在Vitro重建空间细胞接触模式与孤立的Caenorhabditis elegans胚胎冲击器和粘性聚苯乙烯珠

摘要

多细胞系统的组织复杂性混淆了细胞外线索与单个细胞行为之间的因果关系的识别。在这里，我们提出了一种方法，研究接触依赖线索和分裂轴之间的直接联系使用C.elegans胚胎胚芽和粘合聚苯乙烯珠子。

摘要

在多细胞系统中，单个细胞被来自邻近细胞和环境的各种物理和化学线索所包围。这种组织的复杂性混淆了外在线索和细胞动力学之间的因果关系的识别。合成重组的多细胞系统克服了这个问题，使研究人员能够测试特定的线索，同时消除其他线索。在这里，我们提出了一种方法，以重组细胞接触模式与孤立的Caenorhabditis elegans爆炸和粘胶聚苯乙烯珠。这些程序包括蛋壳去除、通过破坏细胞粘附性进行胚分裂、制备粘胶聚苯乙烯珠子以及重组细胞-细胞或细胞珠接触。最后，本文介绍了该方法在胚胎发育中研究细胞分裂轴的定位，有助于调节发育胚胎中的空间细胞模式和细胞命运规范。这种健壮、可重复和多功能的体外方法有助于研究空间细胞接触模式与细胞反应之间的直接关系。

引言

在多细胞发育过程中，单个细胞的细胞行为（例如，分轴）由各种化学和物理线索指定。理解单个细胞如何解释这些信息，以及它们如何将多细胞组装作为一个紧急属性进行调节，是形态发生研究的最终目标之一。模型有机体C.elegans对细胞级形态形成调节的理解有显著贡献，如细胞极^性1、细胞分裂^模式1、细胞命运^决定2、组织尺度调节，如神经元接^线3和器官^{发生4、5。}虽然有各种各样的遗传工具可用，组织工程方法是有限的。

在C.elegans研究中最成功的组织工程方法是经典的胚乳^分离6;由于C.elegans胚胎被蛋壳和渗透^屏障7包围，其去除是这种方法的主要程序之一。虽然这种爆破器隔离方法能够以简化的方式重组细胞-细胞接触，但它不允许消除不需要的线索;细胞接触仍然构成机械（例如，附着力）和化学线索，从而限制了我们完全分析线索和细胞行为之间的因果关系的能力。

本文介绍的方法使用Carboxylate改性聚苯乙烯珠子，该珠子可以共价地与包括蛋白质在内的任何胺反应分子结合为配体。特别是，我们使用一种抗胺反应形式的罗达明红-X作为配体，使珠子既可目视跟踪，又粘附在细胞上。配体分子的珠表面和原胺组的甲苯基组由水溶性甲酰胺1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）卡博迪米（EDAC）8、9结合。获得粘合珠子允许机械提示对细胞^动力学10的影响。我们已经使用这种技术来识别细胞分裂^方向10所需的机械线索。

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研究方案

1. 胶粘剂聚苯乙烯珠子的制备

注:此协议不需要无菌技术。

1. 在1.5 mL微离心管中称量10mg的Carboxylate改性聚苯乙烯珠子。
2. 要清洗珠子，在管中加入1 mL的2-（N-变形）甲酸（MES）缓冲液。由于MES缓冲液不含磷酸盐和醋酸盐，可降低卡博迪米德的活性，适合用于蛋白质耦合反应。涡旋管混合珠子。
3. 通过台式离心机在 2，000 x g下旋转管子 60 s。
4. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
5. 按照步骤 1.2-1.4 再次用 1 mL 的 MES 缓冲液清洗珠子。
6. 将含有10毫克EDAC的MES缓冲液加入管中，以激活表面的Carboxyl基组。涡旋管混合珠子。
7. 在室温下旋转和孵育管15分钟。
8. 在 2，000 x g下旋转珠子 60 s。
9. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
10. 要清洗珠子，在管中加入1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。涡旋管混合珠子。
11. 在 2，000 x g下旋转管 60 s。
12. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
13. 按照步骤 1.10-1.12 再次用 1 mL 的 PBS 清洗珠子。
14. 使用的罗达明的最终浓度将取决于被成像的菌株。从 0.65 mM 罗达明红X-X库存溶液中制备 1 mL 的 1、10、100 和 1000 倍稀释系列罗达明红-X。
15. 将20μL的珠子移入每个连续稀释管中。
16. 在室温下旋转和孵育管5分钟。
17. 通过重复步骤 1.10-1.12，用 1 mL 的 PBS 清洗珠子两次。
18. 将 1 mL 的 PBS 添加到管中，并将其储存在 4°C 下长达 6 周。在用于实时成像的显微镜下检查珠子的荧光强度。罗达明红-X琥珀基酯的适当浓度取决于成像条件（图1）。
    注:没有罗达明红X治疗的珠子不粘附在细胞上。罗丹胺红-X用作荧光标记和粘合剂分子。带正电荷的罗达明红-X和带负电荷的等离子膜之间的静电相互作用是粘附的一个假定原因。

