In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Résumé

Les complexités tissulaires des systèmes multicellulaires confondent l'identification de la relation causale entre les indices extracellulaires et les comportements cellulaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour étudier le lien direct entre les indices contact-dépendants et les axes de division utilisant des blastomeres d'embryon de C. elegans et des perles adhésives de polystyrène.

Résumé

Dans les systèmes multicellulaires, les cellules individuelles sont entourées par les différents indices physiques et chimiques provenant des cellules voisines et de l'environnement. Cette complexité tissulaire confond l'identification du lien de causalité entre les indices extrinsèques et la dynamique cellulaire. Un système multicellulaire reconstitué synthétiquement surmonte ce problème en permettant aux chercheurs de tester un signal spécifique tout en éliminant les autres. Ici, nous présentons une méthode pour reconstituer des modèles de contact de cellules avec le blastomere isolé de Caenorhabditis elegans et les perles adhésives de polystyrène. Les procédures impliquent l'enlèvement de coquille d'œuf, l'isolement blastomere en perturbant l'adhérence de cellule-cellule, la préparation des perles adhésives de polystyrène, et la reconstitution du contact de cellule-cellule ou de cellule-perle. Enfin, nous présentons l'application de cette méthode pour étudier l'orientation des axes de division cellulaire qui contribue à la régulation du modelage cellulaire spatial et de la spécification du destin cellulaire dans le développement des embryons. Cette méthode in vitro robuste, reproductible et polyvalente permet d'étudier les relations directes entre les modèles de contact cellulaire spatial et les réponses cellulaires.

Introduction

Pendant le développement multicellulaire, les comportements cellulaires (par exemple, l'axe de division) des cellules individuelles sont spécifiés par divers indices chimiques et physiques. Comprendre comment chaque cellule interprète cette information, et comment ils régulent l'assemblage multicellulaire comme une propriété émergente est l'un des objectifs ultimes des études de morphogénèse. L'organisme modèle C. elegans a contribué de manière significative à la compréhension de la régulation au niveau cellulaire de la morphogénèse comme la polarité cellulaire¹, la division cellulaire modelant¹, la décision du destin cellulaire², et les règlements à l'échelle des tissus tels que le câblage neuronal³ et l'organogenèse^4,5. Bien qu'il existe divers outils génétiques disponibles, les méthodes d'ingénierie tissulaire sont limitées.

La méthode d'ingénierie tissulaire la plus réussie dans l'étude de C. elegans est l'isolement classique de blastomere⁶; comme l'embryon de C. elegans est entouré d'une coquille d'œuf et d'une barrière de perméabilité⁷, leur élimination est l'une des principales procédures de cette méthode. Bien que cette méthode d'isolement blastomere permet la reconstitution du contact cellule-cellule d'une manière simplifiée, elle ne permet pas l'élimination des indices indésirables; le contact cellulaire pose toujours à la fois des indices mécaniques (p. ex. adhérence) et chimiques, limitant ainsi notre capacité d'analyser pleinement la relation causale entre le signal et le comportement cellulaire.

La méthode présentée dans cet article utilise des perles de polystyrène modifiés au carboxylate qui peuvent se lier de façon covalente à toutes les molécules réactives à l'amine, y compris les protéines comme ligands. En particulier, nous avons utilisé une forme amine-réactive de Rhodamine Red-X comme un ligand pour faire des perles à la fois visuellement trackable et adhésif à la cellule. Les groupes de carboxyl de surface de perle et les groupes primaires d'amine de molécule de ligand sont couplés par le carbodiimide soluble dans l'eau 1-éthylique-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)^8,9. Les perles adhésives obtenues permettent les effets de la queue mécanique sur la dynamique cellulaire¹⁰. Nous avons utilisé cette technique pour identifier les indices mécaniques nécessaires à l'orientation de la division cellulaire¹⁰.

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Protocole

1. Préparation de perles de polystyrène adhésif

REMARQUE : Ce protocole ne nécessite pas de technique aseptique.

