Reconstitución in Vitro de patrones de contacto de células espaciales con Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres aislados y perlas de poliestireno adhesivo

Resumen

Las complejidades tisulares de los sistemas multicelulares confunden la identificación de la relación causal entre las señales extracelulares y los comportamientos celulares individuales. Aquí, presentamos un método para estudiar el vínculo directo entre las señales dependientes del contacto y los ejes de división utilizando los blastómeros embrionarios de C. elegans y las perlas adhesivas de poliestireno.

Resumen

En los sistemas multicelulares, las células individuales están rodeadas por las diversas señales físicas y químicas procedentes de las células vecinas y el medio ambiente. Esta complejidad tisular confunde la identificación de la relación causal entre las señales extrínsicas y la dinámica celular. Un sistema multicelular reconstituido sintéticamente supera este problema al permitir a los investigadores probar una señal específica mientras elimina a otros. Aquí, presentamos un método para reconstituir patrones de contacto celular con caenorhabditis elegans blastomere aislado y perlas adhesivas de poliestireno. Los procedimientos implican la eliminación de cáscara de huevo, el aislamiento de blastomero al interrumpir la adhesión celular, la preparación de perlas adhesivas de poliestireno y la reconstitución del contacto de células celulares o de cuentas celulares. Por último, presentamos la aplicación de este método para investigar la orientación de los ejes de división celular que contribuye a la regulación del patrón celular espacial y la especificación del destino celular en el desarrollo de embriones. Este método in vitro robusto, reproducible y versátil permite el estudio de las relaciones directas entre los patrones de contacto de células espaciales y las respuestas celulares.

Introducción

Durante el desarrollo multicelular, los comportamientos celulares (por ejemplo, el eje de división) de las células individuales se especifican mediante varias señales químicas y físicas. Entender cómo la célula individual interpreta esta información, y cómo regulan el ensamblaje multicelular como una propiedad emergente es uno de los objetivos finales de los estudios de morfogénesis. El organismo modelo C. elegans ha contribuido significativamente a la comprensión de la regulación a nivel celular de la morfogénesis como la polaridad celular^1,el patrón de división celular^1,la decisión del destino celular^2,y las regulaciones a escala de tejido como el cableado neuronal³ y la organogénesis^4,5. Aunque hay varias herramientas genéticas disponibles, los métodos de ingeniería de tejidos son limitados.

El método de ingeniería de tejidos más exitoso en el estudio C. elegans es el aislamiento clásico de blastomero⁶; como c. elegans embrión está rodeado por una cáscara de huevo y una barrera de permeabilidad⁷, su eliminación es uno de los principales procedimientos de este método. Si bien este método de aislamiento de blastomero permite la reconstitución del contacto de células celulares de una manera simplificada, no permite la eliminación de señales no deseadas; el contacto celular todavía plantea señales mecánicas (por ejemplo, adhesión) y químicas, lo que limita nuestra capacidad de analizar completamente la relación causal entre la señal y el comportamiento celular.

El método presentado en este artículo utiliza perlas de poliestireno modificadas de carboxilato que pueden unirse covalentemente a cualquier molécula reactiva de amina, incluidas las proteínas como ligandos. Particularmente, utilizamos una forma reactiva de amina de Rhodamine Red-X como ligando para hacer cuentas tanto visualmente rastreables como adhesivas a la célula. Los grupos carboxilo de superficie de cordón y grupos primarios de amina de molécula de ligando están acoplados por carbodiimida soluble en agua 1-etil-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimida (EDAC)^8,9. Las perlas adhesivas obtenidas permiten los efectos de la señal mecánica en la dinámica celular¹⁰. Hemos utilizado esta técnica para identificar las señales mecánicas necesarias para la orientación de división celular^10.

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Protocolo

1. Preparación de perlas adhesivas de poliestireno

NOTA: Este protocolo no requiere técnica aséptica.

