In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen

Zusammenfassung

Gewebekomplexitäten multizellulärer Systeme verwirren die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrazellulären Hinweisen und individuellen zellulären Verhaltensweisen. Hier stellen wir eine Methode vor, um den direkten Zusammenhang zwischen kontaktabhängigen Cues und Divisionsachsen mit C. elegans embryo blastomeres und klebenden Polystyrolperlen zu untersuchen.

Zusammenfassung

In mehrzelligen Systemen sind einzelne Zellen von den verschiedenen physikalischen und chemischen Hinweisen umgeben, die aus benachbarten Zellen und der Umgebung stammen. Diese Gewebekomplexität verwirrt die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrinsischen Cues und zellulärer Dynamik. Ein synthetisch rekonstituiertes mehrzelliges System überwindet dieses Problem, indem es Forschern ermöglicht, auf einen bestimmten Hinweis zu testen und andere zu eliminieren. Hier stellen wir eine Methode zur Rekonstituierung von Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans blastomer und klebenden Polystyrolperlen vor. Die Verfahren umfassen die Entfernung von Eierschalen, blastomere Isolierung durch Unterbrechung der Zell-Zell-Adhäsion, Die Herstellung von klebenden Polystyrolperlen und die Rekonstitution von Zellzell- oder Zellperlenkontakt. Schließlich stellen wir die Anwendung dieser Methode vor, um die Ausrichtung zellulärer Teilungsachsen zu untersuchen, die zur Regulierung der räumlichen zellulären Musterung und Zellschicksalsspezifikation bei der Entwicklung von Embryonen beiträgt. Diese robuste, reproduzierbare und vielseitige In-vitro-Methode ermöglicht die Untersuchung direkter Zusammenhänge zwischen räumlichen Zellkontaktmustern und zellulären Reaktionen.

Einleitung

Während der multizellulären Entwicklung werden die zellulären Verhaltensweisen (z.B. Divisionsachse) einzelner Zellen durch verschiedene chemische und physikalische Hinweise spezifiziert. Zu verstehen, wie einzelne Zellen diese Informationen interpretieren und wie sie die mehrzellige Baugruppe als auftauchende Eigenschaft regulieren, ist eines der ultimativen Ziele von Morphogenesestudien. Der Modellorganismus C. elegans hat wesentlich zum Verständnis der zellulären Regulation der Morphogenese wie Zellpolarität^1,Zellteilungsmuster¹, Zellschicksalsentscheidung²und Gewebe-Skala-Vorschriften wie neuronale Verdrahtung³ und Organogenese^4,5beigetragen. Obwohl es verschiedene genetische Werkzeuge zur Verfügung, Gewebe-Engineering-Methoden sind begrenzt.

Die erfolgreichste Tissue-Engineering-Methode in der C. elegans-Studie ist die klassische Blastomer-Isolation⁶; Da C. elegans Embryo von einer Eierschale und einer Durchlässigkeitsbarriere⁷umgeben ist, ist ihre Entfernung eines der hauptverfahren dieser Methode. Während diese blastomere Isolationsmethode eine vereinfachte Rekonstitution des Zell-Zell-Kontakts ermöglicht, erlaubt sie nicht die Eliminierung unerwünschter Hinweise; Der Zellkontakt stellt nach wie vor sowohl mechanische (z. B. Haftung) als auch chemische Hinweise dar, wodurch unsere Fähigkeit, den kausalen Zusammenhang zwischen dem Cue und dem zellulären Verhalten vollständig zu analysieren, eingeschränkt wird.

Die in diesem Papier vorgestellte Methode verwendet Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen, die kovalent an alle amin-reaktiven Moleküle binden können, einschließlich Proteine wie Liganden. Insbesondere haben wir eine amin-reaktive Form von Rhodamine Red-X als Liganden verwendet, um Perlen sowohl visuell nachvollziehbar als auch klebend an der Zelle zu machen. Die Carboxylgruppen der Perlenoberfläche und der primären Amingruppen von Ligandenmolekülen werden durch wasserlösliches Carbodiimid 1-ethyl-3-(Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDAC)^8,9gekoppelt. Erhaltene Klebeperlen ermöglichen die Auswirkungen des mechanischen Hinweises auf die Zelldynamik¹⁰. Wir haben diese Technik verwendet, um mechanische Hinweise zu identifizieren, die für die Zellteilungsausrichtung¹⁰erforderlich sind.

