In vitro ricostituzione dei modelli di contatto cellulare spaziale con Caenorhabditis isolato elegans Embrione Blastomeres e Perline in polistino adesivo

Riepilogo

Le complessità tissutali dei sistemi multicellulari confondere l'identificazione della relazione causale tra segnali extracellulari e comportamenti cellulari individuali. Qui, presentiamo un metodo per studiare il legame diretto tra segnali dipendenti dal contatto e assi di divisione utilizzando i blastomeri embrionali C. elegans e le perle adesive in polistirolo.

Abstract

Nei sistemi multicellulari, le singole cellule sono circondate dai vari segnali fisici e chimici provenienti dalle cellule vicine e dall'ambiente. Questa complessità tissutale confonde l'identificazione del legame causale tra segnali estrinseci e dinamiche cellulari. Un sistema multicellulare sinteticamente ricostituito supera questo problema consentendo ai ricercatori di testare uno spunto specifico eliminandone altri. Qui, presentiamo un metodo per ricostituire i modelli di contatto cellulare con caenorhabditis elegans blastomere isolati e perline di polistirolo adesivo. Le procedure prevedono la rimozione del guscio d'uovo, l'isolamento del blastomere interrompendo l'adesione cellulare-cellula, la preparazione di perline di polistirolo adesivo e la ricostituzione del contatto cell-cell o cell-perad. Infine, presentiamo l'applicazione di questo metodo per studiare l'orientamento degli assi della divisione cellulare che contribuisce alla regolazione del patterning cellulare spaziale e delle specifiche del destino cellulare nello sviluppo degli embrioni. Questo metodo in vitro robusto, riproducibile e versatile consente di studiare le relazioni dirette tra i modelli di contatto delle cellule spaziali e le risposte cellulari.

Introduzione

Durante lo sviluppo multicellulare, i comportamenti cellulari (ad esempio, l'asse di divisione) delle singole cellule sono specificati da vari segnali chimici e fisici. Comprendere come le singole cellule interpretano queste informazioni e come regolano l'assemblaggio multicellulare come proprietà emergente è uno degli obiettivi finali degli studi di morfogenesi. L'organismo modello C. elegans ha contribuito in modo significativo alla comprensione della regolazione a livello cellulare della morfogenesi come la polarità cellulare^1,la divisione cellulare^{modello 1}, la decisione del destino cellulare²e le regolazioni su scala dei tessuti come il cablaggio neuronale³ e l'organogenesi^4,5. Anche se ci sono vari strumenti genetici disponibili, i metodi di ingegneria tissutale sono limitati.

Il metodo di ingegneria tissutale di maggior successo nello studio C. elegans è il classico isolamento blastomere⁶; poiché l'embrione di C. elegans è circondato da un guscio d'uovo e da una barriera di permeabilità^7,la loro rimozione è una delle principali procedure di questo metodo. Mentre questo metodo di isolamento del blastomere consente la ricostituzione del contatto cellulare in modo semplificato, non consente l'eliminazione di segnali indesiderati; il contatto cellulare pone ancora segnali sia meccanici (ad esempio adadimento) che chimici, limitando così la nostra capacità di analizzare completamente la relazione causale tra il segnale e il comportamento cellulare.

Il metodo presentato in questo documento utilizza perline di polistirolo modificate carboxylate che possono legarsi covalentmente a qualsiasi molecola ammine-reattiva, comprese le proteine come ligandi. In particolare, abbiamo usato una forma ammine-reattiva di Rhodamine Red-X come ligando per rendere le perline tracciabili visivamente e adesivo alla cellula. I gruppi carboxyl di superficie di perline e gruppi di ammina primaria di molecola ligando sono accoppiati da carbodiimide solubile in acqua 1-ethyl-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimide (EDAC)^8,9. Perline adesive ottenute consentono gli effetti del segnale meccanico sulla dinamica cellulare¹⁰. Abbiamo usato questa tecnica per identificare i segnali meccanici necessari per l'orientamento della divisione cellulare¹⁰.

