽 변경이 혈관 발달에 영향을 미친다는 것이 제안되었으며, 이는 식물¹⁰내부의 랄스토니아 의 생활 방식에 필수적인 측면입니다. 애기장대에서 셀룰로오스 synthases CESA4, CESA7 및 CESA8을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 이차 세포벽 무결성을 손상시키는 것으로 나타났으며, 이는 ABA^신호8에연결된 것으로 보이는 랄스토니아에대한 향상된 저항성을 유발한다. 따라서, 우리의 방법에 대한 개념의 증거로, 우리는 SlCESA6의 RNAi 매개 유전자 침묵(Solyc02g072240),이차 세포 벽 셀룰로오스 synthase, 및 AtCESA8의 직교(At4g18780)를수행했다. 랄스토니아와 후속 토양 흠뻑 접종은 SlCESA6 침묵 세균성 시류 증상에 대한 저항을 강화 것으로 나타났다, 랄스토니아에 세포 벽 매개 저항가능성이 토마토에 보존 제안, 토마토 뿌리에서 세균 윌트 저항의 유전자 분석을 수행하는 우리의 방법을 검증. 여기에서는 이 방법을 자세히 설명하여 비교적 짧은 시간 및 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 세균성 질병을 이해하는 유전 적 접근법을 가능하게합니다.

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프로토콜

참고 :이 방법의 중요한 부분은 시험관에서 식물 재료를 처리하는 것을 포함, 따라서 DsRed 형광의 시각화를 포함하여 이러한 모든 절차 동안 멸균 조건을 유지하는 것이 중요하다. 모든 변형 과정에서 토마토 모종은 25-28 °C 및 16 h /8 h /8 빛 / 어두운 (130 μmol 광자 m^-2s^-1 빛)에서 자랍니다. 플레이트는 가스 교환 및 증발을 용이하게하기 위해 마이크로 포어 테이프로 밀봉됩니다.

1. 토마토 식물과 아그로박테리움 뿌리줄기의 준비

1. 멸균 토마토 씨앗(Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, 토마토 유전학 자원 센터, TGRC) 5 % (v / v) 나트륨 하이포아 염소산염을 5 분 동안 씻어 증류수로 4-5 회 씻어 내고 세균을 촉진하기 위해 밤새 멸균 수에서 천천히 흔들리는 씨앗을 유지하십시오.
2. 토마토 씨앗을 자당없이 반 강도무라시게와 스쿠그 (1/2 MS) 배지로 옮긴다 (2.21 g/L MS, 8% w/v agar). 씨앗을 3일 동안 25-28°C에서 어둠 속에서 유지합니다(그림1A).
   참고 : 각 구문에는 일반적으로 약 40 개의 씨앗이 필요합니다.
3. 오토 클레이브 8.5 cm² 정사각형 필터 용지. 정사각형 필터 용지를 1/2 MS 배지가 들어있는 9cm² 사각형 페트리 접시 안에 놓고 (한천 위에 종이를 놓습니다) 각 접시에 6 개의 발아 된 토마토 씨앗을 놓습니다(그림 1B). 마이크로 포어 테이프로 접시를 밀봉하고 3-4 일 동안 25-28 °C에서 발아 된 씨앗을 배양하십시오.
4. 아그로박테리움 뿌리줄기 유전자 MSU440을 식물 변형 2일 전 28°C에서 고체 LB 배지(적절한 항생제)에서 성장시다.
   참고: A. 뿌리 줄기는 후안 안토니오 로페즈 라에즈 박사, EEZ-CSIC, 그라나다, 스페인에 의해 제공됩니다. 본 문서에 설명된 실험에서, A. pK7GWIWG2_II-RedRoot를 함유하는 근경유전자::CESA6 또는 빈 벡터를 대조군으로 사용하였다. pK7GWIWG2_II-RedRoot는 애기장대 유비퀴틴 프로모터(pAtUBQ10)에 의해pAtUBQ10구동되는 리포터 유전자 인 DsRed를함유하고 있으며, 스펙토마이신(50 μg/mL)에 대한 내성을 부여한다. ⁵전에 보고된 바와 같이 유전자 과발현을 위해 다른 벡터를 사용할 수 있다. 이 작품에서, SlCESA6 침묵에 대한 특이적 단편의 증폭은 토마토로부터 분리된 RNA를 이용하여 역전사(RT) PCR에 의해 수득되었고(S.lycopersicum cv. Moneymaker) 및 p-ENTR/D-TOPO 벡터로 결찰하였다(표1). 이어서, SlCESA6-RNAi 단편을 pK7GWIWG2_II-RedRoot 이진 벡터로 복제하였다.