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Protokoll

1. Herstellung von Klebstoff-Polystyrol-Perle

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert keine aseptische Technik.

1. Wiegen Sie 10 mg Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
2. Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 1 ml 2-(N-Morpholino)Ethanulfonsäure (MES) Puffer in die Röhre. Da der MES-Puffer kein Phosphat und Acetat enthält, was die Reaktivität von Carbodiimid reduzieren kann, ist er für die Proteinkopplungsreaktion geeignet. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.
3. Drehen Sie das Rohr für 60 s bei 2.000 x g über eine Tischzentrifuge.
4. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.
5. Waschen Sie die Perlen erneut mit 1 ml MES-Puffer, indem Sie die Schritte 1.2-1.4 befolgen.
6. Fügen Sie 1 ml MES-Puffer mit 10 mg EDAC in das Rohr, um die Oberflächen-Carboxylgruppen zu aktivieren. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.
7. Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 15 min bei Raumtemperatur.
8. Drehen Sie die Perlen für 60 s bei 2.000 x g.
9. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.
10. Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 1 ml Phosphat gepufferte Saline (PBS) in das Rohr. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.
11. Drehen Sie das Rohr für 60 s bei 2.000 x g.
12. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.
13. Waschen Sie die Perlen erneut mit 1 ml PBS, indem Sie den Schritten 1.10-1.12 folgen.
14. Die endgültige Konzentration von Rhodamine verwendet wird, hängt von der Belastung abgebildet. Bereiten Sie 1 ml 1-, 10-, 100- und 1000-fache Verdünnungsserie von Rhodamine Red-X aus der 0,65 mM Rhodamine Red-X-Lagerlösung vor.
15. Pipette 20 L Perlen in jedes serielle Verdünnungsrohr.
16. Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 5 min bei Raumtemperatur.
17. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml PBS, indem Sie die Schritte 1.10-1.12 wiederholen.
18. 1 ml PBS in das Rohr geben und bis zu 6 Wochen bei 4 °C lagern. Überprüfen Sie die Fluoreszenzintensität der Perlen unter einem Mikroskop, das für die Live-Bildgebung verwendet wird. Die entsprechende Konzentration des Rhodamine-Rot-X-Succinimidylesters hängt von den bildgebenden Bedingungen ab (Abbildung 1).
    HINWEIS: Perlen ohne Rhodamine Red-X Behandlung nicht an zelle haften. Rhodamine Red-X dient als Fluoreszenzmarker sowie Als Klebemolekül. Die elektrostatische Wechselwirkung zwischen positiv geladenem Rhodamine Red-X und negativ geladener Plasmamembran ist eine vermeintliche Ursache der Adhäsion.

2. Montage der Mundpipette

1. Schneiden Sie breite (6,35 mm Innendurchmesser) und schmale (3,175 mm Innendurchmesser) Tygon-Rohre auf ca. 25 cm bzw. 40 cm Länge(Abbildung 2).
2. Verbinden Sie die Tygon-Röhren mit einem Polytetrafluorethylen-Filter (PTFE) (0,2 m Porengröße) (Abbildung 2).
3. Zerlegen Sie ein handelsübliches Saugrohr und befestigen Sie den Kapillarhalter und das Mundstück am Ende der schmalen bzw. breiten Tygon-Rohre (Abbildung 2).
   HINWEIS: PTFE-Filter wurde verwendet, um das Einatmen von Dämpfen der Hypochloritlösung über Mundpipetten zu verhindern.

3. Isolierung von Embryoblastomer

HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe und Labormantel, um Schnitt und Kontakt mit der Bleichlösung zu vermeiden.

1. Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare (Kapazität; 10 L) mit der rechten und linken Hand.
2. Ziehen Sie die Mikrokapillare an beiden Enden, um Spannung aufzutragen und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren zu machen (Abbildung 3A).
3. Schneiden Sie die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit Zangen unter dem Seziermikroskop und befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mundpipettiergerät (Abbildung 2). Bereiten Sie zwei Arten von Pipetten vor. Die Spitzenöffnungsgrößen für die Pipetten sollten etwa 2x und 1x der kurzen Achslänge von C. elegans Embryonen (30 'm) für den Embryotransfer und die Eischalenentfernung bzw. Abbildung 3B-Dbetragen.
4. Pipette 45 l Eisalzlösung auf einen Brunnen eines Multiwell-Schlittens(Abbildung 4A; unten).
5. 5-10 erwachsene C. elegans auf eine gut enthaltende Eisalzlösung geben.
6. Um frühe C. elegans Embryonen zu erhalten, schneiden Erwachsene in Stücke, indem Sie zwei Nadeln rechts und links des C. elegans Körpers positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben(Abbildung 4A; obere Schaltpläne).
7. Pipette 45 l Hypochloritlösung auf einen Brunnen neben der brunnenhaltigen Eisalzlösung(Abbildung 4B).
8. Pipette 45 l des Wachstumsmediums von Sheltons auf die folgenden drei Brunnen neben der brunnenhaltigen Hypochloritlösung (Abbildung 4B).
9. Übertragen Sie 1-Zell-Stadium- und frühe 2-Zellen-Embryon in die Hypochloritlösung durch Mundpipettieren mit der handgezeichneten Kapillare für embryonale Übertragung (Abbildung 4B).
10. Warten Sie auf 40-55 s.
11. Waschen Sie die Embryonen, indem Sie die Embryonen aus der Hypochloritlösung in Sheltons Wachstumsmedium übertragen, indem Sie mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer Pipettieren (Abbildung 4B).
12. Waschen Sie die Embryonen erneut, indem Sie die Embryonen in einen neuen Brunnen von Sheltons Wachstumsmedium übertragen, indem Sie mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer Pipettieren (Abbildung 4B).
13. Übertragen Sie die gewaschenen Embryonen in einen neuen Brunnen von Sheltons Wachstumsmedium durch Mundpipettieren mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer. Mit der handgezeichneten Kapillare für die Eischalenentfernung, wiederholen Sie sorgfältig die Pipettierung(Abbildung 4C; mittlere Schaltpläne). Wenn die Eierschale erfolgreich entfernt wird, werden die embryonalen Zellen kugelförmiger(Abbildung 4C;rechts).
14. Trennen Sie die 2-Zellen-Stadium embryonale Blastomere durch sanfte und kontinuierliche Pipettierung mit der handgezeichneten Kapillare für die Eischalenentfernung (Abbildung 4D).

4. Rekonstitution von Kontaktmustern mit Blastomer und Perle

HINWEIS: Arbeiten Sie unter dem Bildgebungsmikroskop, um eine Trennung einer Zelle von einer Perle zu vermeiden und die rechtzeitige Bildaufnahme zu erleichtern.

1. Um dies mit einem invertierten Mikroskop zu beobachten, bereiten Sie eine Bildkammer wie in Abbildung 5vor.
   1. Legen Sie einen Deckelslip auf einen Decksliphalter(Abbildung 5A).
   2. Verkleben Sie die Kanten des Deckels, um ihn zu stabilisieren. Die Seite mit Klebeband ist die "Rückseite"(Abbildung 5A,B).
   3. Drehen Sie den Deckelhalter auf die "Vorderseite" und ziehen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis auf den Deckel (Abbildung 5C).
      HINWEIS: Jede Glasbodenschale funktioniert auch, sofern die Embryonen durch die Mundpipette manipulierbar sind.
2. Fügen Sie Sheltons Wachstumsmedium innerhalb des Kreises hinzu, der vom hydrophoben Marker gezeichnet wird (Abbildung 5D).
3. Übertragen Sie das isolierte Blastomer in die Bildkammer.
4. Geben Sie ein kleines Volumen der chemisch funktionalisierten Perlen mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer.
5. Steuern Sie die Position der Polystyrolperlen, indem Sie in die handgezeichnete Kapillare blasen, bis die Perle an dem isolierten Blastomer befestigt wird.
6. Montieren Sie einen Deckelschlupf, um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden (Abbildung 5E). Führen Sie Live-Bildgebung durch.