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Protocollo

1. Preparazione del tallone adesivo in polistirolo

NOTA: questo protocollo non richiede una tecnica asettica.

1. Pesare 10 mg di carboxylate modificato perline di polistirolo in un tubo di microcentrifuga 1,5 mL.
2. Per lavare le perline, aggiungere 1 mL di 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) tampone nel tubo. Poiché il buffer MES non contiene fosfato e acetato, che può ridurre la reattività del carbodiimide, è adatto all'uso nella reazione di accoppiamento delle proteine. Vorticare il tubo per mescolare le perline.
3. Girare il tubo per 60 s a 2.000 x g attraverso una centrifuga panca.
4. Scartare il supernatante pipettando con attenzione il buffer.
5. Lavare nuovamente le perline con 1 mL di buffer MES seguendo i passaggi 1.2-1.4.
6. Aggiungere 1 mL di buffer MES contenente 10 mg di EDAC nel tubo per attivare i gruppi carboxyl di superficie. Vorticare il tubo per mescolare le perline.
7. Ruotare e incubare il tubo per 15 min a temperatura ambiente.
8. Girare verso il basso le perline per 60 s a 2.000 x g.
9. Scartare il supernatante pipettando con attenzione il buffer.
10. Per lavare le perline, aggiungere 1 mL di fosfato tamponato salina (PBS) nel tubo. Vorticare il tubo per mescolare le perline.
11. Girare verso il basso il tubo per 60 s a 2.000 x g.
12. Scartare il supernatante pipettando con attenzione il buffer.
13. Lavare nuovamente le perline con 1 mL di PBS seguendo i passaggi 1.10-1.12.
14. La concentrazione finale di Rhodamine utilizzata dipenderà dalla deformazione che viene imageta. Preparare 1 mL di serie di diluizione di Rhodamine Red-X da 0,65 mM.
15. Pipette 20 -L di perline in ogni tubo di diluizione seriale.
16. Ruotare e incubare il tubo per 5 min a temperatura ambiente.
17. Lavare le perline due volte con 1 mL di PBS ripetendo i passaggi 1.10-1.12.
18. Aggiungere 1 mL di PBS nel tubo e conservarlo a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 settimane. Controllare l'intensità di fluorescenza delle perline al microscopio utilizzato per l'imaging dal vivo. L'adeguata concentrazione del Succinimidyl ester Rhodamine Red-X dipende dalle condizioni di imaging (Figura 1).
    NOTA: Le perline senza il trattamento Rhodamine Red-X non aderiscono alla cellula. Rhodamine Red-X serve come marcatore di fluorescenza così come molecola adesiva. L'interazione elettrostatica tra La Rhodamine Red-X caricata positivamente e la membrana plasmatica caricata negativamente è una causa putativa di adesione.

2. Assemblaggio della pipetta della bocca

1. Tagliare i tubi Tygon larghi (6,35 mm di diametro interno) e stretti (3,175 mm di diametro interno) a circa 25 cm e 40 cm di lunghezza, rispettivamente (Figura 2).
2. Collegare i tubi Tygon con un filtro in politetrafluoroetilene (PTFE) (dimensione dei pori 0,2 m) (Figura 2).
3. Smontare un tubo aspirante disponibile in commercio e attaccare il suo supporto capillare e il boccaglio alla fine dei tubi Tygon stretti e larghi, rispettivamente (Figura 2).
   NOTA: il filtro PTFE è stato utilizzato per prevenire l'inalazione di fumi di soluzione ipoclorosa tramite la pipetta bocca.

3. Isolamento del blastomere embrionale

NOTA: Indossare guanti e camice da laboratorio per evitare il taglio e il contatto con la soluzione di sbiancamento.