1. Pesar 10 mg de perlas de poliestireno modificadas de carboxilato en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Para lavar las perlas, agregue 1 ml de tampón de ácido etanosulfónico (MES) de 2-(N-morpholino) en el tubo. Dado que el tampón MES no contiene fosfato ni acetato, lo que puede reducir la reactividad de carbodiimida, es adecuado para su uso en la reacción de acoplamiento de proteínas. Vortex el tubo para mezclar las perlas.
3. Gire el tubo durante 60 s a 2.000 x g a través de una centrífuga de sobremesa.
4. Deseche el sobrenadante pipeteando cuidadosamente el búfer.
5. Lave las perlas de nuevo con 1 ml de búfer MES siguiendo los pasos 1.2-1.4.
6. Añadir 1 ml de tampón MES que contenga 10 mg de EDAC en el tubo para activar los grupos carboxilos de superficie. Vortex el tubo para mezclar las perlas.
7. Gire e incubar el tubo durante 15 minutos a temperatura ambiente.
8. Gire las perlas durante 60 s a 2.000 x g.
9. Deseche el sobrenadante pipeteando cuidadosamente el búfer.
10. Para lavar las perlas, agregue 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) en el tubo. Vortex el tubo para mezclar las perlas.
11. Gire por el tubo durante 60 s a 2.000 x g.
12. Deseche el sobrenadante pipeteando cuidadosamente el búfer.
13. Lave las perlas de nuevo con 1 ml de PBS siguiendo los pasos 1.10-1.12.
14. La concentración final de Rhodamine utilizado dependerá de la cepa que se está haciendo de la imagen. Prepare 1 ml de las series de dilución de 1, 10, 100 y 1000 de Rhodamine Red-X de la solución de stock de 0,65 mM Rhodamine Red-X.
15. Pipetear 20 l de perlas en cada tubo de dilución en serie.
16. Gire e incubar el tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente.
17. Lave las perlas dos veces con 1 ml de PBS repitiendo los pasos 1.10-1.12.
18. Añadir 1 ml de PBS en el tubo y almacenarlo a 4 oC durante un máximo de 6 semanas. Compruebe la intensidad de la fluorescencia de las perlas bajo un microscopio utilizado para imágenes en vivo. La concentración adecuada del éster de succinimidil Rhodamine Red-X depende de las condiciones de imagen (Figura 1).
    NOTA: Las perlas sin tratamiento con Rhodamine Red-X no se adhieren a las células. Rhodamine Red-X sirve como marcador de fluorescencia, así como molécula adhesiva. La interacción electroestática entre Rhodamine Red-X cargada positivamente y la membrana plasmática cargada negativamente es una causa putativa de adhesión.

2. Montaje de pipeta bucal

1. Corte los tubos Tygon anchos (6,35 mm de diámetro interior) y estrechos (3.175 mm de diámetro interior) a unos 25 cm y 40 cm de longitud, respectivamente(Figura 2).
2. Conecte los tubos Tygon con un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) (tamaño de los poros de 0,2 m)(Figura 2).
3. Desmontar un tubo aspirador disponible comercialmente y fijar su soporte capilar y boquilla al extremo de los tubos Tygon estrechos y anchos, respectivamente(Figura 2).
   NOTA: Se utilizó un filtro de PTFE para evitar la inhalación de humos de solución de hipoclorito a través de pipeta bucal.

3. Aislamiento de blastomero embrionario

NOTA: Use guantes y bata de laboratorio para evitar el corte y el contacto con la solución de blanqueo.

