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要約

多細胞系の組織複合体は、細胞外キューと個々の細胞挙動との因果関係の同定を混同した。ここでは、C.エレガンス胚ブラストメアと接着剤ポリスチレンビーズを用いて接触依存性キューと分割軸との直接的なリンクを研究する方法を提示する。

要約

多細胞系では、個々の細胞は、隣接する細胞や環境から来る様々な物理的および化学的手掛かりに囲まれています。この組織の複雑さは、外因性キューと細胞ダイナミクスとの間の因果関係の同定を混同する。合成再構成された多細胞システムは、研究者が他の人を排除しながら、特定の手掛かりをテストできるようにすることで、この問題を克服します。ここでは、単離されたカエノラブディティス・エレガンス・ブラストミアおよび接着剤ポリスチレンビーズを用いて細胞接触パターンを再構成する方法を提示する。手順は、卵殻除去、細胞細胞接着を破壊することによってブラストミア分離、粘着性ポリスチレンビーズの調製、および細胞細胞または細胞ビーズ接触の再構成を含む。最後に、この方法の応用により、胚の発達における空間細胞パターニングと細胞運命仕様の調節に寄与する細胞分裂軸の向きを調べる。この堅牢で再現性があり、多目的なin vitro法により、空間セル接触パターンと細胞応答との直接的な関係の研究が可能になります。

概要

多細胞発達の間、個々の細胞の細胞挙動(例えば、分裂軸)は、様々な化学的および物理的手掛かりによって指定される。個々の細胞がこの情報をどのように解釈し、それらが多細胞集合体を創発的性質として調節するかを理解することは、形態形成研究の究極の目標の一つです。モデル生物C.エレガンスは、細胞極性1、細胞分裂パターン1、細胞運命決定2、および神経配線3および有機新生4、5などの組織規模の調節などの形態形成の細胞レベル調節の理解に大きく寄与している。様々な遺伝的ツールがありますが、組織工学の方法は限られています。

C.エレガンス研究で最も成功した組織工学法は、古典的なブラストミア分離6である。C.エレガンス胚は卵殻および透過性バリア7に囲まれているので、その除去はこの方法の主要な手順の1つである。このブラストミア単離方法は、簡略化された方法で細胞細胞接触の再構成を可能にしますが、不要な手掛かりを排除することはできません。細胞接触は依然として機械的(例えば、接着性)と化学的手掛かりの両方を有し、それによってキューと細胞行動との因果関係を完全に分析する能力を制限する。

本論文で提示する方法は、リガンドとしてタンパク質を含む任意のアミン反応性分子に共有結合することができるカルボン酸修飾ポリスチレンビーズを使用する。特に、リガンドとしてローダミンRed-Xのアミン反応性を用いて、ビーズを細胞に視覚的に追跡可能かつ接着剤としました。リガンド分子のビーズ表面および第一級アミン基のカルボキシル基は、水溶性カルボジイミド1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)8、9によって結合される。得られた接着剤ビーズは、機械的キューが細胞ダイナミクス10に及ぼす影響を可能にする。この技術を用いて、細胞分裂配向10に必要な機械的手掛かりを同定した。

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プロトコル

1. 接着剤ポリスチレンビーズの調製

注: このプロトコルは無菌技術を必要としません。

  1. 1.5 mLマイクロ遠心管内のカルボキシル酸変性ポリスチレンビーズの重量を10mg。
  2. ビーズを洗浄するには、2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液を1mLチューブに加えます。MES緩衝液はリン酸塩や酢酸塩を含まないので、カルボジイミドの反応性を低下させることができ、タンパク質カップリング反応に用いることが好適である。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
  3. ベンチトップ遠心分離機を介して2,000 x gで60 sのチューブを回転させます。
  4. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
  5. 手順 1.2 ~ 1.4 に従って、MES バッファーを 1 mL 使用してビーズをもう一度洗います。
  6. 10 mgのEDACを含むMESバッファーをチューブに1mL加え、表面カルボキシル基を活性化します。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
  7. 室温でチューブを15分間回転させてインキュベートします。
  8. 2,000 x gで 60 s のビーズをスピンダウンします。
  9. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
  10. ビーズを洗浄するには、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)を1mLチューブに加えます。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
  11. 2,000 x gで 60 s のチューブをスピンダウンします。
  12. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
  13. 手順 1.10~1.12 に従って、1 mL の PBS でビーズをもう一度洗います。
  14. 使用されるローダミンの最終的な濃度は、画像化される株に依存する。0.65 mM ローダミン Red-X 原液からローダミン Red-X の 1 mL、10 倍、1000 倍希釈シリーズを準備します。
  15. 各シリアル希釈チューブにビーズのピペット20°L。
  16. 室温でチューブを5分間回転させてインキュベートします。
  17. 手順1.10~1.12を繰り返して、1mLのPBSでビーズを2回洗浄します。
  18. チューブに1 mLのPBSを加え、4 °Cで最大6週間保存します。ライブイメージングに使用する顕微鏡でビーズの蛍光強度を確認します。ローダミン赤-Xコハク酸ジミジルエステルの適切な濃度は、撮像条件に依存する(図1)。
    注:ローダミンRed-X治療を行わないビーズは細胞に付着しません。ローダミン赤-Xは、蛍光マーカーならびに接着分子として機能する。正に帯電したローダミンRed-Xと負電荷プラズマ膜との間の静電気的相互作用は、接着の原因である。