2. 식물 변환 및 선택

1. 멸균 메스를 사용하여 토마토 모종의 파문과 하부의 바닥을 잘라냅니다(그림 1C,D).
2. 수확 A. LB 배지의 표면으로부터 바이오매스를 플라스틱 팁 또는 메스 블레이드를 사용하여 세균 바이오매스에 잘라낸 토마토 묘목을 조심스럽게 찍어 낸다(도1E).
3. A. 뿌리 줄기로접종 한 후, 높은 습도를 유지하고 생존과 새로운 뿌리 개발을 용이하게하기 위해 2cm x 4cm 반원형 필터 용지(그림 1F)로토마토 모종을 덮습니다.
4. 변형 된 토마토 묘목을 6-7 일 동안 보관하십시오. 그런 다음 멸균 된 메스를 사용하여 새로운 새로운 털이 많은 뿌리를 자르고(그림 1G,H; 이 단계에서 뿌리는 아직 변형되지 않음) 모종에서 새로운 털이 많은 뿌리를 생성 할 수 있습니다.
5. 2세대 의 털이 많은 뿌리가 나타나면(그림 1I),모종 위에 있는 여과지를 제거하고, 다시 마이크로포공 테이프로 접시를 밀봉한다.
   참고: 이 시점에서 변환 벡터에 DsRed 형광 마커가 있으면 새 루트의 변환 효율성을 시각화할 수 있습니다.
6. DsRed 형광을 시각화하려면 생체 내 이미징 에 있는 식물을 위한 입체 현미경 또는 다른 장비를 사용하십시오(그림 1J). 양성 (적색 형광) 형질 전환 뿌리를 표시하고 멸균 메스를 사용하여 부정적인 비 형질 (적색 형광 없음)을 제거합니다.
7. 1/2 MS 배지를 포함하는 새로운 플레이트에 적색 형광을 나타내는 모종을 옮기고, 변형된 뿌리의 발달을 주 뿌리로 용이하게한다(도 1K). 같은 판에 적색 형광이 나타나지 않는 묘목을 보관하여 후기 시점에서 형광뿌리(도1L)의출현을 확인한다.
8. 항생제 선택에 기초한 대체 방법
   1. 2.5단계에 대한 대안으로, 적절한 항생제로 1/2 MS 배지를 함유하는 반충전 9 cm² 정사각형 플레이트를 준비한다. 배지 없이 빈 공간을 생성하기 위해 준비 과정 동안 플레이트를 약 5° 기울게하고(그림 2A),항생제와의 접촉을 피하여 싹이 자라도록 한다.
   2. 2.6단계의 대안으로, 제1 비형형 털뿌리를 절단한 후(단계 2.4), 뿌리 없이 모종을 적절한 크기의 여과지를 이용하여 반충전된 판으로 옮긴다(도2B).
      참고 : 긍정적 인 대조군으로서 동일한 항생제 내성과 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드로 여러 모종을 변형시키는 것이 좋습니다 (이 프로토콜에서 pK7GWIWG2_II-RedRoot; 카나마이신 50 μg / mL).
   3. 단계 2.7에 대한 대안, 모종은 새로운 털이 뿌리를 개발하고 이러한 뿌리는 항생제 선택을 피할 수 있기 때문에, 필터 샌드위치 논문의 표면과 직접 접촉하지 않는 그 뿌리를 잘라 보자.
      참고 : 항생제 효과로 인해 뿌리 발달은 항생제가없는 판보다 느릴 수 있습니다. 새로운 변형 된 털이 뿌리는 반 채워진 접시에 뿌리없이 모종을 옮긴 후 14-18 일 이내에 나타납니다 (단계 2.8.2)(그림 2C-E).
9. 2cm x 4cm 반원형 필터 페이퍼로 모종을 덮고 접시를 밀봉하고 모종을 배양하여 새로운 털이 많은 뿌리를 개발하게하십시오.
   참고 : 항생제를 사용하여 A. 뿌리 줄기 유전자를 제거 할 필요가 없습니다. MS 배지 상의 필터 종이와 자당의 부족은 플레이트^5상에 있는 A. 뿌리줄기유전자의 확산을 억제한다.
10. 첫 번째 루트 선택 후 5~7일 후에 선택 프로세스를 반복하여 변환된 새 루트를 선택하고 변형되지 않은 루트를 제거합니다. 변형된 뿌리를 포함하는 모종을 1/2 MS 배지를 포함하는 새로운 판으로 옮김.

