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요약

다세포 시스템의 조직 복잡성은 세포 외 단서와 개별 적인 세포 행동 사이 인과 관계의 확인을 혼동. 여기에서, 우리는 C. elegans 배아 블라스토미어와 접착성 폴리스티렌 구슬을 사용하여 접촉 의존적 큐와 분할 축 사이의 직접적인 링크를 연구하는 방법을 제시한다.

초록

다세포 시스템에서, 개별 세포는 인접한 세포 및 환경에서 오는 각종 물리적 및 화학적인 단서에 의해 포위됩니다. 이 조직 복잡성은 외인성 단서와 세포 역학 사이 인과 링크의 확인을 혼동합니다. 종합적으로 재구성된 다세포 시스템은 연구원이 다른 사람을 제거하는 동안 특정 단서를 테스트할 수 있게 함으로써 이 문제를 극복합니다. 여기서, 우리는 분리 된 예쁜 꼬마염 블래스토미어 및 접착 성 폴리스티렌 구슬로 세포 접촉 패턴을 재구성하는 방법을 제시합니다. 절차는 계란 껍질 제거, 세포 세포 접착을 방해하여 blastomere 격리, 접착성 폴리스티렌 구슬의 준비, 세포 세포 또는 세포 비드 접촉의 재구성을 포함합니다. 마지막으로, 우리는 배아 개발에서 공간 세포 패터닝 및 세포 운명 사양의 조절에 기여하는 세포 분열 축의 방향을 조사하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 제시한다. 이 견고하고 재현 가능하며 다재다능한 체외 식 방법을 통해 공간 세포 접촉 패턴과 세포 반응 사이의 직접적인 관계를 연구할 수 있습니다.

서문

다세포 발달 도중, 개별 적인 세포의 세포 행동 (예를 들면, 분할 축)는 각종 화학적 및 물리적 단서에 의해 지정됩니다. 개별 세포가 이 정보를 해석하는 방법, 그리고 다세포 어셈블리를 응급 재산으로 조절하는 방법을 이해하는 것은 형태 형성 연구의 궁극적인 목표 중 하나입니다. 모델 유기체 C. elegans는 세포 극성1,세포 분열 패턴1,세포 운명 결정2,신경 배선3 및 유기발생과같은 조직 규모 규정과 같은 형태 형성의 세포 수준 조절에 크게 기여하고 있다4,5. 다양한 유전 적 도구가 있지만 조직 공학 방법은 제한적입니다.

C. elegans 연구에서 가장 성공적인 조직 공학 방법은 고전적인 blastomere 격리6; C. 예쁜꼬마조충태아는 달걀 껍질과 투과성 장벽7에둘러싸여 있기 때문에 제거는이 방법의 주요 절차 중 하나입니다. 이 blastomere 절연 방법은 단순화 된 방식으로 세포 세포 접촉의 재구성을 가능하게하지만, 원치 않는 큐의 제거를 허용하지 않습니다; 세포 접촉은 여전히 기계적(예: 접착) 및 화학 적 단서를 모두 발생시켜 큐와 세포 행동 사이의 인과 관계를 완전히 분석하는 능력을 제한합니다.

이 백서에 제시된 방법은 리간드로 단백질을 포함하여 어떤 아민 반응성 분자든지에 공유하게 묶을 수 있는 carboxylate 수정된 폴리스티렌 구슬을 이용합니다. 특히, 우리는 구슬을 시각적으로 추적 할 수 있고 세포에 접착제로 만들기 위해 리간드로 로다민 레드-X의 아민 반응성 형태를 사용했습니다. 리간드 분자의 비드 표면 및 1차 아민 기의 카르복실 기는 수용성 카르보디미드 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카르보디미드(EDAC)8,9에의해 결합된다. 얻어진 접착제 비드는 세포역학(10)에기계적 큐의 효과를 허용한다. 우리는 세포 분열 방향10에필요한 기계적 단서를 식별하기 위해이 기술을 사용했다.

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프로토콜

1. 접착제 폴리스티렌 비드의 준비

참고:이 프로토콜은 무균 기술이 필요하지 않습니다.