1. Peser 10 mg de perles de polystyrène modifiés de carboxylate dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
2. Pour laver les perles, ajouter 1 ml de tampon d'acide ethanesulfonic (MES) de 2 ml (N-(N-morpholino) dans le tube. Étant donné que le tampon MES ne contient pas de phosphate et d'acétate, ce qui peut réduire la réactivité du carbodiimide, il convient de l'utiliser dans la réaction de couplage de protéines. Vortex le tube pour mélanger les perles.
3. Faites tourner le tube pour 60 s à 2 000 x g via une centrifugeuse sur le banc.
4. Jeter le supernatant en pipetting soigneusement le tampon.
5. Laver les perles à nouveau avec 1 ml de tampon MES en suivant les étapes 1.2-1.4.
6. Ajouter 1 mL de tampon MES contenant 10 mg d'EDAC dans le tube pour activer les groupes de carboxyl de surface. Vortex le tube pour mélanger les perles.
7. Faire pivoter et incuber le tube pendant 15 min à température ambiante.
8. Faites tourner les perles pour 60 s à 2 000 x g.
9. Jeter le supernatant en pipetting soigneusement le tampon.
10. Pour laver les perles, ajouter 1 ml de phosphate salin tamponné (PBS) dans le tube. Vortex le tube pour mélanger les perles.
11. Faites tourner le tube pendant 60 s à 2 000 x g.
12. Jeter le supernatant en pipetting soigneusement le tampon.
13. Laver les perles à nouveau avec 1 ml de PBS en suivant les étapes 1.10-1.12.
14. La concentration finale de Rhodamine utilisée dépendra de l'image de la souche. Préparer 1 mL de 1, 10, 100 et 1000 fois la série de dilution de Rhodamine Red-X à partir de la solution de stock Rhodamine Red-X de 0,65 mM.
15. Pipette 20 l de perles dans chaque tube de dilution série.
16. Faire pivoter et incuber le tube pendant 5 minutes à température ambiante.
17. Laver les perles deux fois avec 1 ml de PBS en répétant les étapes 1.10-1.12.
18. Ajouter 1 ml de PBS dans le tube et le conserver à 4 oC pendant 6 semaines. Vérifiez l'intensité de fluorescence des perles sous un microscope utilisé pour l'imagerie vivante. La concentration appropriée de l'ester de succinimidyl rouge-X de Rhodamine dépend des conditions d'imagerie (figure 1).
    REMARQUE : Les perles sans traitement Rhodamine Red-X n'adhèrent pas à la cellule. Rhodamine Red-X sert de marqueur de fluorescence ainsi que de molécule adhésive. L'interaction électro statique entre rhodamine Red-X chargée positivement et membrane plasmatique chargée négativement est une cause putative d'adhérence.

2. Assemblage de la pipette buccale

1. Couper les tubes Tygon larges (6,35 mm de diamètre intérieur) et étroits (3,175 mm) tygons à environ 25 cm et 40 cm de longueur, respectivement (figure 2).
2. Connectez les tubes Tygon avec un filtre en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (taille de 0,2 m pore) (Figure 2).
3. Démonter un tube d'aspirateur disponible dans le commerce et attacher son support capillaire et son embout buccal à l'extrémité des tubes Tygon étroits et larges, respectivement (figure 2).
   REMARQUE : Le filtre PTFE a été utilisé pour empêcher l'inhalation de fumées de solution d'hypochlorite par la pipette buccale.

3. Isolement de l'embryon blastomere

REMARQUE : Portez des gants et une blouse de laboratoire pour éviter de couper et de communiquer avec la solution de blanchiment.