3. 접종 냄비로 옮기기

1. 뿌리의 표면이 세균 접종에 노출 될 예방 접종 냄비를 준비 : 물로 접종 냄비를 흡수, 여분의 물을 부어, 플라스틱 심기 트레이에 배치합니다. 핀셋을 사용하여 접종 냄비에 변형 뿌리와 선택한 묘목을 전송(그림 3A).
2. 비닐 랩 또는 투명 뚜껑으로 트레이를 덮고 25-28 °C 및 65 % 습도 (16 시간 / 8 h 빛 / 어두운 130 μmol 광자 m^-2s^-1 빛)에서 보관하여 높은 수준의 습도를 유지합니다 그림 3B). 5~6일 후에 뚜껑을 제거합니다.
   참고 : 변형 된 토마토 식물은 토양으로 옮김 후 2 ~ 3 주 동안 접종 할 준비가되어 있습니다(그림 3C). 토양에 성장 하는 동안, 토마토 식물 변환 되지 않은 새로운 뿌리를 생산할 수 있습니다. 이 현상의 정도를 결정하기 위해, 붉은 형광은 3 주 된 변형 된 토마토 식물의 뿌리에서 시각화되었습니다. 대부분의 뿌리 (80%-100%) 적색 형광이 나타났으며, 이는 실제로 변형되었음을나타낸다(그림 3D,E).

4. 토양 흠뻑 예방 접종

1. 28°C에서 28°C에서 궤도 셰이커(200 rpm)에서 피액배지(표 2^11)에서 R. 솔란사룸(이 프로토콜에서 균주 GMI1000)을 성장시다.
2. 600 nm(OD 600)에서 세균 배양물의₆₀₀광학 밀도를 측정하여 세균 수를 결정한다. 0.1의 OD_600에 물로 세균 배양을 희석 (여기서 사용되는 조건에서, 이것은 약에 해당 10⁸ 콜로니 형성 단위 [CFU]/mL).
3. 접종 트레이 (29cm x 20cm)에 변형 된 토마토 식물을 포함하는 16-20 접종 냄비를 놓습니다. 그림 4A).
4. 접종 냄비를 포함하는 트레이에 세균 접종 (OD₆₀₀ 의 0.1)의 300 mL (식물 당 ~ 15 mL)를 부어. 20분 동안 접종에 담그게한다(그림 4B).
5. 화분 토양의 층으로 새로운 트레이를 준비합니다. 접종된 냄비를 새트레이(그림 4C)에옮기고 트레이를 75% 습도, 26-28°C, 12시간 빛 및 12시간 암흑의 포토기간(130 μmol 광자^{m-2s-1광)으로} 성장 챔버에 놓습니다.

5. 감염 매개 변수 및 통계 분석의 결정

1. 앞서 설명한 바와 같이 질병 증상을 점수^{매기기(12,,13)}0(증상 없음)에서 4(완전한 wilting)(도4D-H)까지의척도를 사용하여, 2주 동안 랄스토니아 접종 후 매일.
   참고: 질병 지수 데이터는 시간이 지남에 따라 동일한 실험 단위(각 식물)에서 수집됩니다.

6. 유전자 발현 분석

참고: 표적 유전자의 이식유전자 또는 침묵의 발현은 RT-PCR 또는 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)에 의해 결정될 수 있다.

1. 샘플을 수집하고 형질전환된 루트 시스템의 대표적인 부분에서 RNA를 추출(표적 유전자에 미치는 영향을 평가하기 위해) 및 잎(내부 대조군으로서).
2. 총 DNase 처리 RNA의 1 μg를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
3. qRT-PCR에 의한 표적 유전자의 유전자 발현을 분석한다. ^{2-ΔΔCT 방법(14)을}사용하여 상대 전사 수준을 계산하고, SlEFα-1을 하우스키핑^{유전자(15)로}사용한다.
   참고: 프라이머 시퀀스는 표 1에나열되어 있습니다.

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결과

도 5는 SlCESA6(Solyc02g07240)를 대상으로 RNAi 시공체로 SlCESA6 변형된 뿌리를Solyc02g072240빈 벡터(EV)로 변형시킨 뿌리를 가진 토마토 식물의 질병 증상의 발달을 나타낸다. 질병 지수데이터(도5A)는0에서 4까지의 임의의 척도에 따라 시간에 따라 동일한 실험 단위(각 식물)로부터 수집되며, 가우시안 분포를 따?...

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토론

랄스토니아 솔라나세아룸은 농업에 중요한 위협이 됩니다. 그러나, 농업 중요성의 자연 호스트와의 상호 작용은 여전히 제대로 다른 세균성 병원 체에 비해 이해, 특히 작물 식물 종에. 대부분의 경우, 유전 분석은 호스트 식물을 유전적으로 수정하는 데 필요한 시간과 비용에 의해 방해됩니다. 이러한 문제를 해결하고 토마토에 있는 R. solanacearum 감염의 유전 분석을 용이하게 하기 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm square Petri-dishes
Agar powder	Sigma-Aldrich
Bacto peptone	BD (Becton and Dickinson)
Casamino acids	Sigma-Aldrich
Filter paper
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985	Berthold Technologies
Jiffy pots	Jiffy Products International A.S.
Micropore tape	3M
Murashige and Skoog medium (M519)	Phytotechlab
Pindstrup substrate	Pindstrup Mosebrug A/S
Scalpel and blade
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich
Sterile clean bench
Tweezers
Wahtman paper	Wahtman International Ltd. Maldstone
Yeast extract	OXOID