2. 口ピペットの組み立て

  1. タイゴンチューブをそれぞれ長さ約25cmと40cmに広くカット(内径6.35mm)と狭い(内径3.175mm)(図2)。
  2. タイゴンチューブをポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルター(0.2μmの細孔サイズ)で接続します(図2)。
  3. 市販のアスピレーターチューブを分解し、キャピラリーホルダーとマウスピースをそれぞれ狭くて広いタイゴンチューブの端に取り付けます(図2)。
    注:PTFEフィルタは、口のピペットを介して次亜塩素酸塩溶液の煙の吸入を防ぐために使用されました。

3. 胚ブラストミアの単離

メモ:漂白液の切断や接触を避けるため、手袋とラボコートを着用してください。

  1. マイクロキャピラリーの両端(容量;10°L)を左右の手で持たします。
  2. マイクロキャピラリーを両端に引っ張って張力を加え、バーナーの上に毛細血管の中心を持って2本の手で引っ張られた毛細血管を作ります(図3A)。
  3. 解剖顕微鏡下の鉗子で手で引っ張った毛細血管の先端をトリミングし、引っ張った毛細血管を口管装置に取り付ける(図2)。2種類のピペットを用意します。ピペットの先端開口部サイズは、胚移植および卵殻除去のためのC.エレガンス胚の短軸長(30μm)の約2倍と1倍である必要があります。
  4. ピペット45μLの卵塩溶液をマルチウェルスライドのウェル上に(図4A;底部)。
  5. 5-10大人C.エレガンスを卵塩溶液を含む井戸の上に置きます。
  6. 初期のC.エレガンス胚を得るためには、C.エレガンス体の左右に2本の針を配置し、針を互いにスライドさせて大人を粉々に切る(図4A;上回路図)。
  7. 次亜塩素酸塩溶液のピペット45μLを、卵塩溶液を含む井戸の隣の井戸に(図4B)。
  8. 次亜塩素酸塩溶液を含む井戸の隣のその後の3つの井戸にシェルトンの成長培地のピペット45μL(図4B)。
  9. 1細胞期および初期の2細胞期胚を、胚移植のための手描き毛細血管を用いてマウスピペットすることにより次亜塩素酸塩溶液に移す(図4B)。
  10. 40~55s待ちます。
  11. 次亜塩素酸塩溶液からシェルトンの成長培地に胚を移し、胚移植用の手描き毛細血管を用いてマウスピネットして胚を洗浄する(図4B)。
  12. 胚移植用の手描きキャピラリーをマウスピネットしてシェルトンの成長培地の新しい井戸に移して胚を再度洗浄する(図4B)。
  13. 洗浄した胚を、胚移植用の手描きキャピラリーでマウスピネットすることで、シェルトンの成長培地の新しい井戸に移します。卵殻除去に手描きのキャピラリーを使用して、ピペットを慎重に繰り返します(図4C/中間回路図)。卵殻が正常に除去されると、胚細胞はより球状になります(図4C;右)。
  14. 卵殻除去のための手描きキャピラリーで2細胞段階胚性芽球を穏やかに連続的にピペットで分離する(図4D)。

4. ブラストミアとビーズによる接触パターンの再構成

メモ:ビーズからの細胞の解離を避け、タイムリーな画像取得を容易にするために、イメージング顕微鏡の下で作業します。

  1. 反転顕微鏡を用いて観察するには、図5のように撮像室を用意する。
    1. カバースリップをカバースリップホルダーに置きます(図5A)。
    2. カバースリップの端にテープを貼って安定させます。テープ付きの側面は「背面」側です(図5A,B)。
    3. カバースリップホルダーを「前面」側に反転し、疎水性ペンでカバースリップに円を描きます(図5C)。
      注:胚が口のピペットによって操作可能である場合、任意のガラス底皿も動作します。
  2. 疎水性マーカーによって描画された円の中にシェルトンの成長培地を追加します(図5D)。
  3. 単離されたブラストミアを撮像室に移す。
  4. 胚移植用の手描きキャピラリーを使用して、化学的に機能化されたビーズの少量を分配する。
  5. ビーズが単離されたブラストミアに付着するまで、手描きの毛細血管に吹き込むことによって、ポリスチレンビーズの位置を制御します。
  6. 媒体の蒸発を避けるためにカバースリップを取り付ける(図5E)。ライブ イメージングを実行します。