1. Tenir chaque extrémité d'un microcapillaire (capacité; 10 l) avec la main droite et gauche.
2. Tirez le microcapillary vers les deux extrémités pour appliquer la tension et amener le centre du capillaire au-dessus d'un brûleur pour faire deux capillaires tirés à la main (figure 3A).
3. Couper les extrémités des capillaires tirés à la main avec des forceps sous le microscope disséquant et attacher le capillaire tiré dans un appareil de tuyauterie de bouche (Figure 2). Préparer deux types de pipettes. Les tailles d'ouverture de pointe pour les pipettes doivent être approximativement 2x et 1x la longueur courte d'axe des embryons de C. elegans (30 m) pour le transfert d'embryon et l'enlèvement de coquille d'oeuf, respectivement Figure 3B-D).
4. Pipette 45 'L de solution de sel d'oeuf sur un puits d'une glissière multiwell (Figure 4A; bas).
5. Placer 5-10 élegans C. adultes sur un puits contenant une solution de sel d'œuf.
6. Pour obtenir les premiers embryons de C. elegans, couper les adultes en morceaux en plaçant deux aiguilles à droite et à gauche du corps de C. elegans et en glissant les aiguilles les unes devant les autres(figure 4A; schémas supérieurs).
7. Pipette 45 l de solution d'hypochlorite sur un puits à côté du puits contenant une solution de sel d'œuf (figure 4B).
8. Pipette 45 l du milieu de croissance de Shelton sur les trois puits suivants à côté du puits contenant de l'hypochlorite (figure 4B).
9. Transférer les embryons à stade 1 cellulaire et à 2 cellules précoces dans la solution d'hypochlorite par tuyauterie buccale avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons (figure 4B).
10. Attendez 40 à 55 s.
11. Laver les embryons en transférant les embryons de la solution d'hypochlorite dans le milieu de croissance de Shelton par tuyauterie buccale avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons (figure 4B).
12. Laver les embryons à nouveau en transférant les embryons dans un nouveau puits du milieu de croissance de Shelton par tuyauterie buccale avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons (Figure 4B).
13. Transférer les embryons lavés dans un nouveau puits du milieu de croissance de Shelton par tuyauterie buccale avec le capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons. À l'aide du capillaire dessiné à la main pour l'enlèvement des coquilles d'œufs, répétez soigneusement le tuyauterie(figure 4C; schémas intermédiaires). Si la coquille d'œuf est enlevée avec succès, les cellules embryonnaires deviendront plus sphériques(figure 4C; droite).
14. Séparez les blastomères embryonnaires à deux cellules en faisant une pipetting en douceur et en continu avec le capillaire dessiné à la main pour l'enlèvement de la coquille d'œuf (Figure 4D).

4. Reconstitution des modèles de contact avec le blastomere et la perle

REMARQUE : Travaillez sous le microscope d'imagerie pour éviter la dissociation d'une cellule d'une perle et pour faciliter l'acquisition d'image en temps opportun.

1. Pour observer à l'aide d'un microscope inversé, préparez une chambre d'imagerie comme dans la figure 5.
   1. Placez une glissière de couverture sur un support de couverture (Figure 5A).
   2. Tapez les bords de la glissière de couverture pour le stabiliser. Le côté avec du ruban adhésif est le côté «arrière» (Figure 5A,B).
   3. Retournez le support de la couverture sur le côté ' avant' et dessinez un cercle sur le bordereau avec un stylo hydrophobe (Figure 5C).
      REMARQUE : Tout plat à fond de verre fonctionne également, à condition que les embryons soient manipulés par la pipette de bouche.
2. Ajouter le milieu de croissance de Shelton dans le cercle dessiné par le marqueur hydrophobe (figure 5D).
3. Transférer le blastomere isolé dans la chambre d'imagerie.
4. Distribuez un petit volume des perles chimiquement fonctionnalisées à l'aide du capillaire dessiné à la main pour le transfert d'embryons.
5. Contrôlez la position des perles de polystyrène en soufflant dans le capillaire dessiné à la main jusqu'à ce que la perle se fixe au blastomere isolé.
6. Monter un bordereau pour éviter l'évaporation du milieu (Figure 5E). Effectuez l'imagerie en direct.