1. Sostenga cada extremo de un microcapilar (capacidad; 10 l) con la mano derecha e izquierda.
2. Tire del microcapilar hacia ambos extremos para aplicar tensión y llevar el centro del capilar sobre un quemador para hacer dos capilares tirados a mano(Figura 3A).
3. Recortar las puntas de los capilares tirados a mano con fórceps bajo el microscopio de disección y unir el capilar tirado en un aparato de pipeteo de la boca(Figura 2). Prepare dos tipos de pipetas. Los tamaños de apertura de la punta para las pipetas deben ser aproximadamente 2x y 1x la longitud corta del eje de los embriones C. elegans (30 m) para la transferencia de embriones y la eliminación de cáscara de huevo, respectivamente la Figura 3B-D).
4. Pipetear 45 l de solución de sal de huevo sobre un pozo de una diapositiva multipozo(Figura 4A;parte inferior).
5. Coloque 5-10 C. elegans adultos en un pozo que contenga solución de sal de huevo.
6. Para obtener los embriones C. elegans tempranos, corte a los adultos en pedazos colocando dos agujas a la derecha y a la izquierda del cuerpo de C. elegans y deslizando las agujas unas demás(Figura 4A;esquemas superiores).
7. Pipetear 45 l de solución de hipoclorito en un pozo junto al pozo que contiene solución de sal de huevo(Figura 4B).
8. Pipetear 45 l del medio de crecimiento de Shelton en los tres pozos siguientes junto al pozo que contiene la solución de hipoclorito(Figura 4B).
9. Transferir embriones de etapa de 1 célula y de etapa temprana de 2 células a la solución de hipoclorito por la boca pipeteando con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones(Figura 4B).
10. Espere de 40 a 55 s.
11. Lavar los embriones transfiriendo los embriones de la solución de hipoclorito al medio de crecimiento de Shelton por vía oral pipeteando con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones(Figura 4B).
12. Lavar los embriones de nuevo transfiriendo los embriones a un nuevo pozo del medio de crecimiento de Shelton por vía oral pipeteando con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones(Figura 4B).
13. Transfiera los embriones lavados a un nuevo pozo del medio de crecimiento de Shelton por vía oral pipeteando con el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones. Usando el capilar dibujado a mano para la eliminación de cáscara de huevo, repita cuidadosamente el pipeteo(Figura 4C;esquemas medios). Si la cáscara de huevo se elimina con éxito, las células embrionarias se volverán más esféricas(Figura 4C; derecha).
14. Separe los blastómeros embrionarios en etapa de 2 células pipeteando suavemente y continuamente con el capilar dibujado a mano para la eliminación de cáscara de huevo(Figura 4D).

4. Reconstitución de patrones de contacto con blastomero y perla

NOTA: Trabaje bajo el microscopio de imágenes para evitar la disociación de una célula de un cordón y para facilitar la adquisición oportuna de la imagen.

1. Para observar con un microscopio invertido, prepare una cámara de imágenes como en la Figura 5.
   1. Coloque un cubreobjetos en un soporte de cubreobjetos(Figura 5A).
   2. Pegue los bordes de la cubierta para estabilizarlo. El lado con cinta es el lado posterior(Figura 5A,B).
   3. Voltee el soporte de cubreobjetos hacia el lado "delantero" y dibuje un círculo en el cubreobjetos con una pluma hidrófoba(Figura 5C).
      NOTA: Cualquier plato con fondo de vidrio también funciona, siempre que los embriones sean manipulables por la pipeta de la boca.
2. Añadir el medio de crecimiento de Shelton dentro del círculo dibujado por el marcador hidrófobo(Figura 5D).
3. Transfiera el blastomero aislado a la cámara de imágenes.
4. Dispensar un pequeño volumen de las perlas químicamente funcionalizadas utilizando el capilar dibujado a mano para la transferencia de embriones.
5. Controle la posición de las perlas de poliestireno soplando en el capilar dibujado a mano hasta que el cordón se adhiera al blastomero aislado.
6. Montar una cubierta para evitar la evaporación del medio(Figura 5E). Realice imágenes en vivo.