2. 口腔移液器的组装

1. 切割宽（6.35毫米内径）和窄（3.175毫米内径）泰贡管，分别约25厘米和40厘米长（图2）。
2. 用聚四氟乙烯 （PTFE） 过滤器（0.2 μm 孔径）连接 Tygon 管（图 2）。
3. 拆解市售的吸气管，并将其毛细管支架和喉舌分别连接到窄管和宽的Tygon管的末端（图2）。
   注:PTFE过滤器用于防止通过口腔移液器吸入次氯酸盐溶液的烟雾。

3. 胚胎胚芽的分离

注意:戴上手套和实验室外套，避免切割和接触漂白溶液。

1. 用右手和左手握住微毛细管的每一端（容量;10 μL）。
2. 将微毛细管拉向两端以施加张力，并将毛细管的中心位于燃烧器上，使两个手拉毛细血管（图3A）。
3. 在解剖显微镜下用钳子修剪手拉毛细血管的尖端，并将拉毛细管连接到口腔移液装置中（图2）。准备两种类型的移液器。移液器的尖端开口尺寸应约为胚胎移植和蛋壳切除的C.elegans胚胎（30μm）的短轴长度的2倍和1倍，分别图3B-D。
4. 将蛋盐溶液45μL移液到多井滑井上（图4A;底部）。
5. 将5-10只成年C.elegans放入含有蛋盐溶液的井中。
6. 为了获得早期的C.elegans胚胎，通过将两根针插在C.elegans身体的左右，并相互滑动针头，将成人切成碎片（图4A;上部示意图）。
7. 将45μL的次氯酸盐溶液移液到含有蛋盐溶液的井旁的井上（图4B）。
8. 雪尔顿生长介质的移液器45 μL，在含有次氯酸盐溶液的井旁的随后三口井上（图4B）。
9. 将1细胞阶段和早期2细胞阶段胚胎通过口移移进入次氯酸盐溶液中，用手绘毛细管进行胚胎移植（图4B）。
10. 等待 40-55 s。
11. 通过将次氯酸盐溶液中的胚胎从次氯酸盐溶液移植到谢尔顿的生长培养基，用手绘毛细管移液进行胚胎移植，洗净胚胎（图4B）。
12. 再次清洗胚胎，通过将胚胎移植到谢尔顿生长培养基的新井中，用手绘毛细管移液进行胚胎移植（图4B）。
13. 通过用手绘毛细管进行口移，将洗涤的胚胎移植到谢尔顿生长培养基的新井中，用于胚胎移植。使用手绘毛细管去除蛋壳，仔细重复移液（图4C;中间示意图）。如果成功取出蛋壳，胚胎细胞将变得更球形（图4C;右图）。
14. 通过用手绘毛细管轻轻连续移液分离2细胞阶段胚胎胚泡（图4D）。

4. 用爆波米尔和珠子重新构成接触模式

注:在成像显微镜下工作，以避免细胞与珠子分离，并便于及时采集图像。

1. 要使用倒置显微镜进行观察，请准备如图5所示的成像室。
   1. 将盖玻片放在盖玻座上 （图 5A）。
   2. 用胶带盖住盖玻片的边缘以稳定它。带胶带的一侧是"背面"（图5A，B）。
   3. 将盖玻片支架翻转到"正面"侧，用疏水笔在盖玻上画一个圆圈（图5C）。
      注:任何玻璃底盘也有效，前提是胚胎可由口腔移液器操作。
2. 在疏水标记绘制的圆内添加谢尔顿的生长介质（图5D）。
3. 将隔离的爆破仪转移到成像室。
4. 使用手绘毛细管分配少量化学功能化珠子进行胚胎移植。
5. 通过吹入手绘毛细管来控制聚苯乙烯珠子的位置，直到珠子附着在隔离的胚泡上。
6. 安装盖玻片以避免介质蒸发 （图 5E）。执行实时成像。