5. Préparation de réactifs importants

1. Solution de sel d'œuf (10 ml) : Combiner 235 oL de 5 M NaCl et 240 oL de 2 M KCl avec 9525 oL de dH₂O.
2. Solution d'hypochlorite (10 ml) : Combiner 7,5 ml de Clorox (contenant environ 7,5 % d'hypochlorite de sodium) avec 2,5 ml de 10 NaOH (la concentration finale d'hypochlorite de sodium est d'environ 5,625 %).
   REMARQUE: Bien que de nombreuses méthodes publiées ont utilisé la chitinase pour digérer les coquilles d'œufs chitinous, nous avons adopté une méthode utilisant la solution d'hypochlorite¹¹. En évitant les variations de lots à lots des activités chitinase, nous croyons que cette méthode est une approche plus reproductible et rentable.
3. 0,81 mM Solution d'inuline (40 ml)
   1. Ajouter 0,2 g d'inuline à 40 ml de dH₂O.
   2. Autoclave à dissoudre.
      REMARQUE : Se conserve pendant 1 mois à 4 oC.
4. 0,5 M DEM tampon (500 ml)
   1. Dissoudre 48,81 g de MES dans 400 ml d'eau distillée (dH₂O).
   2. Ajuster le pH à 6,0.
   3. Porter le volume total à 500 ml avec dH₂O.
5. PBS Solution (1 L)
   1. Pour faire 10 fois la solution PBS, dissoudre 1 paquet de poudre de prémélange PBS en 1 L de dH₂O.
   2. Combinez 100 mL de solution PBS 10 fois plus grande que 900 mL de dH₂O.
6. 5% Polyvinylpyrrolidone (PVP) Solution (4 mL)
   1. Dans des conditions stériles, dissoudre 0,2 g de PVP dans 4 ml de Drosophila Schneider's Medium.
      REMARQUE : Ouvrez toujours le stock moyen de Schneider dans la culture tissulaire (TC) hotte. Conserver pendant 1 mois à 4 oC.
7. 0,65 mM Rhodamine Red-X stock solution (2 mL)
   1. Peser 1 mg de Rhodamine Red-X.
   2. Ajouter 2 ml de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour dissoudre.
   3. Aliquot et magasin à -20 oC.
8. Shelton's Growth Medium (SGM) (10,25 ml)
   1. Dans des conditions stériles, combiner 8 mL de Drosophila Schneider's Medium, 1 mL de solution PVP, 1 mL de solution inuline, 1 mL de vitamines Basal Medium Eagle (BME), 50 oL de pénicilline-streptomycine et 100 ll de concentré lipidique ensemble.
   2. Aliquot 325 l de SGM en microtubes de 1,5 mL.
      REMARQUE : Conserver environ 1 mois à 4 oC.
   3. Le jour de l'isolement blastomere, ajouter 175 L de sérum bovin fœtal (FBS) à la SGM (pour un volume total de 500 l).
      REMARQUE : Conservez le FBS à -20 oC et dégelez-le avant utilisation. FBS n'a pas besoin d'être tué par la chaleur.

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Résultats

Pour la préparation des perles, nous avons déterminé la quantité optimale de Rhodamine Red-X succinimidyl ester pour la souche transgénique exprimant GFP-myosin II et mCherry-histone (Figure 1A-D). Nous avons utilisé mCherry marqué histone comme un marqueur de la progression du cycle cellulaire. Parce que Rhodamine Red-X et mCherry seront illuminés par un laser de 561 nm, l'intensité optimale du signal Rhodamine Red-X est comparable à celle de l'histone pour permet...

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Discussion

La reconstitution des modèles simplifiés de contact cellulaire permettra aux chercheurs de tester les rôles de modèles de contact cellulaire spécifiques dans différents aspects de la morphogénèse. Nous avons utilisé cette technique pour montrer que l'axe de division cellulaire est contrôlé par le contact physique avec des perles adhésives¹⁰. Comme la spécification de l'axe de division est cruciale pour le développement multicellulaire en contribuant à la morphogénèse

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride	Alfa Aesar	AAA1080703	For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	For the bead preparation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals)	Fisher BioReagents	BP300-100	For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder	Fisher BioReagents	BP665-1	For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer	Molecular Probes	R6160	For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.	Intelligent Imaging Innovation	N.A.	For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.