5. Preparación de reactivos importantes

1. Solución de sal de huevo (10 ml): Combinar 235 ml de 5 M de NaCl y 240 ml de 2 M KCl con 9525 ml de dH₂O.
2. Solución de hipoclorito (10 ml): Combinar 7,5 ml de Clorox (que contiene aproximadamente 7,5% de hipoclorito sódico) con 2,5 ml de 10 N NaOH (la concentración final de hipoclorito sódico es aproximadamente del 5,625%).
   NOTA: Aunque muchos métodos publicados han utilizado la chitinasa para digerir cáscaras de huevo chitinas, hemos adoptado un método utilizando la solución de hipoclorito¹¹. Al evitar las variaciones de lote a lote de las actividades de chitinasa, creemos que este método es un enfoque más reproducible y rentable.
3. 0,81 mM Solución de inulina (40 mL)
   1. Añadir 0,2 g de inulina a 40 ml de dH₂O.
   2. Autoclave para disolver.
      NOTA: Se mantiene durante 1 mes a 4 oC.
4. Búfer MES de 0,5 M (500 ml)
   1. Disolver 48,81 g de EMO en 400 ml de agua destilada (dH₂O).
   2. Ajuste el pH a 6.0.
   3. Lleve el volumen total a 500 ml con dH₂O.
5. Solución PBS (1 L)
   1. Para hacer una solución de PBS de 10 veces, disuelva 1 paquete de polvo de premezcla de PBS en 1 L de dH₂O.
   2. Combine 100 ml de solución PBS de 10 veces con 900 ml de dH₂O.
6. 5% Solución de polivinilpirrolidona (PVP) (4 ml)
   1. En condiciones estériles, disolver 0,2 g de PVP en 4 ml del medio de Drosophila Schneider.
      NOTA: Abra siempre la culata media de Schneider en la capucha de cultivo de tejidos (TC). Mantener durante 1 mes a 4oC.
7. 0,65 mM Rhodamine Red-X solución en stock (2 mL)
   1. Pesar 1 mg de Rhodamine Red-X.
   2. Añadir 2 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) para disolver.
   3. Aliquot y almacenar a -20oC.
8. Medio de Crecimiento de Shelton (SGM) (10,25 mL)
   1. En condiciones estériles, combine 8 ml de medio de Drosophila Schneider, 1 ml de solución de PVP, 1 ml de solución de inulina, 1 ml de vitaminas del águila basal (BME), 50 ml de penicilina-estreptomicina y 100 ml de concentrado de lípidos en conjunto.
   2. Alícuota 325 l de SGM en microtubos de 1,5 ml.
      NOTA: Mantener durante aproximadamente 1 mes a 4 oC.
   3. El día del aislamiento de blastomeros, añadir 175 ml de suero bovino fetal (FBS) al SGM (para un volumen total de 500 l).
      NOTA: Almacene FBS a -20 oC y desconédalo antes de usarlo. FBS no necesita ser asesinado por calor.

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Resultados

Para la preparación de perlas, determinamos la cantidad óptima de éster de succinimidil Rhodamine Red-X para la cepa transgénica que expresa GFP-miosina II y mCherry-histone(Figura 1A-D). Usamos mCherry etiquetó la histona como un marcador de progresión del ciclo celular. Debido a que tanto Rhodamine Red-X y mCherry serán iluminados por un láser de 561 nm, la intensidad óptima de la señal De Rhodamine Red-X es comparable a la de la histona para permitir la toma sim...

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Discusión

La reconstitución de patrones de contacto celular simplificados permitirá a los investigadores probar las funciones de patrones de contacto celular específicos en diferentes aspectos de la morfogénesis. Hemos utilizado esta técnica para demostrar que el eje de división celular está controlado por el contacto físico con cuentas adhesivas^10. Como especificación del eje de división es crucial para el desarrollo multicelular al contribuir a la morfogénesis^14,divisió...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride	Alfa Aesar	AAA1080703	For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	For the bead preparation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals)	Fisher BioReagents	BP300-100	For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder	Fisher BioReagents	BP665-1	For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer	Molecular Probes	R6160	For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.	Intelligent Imaging Innovation	N.A.	For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.