5. 制备重要试剂

1. 蛋盐溶液（10 mL）:将235 μL的5M纳C和240 μL的2M KCl与9525 μL的dH₂O结合。
2. 次氯酸盐溶液（10 mL）:将7.5 mL Clorox（含约7.5%次氯酸钠）与2.5 mL的10 N NaOH（次氯酸钠的最终浓度约为5.625%）结合。
   注:虽然许多已发表的方法都使用齐齐酸酶来消化蛋壳，但我们采用了一种使用次氯酸盐^溶液11的方法。通过避免成批变化的齐平酶活动，我们相信这种方法是更具可重复性和成本效益的方法。
3. 0.81 mM Inulin 溶液 （40 mL）
   1. 将 0.2 克硫林添加到 40 mL 的 dH₂O。
   2. 高压灭菌溶解。
      注:在4°C下保持1个月。
4. 0.5 M MES 缓冲器 （500 mL）
   1. 将 48.81 克 MES 溶解在 400 mL 蒸馏水中（dH₂O）。
   2. 将 pH 调整到 6.0。
   3. 使用 dH₂O，使总体积达到 500 mL。
5. PBS 解决方案 （1 L）
   1. 要制造 10 倍 PBS 溶液，将 1 包 PBS 预混合粉末溶解在 1 L 的 dH₂O 中。
   2. 将 100 mL 的 10 倍 PBS 解决方案与 900 mL 的 dH₂O 相结合。
6. 5% 聚苯丙酮 （PVP） 溶液 （4 mL）
   1. 在无菌条件下，在4 mL的果蝇施耐德介质中溶解0.2克PVP。
      注:始终打开施耐德在组织培养 （TC） 罩中的中等库存。在4°C下保持1个月。
7. 0.65 mM 罗达明红X库存溶液 （2 mL）
   1. 重量 1 毫克罗达明红-X。
   2. 加入2 mL二甲基亚硫酸盐（DMSO）溶解。
   3. 在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
8. 谢尔顿的生长介质 （SGM） （10.25 mL）
   1. 在无菌条件下，将8 mL的果蝇施耐德中度、1 mL的PVP溶液、1mL的Inul溶液、1mL的巴司中鹰（BME）维生素、50μL的青霉素-链霉素和100μL的脂蛋白浓缩物混合在一起。
   2. SGM 的等分 325 μL 放入 1.5 mL 微管中。
      注:在4°C下保持约1个月。
   3. 在胚膜分离当天，向SGM中加入175 μL的胎儿牛血清（FBS）（总体积为500μL）。
      注:将 FBS 储存在 -20°C，并在使用前解冻。FBS 不需要被热杀死。

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结果

对于珠子制备，我们确定了表达GFP-肌苷II和mCherry-组蛋白的转基因菌株的红-X琥珀酯的最佳量（图1A-D）。我们使用 mCherry 标记组蛋白作为细胞周期进展的标记。由于罗达明红X-X和mCherry将由561nm激光照明，因此罗达明红X-X信号的最佳强度与组蛋白相当，可以同时成像细胞和珠子。例如，使用 0.005 μg/mL Rhodamine 红-X 琥珀酯处理的珠子的荧光信号太弱，无法可视化珠（...

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讨论

重建简化的细胞接触模式将使研究人员测试特定细胞接触模式在形态形成不同方面的作用。我们用这种技术来表明细胞分裂轴是由粘接珠体接触^控制的。由于分轴规范对多细胞发育至关重要，有助于形成形态^生成14、干细胞^{分裂15、16}和组织^{平衡15、16，}这种方法应该能够阐?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride	Alfa Aesar	AAA1080703	For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	For the bead preparation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals)	Fisher BioReagents	BP300-100	For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder	Fisher BioReagents	BP665-1	For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer	Molecular Probes	R6160	For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.	Intelligent Imaging Innovation	N.A.	For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.