  1. 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 카르복실레이트 변형 폴리스티렌 구슬 10 mg의 무게.
  2. 구슬을 세척하려면 튜브에 2-(N-morpholino) 에탄설포닉산(MES) 완충제 1mL를 추가합니다. MES 완충제는 인산염 및 아세테이트를 포함하지 않기 때문에, 이는 탄수화물의 반응성을 감소시킬 수 있고, 단백질 커플링 반응에 사용하기에 적합하다. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.
  3. 벤치탑 원심분리기를 통해 2,000 x g에서 60초동안 튜브를 회전시다.
  4. 버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.
  5. 1.2-1.4 단계 다음 단계로 MES 버퍼의 1 mL로 구슬을 다시 씻으십시오.
  6. 표면 카르복실 기를 활성화하기 위해 튜브에 EDAC 10 mg을 포함하는 MES 버퍼 1 mL을 추가하십시오. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.
  7. 실온에서 15분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다.
  8. 2,000 x g에서60 s에 대한 구슬을 아래로 회전 .
  9. 버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.
  10. 구슬을 세척하려면 튜브에 인산 완충 식염수 (PBS) 1 mL을 추가합니다. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.
  11. 2,000 x g에서60 s에 대 한 튜브를 회전 합니다.
  12. 버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.
  13. 1.10-1.12 단계 다음 단계로 PBS의 1 mL로 구슬을 다시 씻습니다.
  14. 사용되는 로다민의 최종 농도는 이미지화되는 변형에 따라 달라집니다. 0.65 mM 로다민 Red-X 재고 용액에서 로다민 레드-X의 1mL, 10-100배 및 1000배 희석 시리즈를 준비합니다.
  15. 각 직렬 희석 튜브에 비펫 20 μL의 비펫.
  16. 실온에서 튜브를 5분 동안 회전하고 배양합니다.
  17. 1.10-1.12 단계를 반복하여 PBS의 1 mL로 구슬을 두 번 씻습니다.
  18. 튜브에 1 mL의 PBS를 넣고 최대 6 주 동안 4 °C에 보관하십시오. 살아있는 화상 진찰을 위해 이용된 현미경의 밑에 구슬의 형광 강렬을 검사하십시오. 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 적절한 농도는 이미징 조건에 의존한다(도1).
    참고 : 로다민 적색 X 처리가없는 구슬은 세포에 부착되지 않습니다. 로다민 레드-X는 형광 마커뿐만 아니라 접착제 분자의 역할을 한다. 양전하로다민 적색-X와 음전하 플라즈마 멤브레인 사이의 정전기 상호 작용은 접착의 원인이다.

2. 입 피펫의 조립

  1. 폭(내경 6.35mm)과 좁은(내경 3.175mm) 타이곤 튜브를 각각 약 25cm 및 40cm 길이로 자른다(그림2).
  2. 타이곤 튜브를 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필터(0.2 μm 모공 크기)와 연결합니다(그림2).
  3. 시판되는 흡입기 튜브를 분해하고 좁고 넓은 타이곤 튜브의 끝에 모세관 홀더와 마우스피스를 각각 부착합니다(그림2).
    참고 : PTFE 필터는 입 파이펫을 통해 하이포 염액 용액의 연기 흡입을 방지하기 위해 사용되었다.

3. 배아 블라스포미어의 분리

참고: 표백 용액과의 절단 및 접촉을 피하기 위해 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오.