5. 重要試薬の調製

  1. 卵塩溶液(10mL):5 M NaClの235 μLと2M KClの240°LをdH2Oの9525°Lと組み合わせます。
  2. 次亜塩素酸塩溶液(10mL):クロロックス(次亜塩素酸ナトリウム約7.5%を含む)を10 N NaOHの2.5 mL(次亜塩素酸ナトリウムの最終濃度は約5.625%)と組み合わせます。
    注:多くの公表された方法はキチナゲを用いてキチナスの卵殻を消化しているが、次亜塩素酸塩溶液11を用いた方法を採用した。チチナゼ活性のバッチ間の変動を回避することにより、この方法はより再現性と費用対効果の高いアプローチであると考えています。
  3. 0.81 mM イヌリン溶液 (40 mL)
    1. 0.2 gのイヌリンを dH2O の 40 mL に加えます。
    2. 溶解するオートクレーブ。
      注:4°Cで1ヶ月間保持します。
  4. 0.5 M MES バッファ(500 mL)
    1. 48.81gのMESを蒸留水400mL(dH2O)に溶解する。
    2. pH を 6.0 に調整します。
    3. dH2Oで総容積を500mLにします。
  5. PBS溶液(1 L)
    1. 10倍のPBS溶液を作製するには、pbSプレミックス粉末の1パッケージをdH2Oの1Lに溶解する。
    2. 10 倍の PBS 溶液を dH2O の 900 mL と組み合わせます。
  6. 5% ポリビニルピロリドン (PVP) 溶液 (4 mL)
    1. 滅菌条件下で、ショウジョウバエシュナイダーの培地の4 mLにPVPの0.2gを溶解する。
      注:常にティッシュ培養(TC)フードでシュナイダーのミディアムストックを開きます。4 °Cで1ヶ月間保管してください。
  7. 0.65 mM ローダミン レッド X ストックソリューション (2 mL)
    1. ローダミン赤-Xの体重1mg。
    2. 2 mL のジメチルスルホキシド (DMSO) を加えた溶解します。
    3. アリコートと-20°で保存します。
  8. シェルトン成長培地 (SGM) (10.25 mL)
    1. 滅菌条件下では、ショウジョウバエシュナイダーのミディアム8mL、PVP溶液1mL、イヌリン溶液1mL、基底培地イーグル(BME)ビタミン1mL、ペニシリンストレプトマイシン50μL、脂質100μLを一緒に濃縮します。
    2. 1.5 mLマイクロチューブにSGMのアリクォート325°L。
      注:4°Cで約1ヶ月間保管してください。
    3. ブラストミア単離の日に、175 μLの胎児ウシ血清(FBS)をSGMに加えます(総体積は500°L)。
      メモ:FBSは-20°Cに保管し、使用前に解凍してください。FBS は熱殺される必要はありません。

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結果

ビーズ調製のために、GFP-ミオシンIIおよびmCherry-ヒストンを発現するトランスジェニック株に対するローダミンRed-Xコハクシニルエステルの最適量を決定した(図1A-D)。細胞周期進行のマーカーとしてmCherryタグ付きヒストンを使用しました。ローダミン赤-XとmCherryの両方が561nmレーザーで照らされるため、ローダミンRed-X信号の最適強度は、細胞とビーズの同?...

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ディスカッション

簡略化された細胞接触パターンの再構成により、研究者は形態形成のさまざまな側面における特定の細胞接触パターンの役割をテストすることができます。この技術を用いて、細胞分裂軸が接着ビーズ10との物理的接触によって制御されることを示した。分裂軸仕様は、形態形成14、幹細胞分裂15、16、および組織恒常...

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開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

ジェームズ・プライスとブルース・バウアーマンのアドバイスとC.エレガンス株、ドン・モアマン、水本康太、ライフサイエンス研究所イメージングコア施設の機器と試薬を共有し、アオイ・ヒロヤス、リサ・フェルナンド、ミン・ジー・キムがC.エレガンスのメンテナンスと原稿の批判的な読み物を提供してくれたことに感謝します。当社の研究は、カナダ自然科学工学研究会議(NSERC)(RGPIN-2019-04442)によってサポートされています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochlorideAlfa AesarAAA1080703For the bead preparation
Aspirator Tube AssemblyDrummond21-180-13For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-typeCaenorhabditis Genetics CenterN2Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37in houseKSG5Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µLDrummond21-180-13For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter)KISKER BiotechPPS-30.0COOHPFor the bead preparation
CD Lipid ConcentrateLife Technologies11905031For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
CloroxCloroxN. A.For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holderIn houseN.A.For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.Carl ZeissStemi 508For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada originGibcoA3160701For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gaugeBD14-826AAFor the blastomere isolation
InulinAlfa AesarAAA1842509For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)Gibco11120052For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals)Fisher BioReagentsBP300-100For the bead preparation
Multitest Slide 10 WellMP BiomedicalsICN6041805For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x PowderFisher BioReagentsBP665-1For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140148For the blastomere isolation.
PolyvinylpyrrolidoneFisher BioReagentsBP431-100For the blastomere isolation
Potassium ChlorideBioshopPOC888For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomerMolecular ProbesR6160For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile MediumGibco21720024For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium ChlorideBioshopSOD001For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 NFisher ChemicalSS255-1For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.Intelligent Imaging InnovationN.A.For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-SterileBasix13100115For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-862For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-854For the blastomere isolation.

参考文献

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