1. Tenere ogni estremità di un microcapillare (capacità; 10 l) con la mano destra e sinistra.
2. Tirare il microcapillare verso entrambe le estremità per applicare la tensione e portare il centro del capillare su un bruciatore per fare due capillari tirati a mano (Figura 3A).
3. Tagliare le punte dei capillari tirati a mano con pinze al microscopio dissetante e attaccare il capillare tirato in un apparato di pipettatura della bocca (Figura 2). Preparare due tipi di pipette. Le dimensioni di apertura della punta per le pipette devono essere approssimativamente 2x e 1 x la lunghezza dell'asse corto degli embrioni di C. elegans (30 m) per il trasferimento dell'embrione e la rimozione del guscio d'uovo, rispettivamente, Figura 3B-D.
4. Pipette 45 - L di soluzione di sale d'uovo su un pozzo di una diapositiva multiwell(Figura 4A; inferiore).
5. Mettere 5-10 C. elegan adulti su una soluzione di sale uovo contenente.
6. Per ottenere i primi embrioni di C. elegans, tagliare gli adulti a pezzi posizionando due aghi a destra ea sinistra del corpo di C. elegans e facendo scorrere gli aghi l'uno oltre l'altro(Figura 4A; schemi superiori).
7. Pipette 45 - L di soluzione ipoclorite su un pozzo accanto alla soluzione di sale d'uovo ben contenente (Figura 4B).
8. Pipette 45 - L del mezzo di crescita di Shelton sui successivi tre pozzi accanto alla soluzione di ipocloresi (Figura 4B).
9. Trasferire gli embrioni dello stadio a 1 cellula e dei primi 2 stadi nella soluzione dell'ipoclorito con il tubo a bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni (Figura 4B).
10. Attendere 40-55 s.
11. Lavare gli embrioni trasferendo gli embrioni dalla soluzione di ipoclorito nel mezzo di crescita di Shelton con la pipistrelli a bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni (Figura 4B).
12. Lavare nuovamente gli embrioni trasferendo gli embrioni in un nuovo pozzo del mezzo di crescita di Shelton con il tubo a bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni (Figura 4B).
13. Trasferire gli embrioni lavati in un nuovo pozzo del mezzo di crescita di Shelton con il pipeting a bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento dell'embrione. Utilizzando il capillare disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo, ripetere attentamente la pipettatura (Figura 4C; schemi medi). Se il guscio d'uovo viene rimosso con successo, le cellule embrionali diventeranno più sferiche(Figura 4C; a destra).
14. Separare i blastomeri embrionali dello stadio a 2 celle con pipettando delicatamente e continuamente con il capillare disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo (Figura 4D).

4. Ricostituzione dei modelli di contatto con blastomere e perline

NOTA: Lavorare al microscopio di imaging per evitare la dissociazione di una cellula da un tallone e per facilitare l'acquisizione tempestiva dell'immagine.

1. Per osservare con un microscopio invertito, preparare una camera di imaging come nella Figura 5.
   1. Posizionare un coperchio su un supporto copricapista (Figura 5A).
   2. Nastro i bordi del coperchio per stabilizzarlo. Il lato con nastro è il lato 'posteriore' (Figura 5A,B).
   3. Capovolgere il supporto coverslip sul lato 'front' e disegnare un cerchio sulla coverslip con una penna idrofobica (Figura 5C).
      NOTA: Qualsiasi piatto con fondo di vetro funziona anche, a condizione che gli embrioni siano manipolati dalla pipetta della bocca.
2. Aggiungete il mezzo di crescita di Shelton all'interno del cerchio disegnato dal marcatore idrofobico (Figura 5D).
3. Trasferire il blastomere isolato nella camera di imaging.
4. Distribuisci un piccolo volume delle perline chimicamente funzionalizzate usando il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni.
5. Controlla la posizione delle perline di polistirolo soffiando nel capillare disegnato a mano fino a quando il tallone non si attacca al blastomere isolato.
6. Montare un coperchio per evitare l'evaporazione del supporto (Figura 5E). Eseguire l'imaging dal vivo.