  1. 마이크로 모세관의 각 끝(용량; 10 μL)을 오른손과 왼손으로 잡습니다.
  2. 미세 모세관을 양쪽 끝으로 당겨 긴장을 가하고 모세관의 중심을 버너 위에 가져와 손으로 당긴 두 개의 모세 혈관을 만듭니다(그림 3A).
  3. 해부 현미경 아래 집게로 손으로 뽑은 모세 혈관의 끝을 다듬고 당겨진 모세관을 입 파이펫팅 장치에 부착합니다(그림2). 두 가지 유형의 파이펫을 준비합니다. 파이펫에 대한 팁 개방 크기는 배아 전달 및 난자 제거를 위한 C. elegans 배아(30 μm)의 짧은 축 길이의 약 2배 및 1배이어야 하며, 각각 도 3B-D).
  4. 파이펫 45 μL의 달걀 소금 용액을 멀티웰 슬라이드의 우물 상에(그림4A;하단)에.
  5. 5-10명의 성인 C. 예쁜꼬마선충을 달걀 소금 용액이 들어있는 우물 위에 놓습니다.
  6. 초기 C. 예쁜꼬마선충 배아를 얻으려면, C. 예쁜꼬마선충의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 배치하고 바늘을 서로 지나서 슬라이딩하여 성인을 조각으로 잘라냅니다(그림 4A;상부 회로도).
  7. 피펫 45 μL의 하이포아염소산염 용액을 잘 함유된 계란 염액 옆에 있는 우물위에(그림 4B).
  8. 쉘튼의 성장 배지의 피펫 45 μL을 하모염염 액을 함유하는 웰 옆에 있는 3개의 웰 에 상구한다(도4B).
  9. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅에 의해 1 세포 단계 및 초기 2 세포 단계 배아를 하이포아염소산염 용액으로 옮김(도4B)으로옮김을 옮김을 전달한다.
  10. 40-55s 기다립니다.
  11. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅을 하여 하이포아염소산염 용액에서 배아를 쉘튼의 성장 배지로 옮겨 배아를 세척한다(그림4B).
  12. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅을 하여 배아를 쉘튼의 성장 배지의 새로운 우물로 옮겨 다시 세척한다(그림4B).
  13. 씻은 배아를 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 피펫팅하여 쉘튼의 성장 배지의 새로운 우물로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮니다. 손으로 그린 모세관을 사용하여 달걀 껍질 제거를 위해 조심스럽게 파이펫팅을 반복합니다(그림 4C; 중간 회로도). 난자 껍질이 성공적으로 제거되면 배아 세포가 더 구형이 됩니다(그림 4C; 오른쪽).
  14. 2 세포 단계 배아 블래스타미어를 달걀 껍질 제거를 위해 손으로 그린 모세관으로 부드럽고 지속적으로 파이펫팅하여 분리합니다(그림4D).

4. 블라스포미어와 구단으로 접촉 패턴 의 재구성

참고 : 비드에서 세포의 해리를 방지하고 적시에 이미지 수집을 용이하게하기 위해 이미징 현미경에서 작동합니다.

  1. 반전된 현미경을 사용하여 관찰하려면 그림 5에서와같이 이미징 챔버를 준비합니다.
    1. 커버슬립 홀더에 커버슬립을 놓습니다(그림5A).
    2. 커버슬립의 가장자리를 테이프로 테이프로 하여 안정화합니다. 테이프가 있는 쪽은 '뒷면' 면입니다(그림5A, B).
    3. 커버슬립 홀더를 '앞면' 쪽으로 뒤집고 소수성 펜으로 커버슬립에 원을그립니다(그림5C).
      참고 : 배아가 입 피펫에 의해 조작 할 수 있다면 모든 유리 바닥 요리도 작동합니다.
  2. 소수성 마커에 의해 그려진 원 내에 셸튼의 성장 배지를 추가합니다(그림5D).
  3. 분리된 블래스토미어를 이미징 챔버로 옮김.
  4. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관을 사용하여 화학적으로 기능화된 비드의 소량을 분배합니다.
  5. 비드가 분리된 블래스토미어에 부착될 때까지 손으로 그린 모세관에 불어 폴리스티렌 비드의 위치를 제어합니다.
  6. 매체의 증발을 방지하기 위해 커버 슬립을 장착합니다(그림 5E). 라이브 이미징을 수행합니다.