5. Herstellung wichtiger Reagenzien

1. Eisalzlösung (10 ml): Kombinieren Sie 235 l von 5 M NaCl und 240 l von 2 M KCl mit 9525 l dH₂O.
2. Hypochloritlösung (10 ml): Kombinieren Sie 7,5 ml Clorox (mit ca. 7,5 % Natriumhypochlorit) mit 2,5 ml 10 N NaOH (Endkonzentration von Natriumhypochlorit beträgt ca. 5,625%).
   HINWEIS: Obwohl viele veröffentlichte Methoden Chitinase verwendet haben, um chitinöse Eierschalen zu verdauen, haben wir eine Methode mit Hypochloritlösung¹¹angenommen. Durch die Vermeidung der Batch-zu-Batch-Variationen von Chitinase-Aktivitäten glauben wir, dass diese Methode reproduzierbarer und kostengünstiger ist.
3. 0,81 mM Inulin Lösung (40 ml)
   1. 0,2 g Inulin zu 40 ml dH₂O hinzufügen.
   2. Autoklav aufzulösen.
      HINWEIS: Hält 1 Monat bei 4 °C.
4. 0,5 M MES Puffer (500 ml)
   1. 48,81 g MES in 400 ml destilliertem Wasser (dH₂O) auflösen.
   2. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,0 ein.
   3. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 500 ml mit dH₂O.
5. PBS-Lösung (1 l)
   1. Um 10-fache PBS-Lösung herzustellen, lösen Sie 1 Packung PBS-Vormischungspulver in 1 L dH₂O auf.
   2. Kombinieren Sie 100 ml 10-fach-PBS-Lösung mit 900 ml dH₂O.
6. 5% Polyvinylpyrrolidon (PVP) Lösung (4 ml)
   1. Unter sterilen Bedingungen 0,2 g PVP in 4 ml Drosophila Schneiders Medium auflösen.
      HINWEIS: Öffnen Sie immer Schneider es Medium Stock in Tissue Culture (TC) Haube. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.
7. 0,65 mM Rhodamine Red-X Stofflösung (2 ml)
   1. Wiegen Sie 1 mg Rhodamine Red-X.
   2. 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zum Auflösen hinzufügen.
   3. Aliquot und lagern bei -20 °C.
8. Shelton es Growth Medium (SGM) (10,25 ml)
   1. Kombinieren Sie unter sterilen Bedingungen 8 ml Medium von Drosophila Schneider, 1 ml PVP-Lösung, 1 ml Inulin-Lösung, 1 ml Basal Medium Eagle (BME)-Vitamine, 50 l Penicillin-Streptomycin und 100 l Lipidkonzentrat.
   2. Aliquot 325 l SGM in 1,5 ml Mikroröhren.
      HINWEIS: Etwa 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.
   3. Am Tag der Blastomer-Isolierung 175 L fetales Rinderserum (FBS) zum SGM hinzufügen (bei einem Gesamtvolumen von 500 l).
      HINWEIS: FBS bei -20 °C aufbewahren und vor Gebrauch auftauen. FBS muss nicht wärmeabgetötet werden.

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Ergebnisse

Für die Perlenpräparation haben wir die optimale Menge an Rhodamin-Rot-X-Succinimidylester für den transgenen Stamm bestimmt, der GFP-Myosin II und mCherry-Histon exzessiiert (Abbildung 1A-D). Wir verwendeten mCherry mit Histon als Marker für die Zellzyklusprogression. Da sowohl Rhodamine Red-X als auch mCherry mit einem 561 nm Laser beleuchtet werden, ist die optimale Intensität des Rhodamine Red-X Signals mit der von Histone vergleichbar, um eine gleichzeitige Bildgeb...

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Diskussion

Die Rekonstitution vereinfachter Zellkontaktmuster ermöglicht es Forschern, die Rollen bestimmter Zellkontaktmuster in verschiedenen Aspekten der Morphogenese zu testen. Wir haben diese Technik verwendet, um zu zeigen, dass die Zellteilungsachse durch den physischen Kontakt mit Klebeperlen¹⁰gesteuert wird. Da die Divisionsachsenspezifikation für die multizelluläre Entwicklung entscheidend ist, indem sie zur Morphogenese^14,Stammzellteilung^15,<...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride	Alfa Aesar	AAA1080703	For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	For the bead preparation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals)	Fisher BioReagents	BP300-100	For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder	Fisher BioReagents	BP665-1	For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer	Molecular Probes	R6160	For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.	Intelligent Imaging Innovation	N.A.	For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.