5. Preparazione di reagenti importanti

1. Soluzione di sale d'uovo (10 mL): Unire 235 luna di 5 M NaCl e 240 L di 2 M KCl con 9525 L di dH₂O.
2. Soluzione ipoclorotorite (10 mL): Combinare 7,5 mL di Clorox (contenente circa 7,5% di ipoclorito di sodio) con 2,5 mL di 10 N OH (la concentrazione finale di ipoclore di sodio è di circa il 5,625%).
   NOTA: Anche se molti metodi pubblicati hanno usato la chitinasi per digerire i gusci d'uovo chitinosi, abbiamo adottato un metodo utilizzando la soluzione ipoclotorite¹¹. Evitando le variazioni batch-to-batch delle attività di chitinasi, riteniamo che questo metodo sia un approccio più riproducibile ed economico.
3. Soluzione Inulin da 0,81 mM (40 mL)
   1. Aggiungere 0,2 g di Inulin a 40 mL di dH₂O.
   2. Autoclave per sciogliere.
      NOTA: Mantiene per 1 mese a 4 gradi centigradi.
4. 0,5 M Buffer MES (500 mL)
   1. Sciogliere 48,81 g di MES in 400 mL di acqua distillata (dH₂O).
   2. Regolare pH a 6.0.
   3. Portare il volume totale a 500 mL con dH₂O.
5. Soluzione PBS (1 L)
   1. Per creare una soluzione PBS a 10 pieghe, sciogliere 1 pacchetto di polvere di premiscela PBS in 1 L di dH₂O.
   2. Combina 100 mL di soluzione PBS da 10 volte con 900 mL di dH₂O.
6. Soluzione Polivinylpyrrolidone (PVP) (4 mL)
   1. In condizioni sterili, sciogliere 0,2 g di PVP in 4 mL di Drosophila Schneider's Medium.
      NOTA: Aprire sempre lo stock Medium di Schneider nel cofano di coltura dei tessuti (TC). Mantenere per 1 mese a 4 gradi centigradi.
7. Soluzione stock Rhodamine Red-X da 0,65 mM (2 mL)
   1. Pesare 1 mg di Rhodamine Red-X.
   2. Aggiungere 2 mL di zolfo dimetilo (DMSO) per sciogliere.
   3. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
8. Shelton's Growth Medium (SGM) (10,25 mL)
   1. In condizioni sterili, unire 8 mL di Drosophila Schneider's Medium, 1 mL di soluzione PVP, 1 mL di soluzione Inulin, 1 mL di Vitamine Basal Medium Eagle (BME), 50L di Penicillina-Streptomycin, e 100 l di Lipid concentrato insieme.
   2. Aliquota 325 L di SGM in microtubi da 1,5 mL.
      NOTA: Conservare per circa 1 mese a 4 gradi centigradi.
   3. Il giorno dell'isolamento del blastomer, aggiungere 175 loffele di siero bovino fetale (FBS) alla SGM (per un volume totale di 500 .
      NOTA: Conservare l'FBS a -20 gradi centigradi e scongelarlo prima dell'uso. FBS non ha bisogno di essere il calore ucciso.

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Risultati

Per la preparazione delle perline, abbiamo determinato la quantità ottimale di Rhodamine Red-X succinimidyl ester per la deformazione transgenica che esprime GFP-myosin II e mCherry-histone (Figura 1A-D). Abbiamo usato mCherry etichettato istono come marcatore della progressione del ciclo cellulare. Poiché sia Rhodamine Red-X che mCherry saranno illuminati da un laser da 561 nm, l'intensità ottimale del segnale Rhodamine Red-X è paragonabile a quella dell'istone per cons...

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Discussione

La ricostituzione dei modelli di contatto cellulare semplificati consentirà ai ricercatori di testare i ruoli di specifici modelli di contatto cellulare in diversi aspetti della morfogenesi. Abbiamo usato questa tecnica per dimostrare che l'asse di divisione cellulare è controllato dal contatto fisico con perline adesive¹⁰. Poiché la specifica dell'asse di divisione è fondamentale per lo sviluppo multicellulare contribuendo alla morfogenesi¹⁴, divisione delle cellule st...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride	Alfa Aesar	AAA1080703	For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	For the bead preparation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals)	Fisher BioReagents	BP300-100	For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder	Fisher BioReagents	BP665-1	For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer	Molecular Probes	R6160	For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.	Intelligent Imaging Innovation	N.A.	For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.