5. 중요한 시약의 준비

  1. 계란 소금 용액 (10 mL): 235 μL 의 5 M NaCl 및 2M KCl의 240 μL과 9525 μL의 dH2O를 결합합니다.
  2. 하이포아염소산염 용액 (10 mL): 클로록스 7.5 mL (약 7.5 % 하이포 염화 나트륨 함유)와 10 N NaOH 2.5 mL (하이포 아염소산 나트륨의 최종 농도는 약 5.625 %)를 결합합니다.
    참고 : 많은 출판 된 방법이 치틴 계란 껍질을 소화하기 위해 치티 나아제 (chitinase)를 사용했지만, 우리는 hypochlorite 용액11을사용하는 방법을 채택했습니다. 치티나제 활동의 배치 대 배치 변형을 피함으로써, 우리는이 방법이 더 재현 가능하고 비용 효율적인 접근 방식이라고 생각합니다.
  3. 0.81 mM 이눌린 용액 (40 mL)
    1. dH2O 의 40 mL에 이눌린 0.2 g을 추가하십시오.
    2. 용해할 오토클레이브.
      참고: 4°C에서 1개월 동안 보관하십시오.
  4. 0.5 M MES 버퍼(500mL)
    1. 400 mL의 증류수(dH2O)에MES 48.81 g을 용해시.
    2. pH를 6.0으로 조정합니다.
    3. dH2O로 총 볼륨을 500 mL로 가져옵니다.
  5. PBS 솔루션(1L)
    1. 10배 PBS 용액을 만들려면, 10-dH2O의 1L에 PBS 프리믹스 파우더 1패키지를 용해시고.
    2. 10배 PBS 솔루션 100mL와 900mL의 dH2O를 결합합니다.
  6. 5% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 용액(4mL)
    1. 멸균 조건하에서, 초파리 슈나이더 의 배지 4 mL에 0.2 g의 PVP를 용해시다.
      참고 : 항상 조직 배양 (TC) 후드에 슈나이더의 중간 주식을 엽니 다. 4 °C에서 1 개월 동안 유지하십시오.
  7. 0.65 mM 로다민 레드-X 재고 솔루션 (2 mL)
    1. 무게 1 로다민 레드-X의 mg.
    2. 용해시키기 위해 디메틸 설폭사이드(DMSO) 2 mL를 첨가합니다.
    3. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
  8. 셸튼의 성장 매체 (SGM) (10.25 mL)
    1. 멸균 조건하에서, 드로소필라 슈나이더 배지 8mL, PVP 용액 1 mL, 이눌린 용액 1mL, 기저 미디엄 이글(BME) 비타민 1mL, 페니실린-스트렙토마이신 50 μL, 100 μL의 지질 농축액을 함께 결합합니다.
    2. 1.5 mL 마이크로튜브로 SGM의 325 μL.
      참고: 4 °C에서 약 1개월 동안 보관하십시오.
    3. 블라스토미어 분리의 날에, SGM에 175 μL의 태아 소 혈청 (FBS)을 추가하십시오 (총 부피 500 μL).
      참고: FBS를 -20°C에 보관하고 사용 전에 해동하십시오. FBS는 열을 죽일 필요가 없습니다.

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결과

구슬 제제를 위해, GFP-미오신 II 및 mCherry-histone을 발현하는 형질전환 균주에 대한 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 최적 양을 결정하였다(도1A-D). 우리는 세포 주기 진행의 마커로 mCherry 태그 히스톤을 사용. 로다민 레드-X와 mCherry 모두 561 nm 레이저로 조명되기 때문에 로다민 레드-X 신호의 최적 강도는 세포와 비드의 동시 이미징을 허용하는 히스톤의 강도?...

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토론

단순화된 세포 접촉 패턴의 재구성은 연구원이 형태 형성의 다른 양상에 있는 특정 세포 접촉 패턴의 역할을 시험하는 것을 시킬 것입니다. 우리는 세포 분열 축이 접착제 비드(10)와의물리적 접촉에 의해 제어된다는 것을 보여주기 위해이 기술을 사용했다. 분할축 명세서는형태형성14, 줄기세포분열15,16,조직항상성15...

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공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

우리는 조언과 C. elegans 균주, 돈 모어만, 코타 미즈모토, 생명 과학 연구소 이미징 코어 시설 공유 장비 및 시약, 아오이 히로야수, 리사 페르난도, 김민지 의 유지 보수에 대한 우리의 원고의 유지 보수에 대한 조언과 제공 에 대한 제임스 프리스와 브루스 Bowerman 감사합니다. 우리의 작업은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원됩니다 (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochlorideAlfa AesarAAA1080703For the bead preparation
Aspirator Tube AssemblyDrummond21-180-13For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-typeCaenorhabditis Genetics CenterN2Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37in houseKSG5Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µLDrummond21-180-13For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter)KISKER BiotechPPS-30.0COOHPFor the bead preparation
CD Lipid ConcentrateLife Technologies11905031For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
CloroxCloroxN. A.For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holderIn houseN.A.For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.Carl ZeissStemi 508For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada originGibcoA3160701For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gaugeBD14-826AAFor the blastomere isolation
InulinAlfa AesarAAA1842509For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)Gibco11120052For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals)Fisher BioReagentsBP300-100For the bead preparation
Multitest Slide 10 WellMP BiomedicalsICN6041805For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x PowderFisher BioReagentsBP665-1For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140148For the blastomere isolation.
PolyvinylpyrrolidoneFisher BioReagentsBP431-100For the blastomere isolation
Potassium ChlorideBioshopPOC888For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomerMolecular ProbesR6160For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile MediumGibco21720024For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium ChlorideBioshopSOD001For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 NFisher ChemicalSS255-1For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.Intelligent Imaging InnovationN.A.For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-SterileBasix13100115For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-862For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-854For the blastomere isolation.

참고문헌

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