JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Тканевые сложности многоклеточных систем смужает выявление причинно-следственной связи между внеклеточными сигналами и индивидуальным клеточным поведением. Здесь мы представляем метод изучения прямой связи между контактно-зависимыми сигналами и осями деления с помощью c. elegans эмбриона бластомеры и клея полистирола.

Аннотация

В многоклеточных системах отдельные клетки окружены различными физическими и химическими сигналами, поступающими из соседних клеток и окружающей среды. Эта сложность тканей смужает выявление причинно-следственной связи между наличностью и клеточной динамикой. Синтетически восстановленная многоклеточная система преодолевает эту проблему, позволяя исследователям тестировать на определенный сигнал, устраняя при этом других. Здесь мы представляем метод восстановления клеточных контактных моделей с изолированными Caenorhabditis elegans blastomere и клеевыми бусинами из полистирола. Процедуры включают удаление яичной скорлупы, изоляцию бластомеров, нарушая сцепление клеток, приготовление клейких бусинов, и восстановление контакта клеток или клеточного бисера. Наконец, мы представляем применение этого метода для исследования ориентации клеточного деления осей, что способствует регуляции пространственного клеточного шаблона и спецификации судьбы клеток в развивающихся эмбрионах. Этот надежный, воспроизводимый и универсальный метод in vitro позволяет изучать прямые связи между структурами контакта пространственных клеток и клеточными реакциями.

Введение

Во время многоклеточного развития клеточное поведение (например, ось деления) отдельных клеток определяется различными химическими и физическими сигналами. Чтобы понять, как отдельные клетки интерпретирует эту информацию, и как они регулируют многоклеточной сборки как возникающие свойства является одной из конечных целей морфогенеза исследований. Модель организма C. elegans внесла значительный вклад в понимание клеточного уровня регулирования морфогенеза, таких как клеточная полярность1, клеточное деление узор1, решение судьбы клеток2, и ткани масштаба правил, таких как нейрональная проводка3 и органогенез4,5. Хотя существуют различные генетические инструменты, методы тканевой инженерии ограничены.

Наиболее успешным методом тканевой инженерии в исследовании C. elegans является классическая лапомерная изоляция6; так как эмбрион C. elegans окружен яичной скорлупой и барьером проницаемости7,их удаление является одной из основных процедур этого метода. Хотя этот метод изоляции бластомеров позволяет восстановить контакт клеток в упрощенном порядке, он не позволяет устранить нежелательные сигналы; контакт клеток по-прежнему представляет собой как механические (например, сливки), так и химические сигналы, тем самым ограничивая нашу способность полностью анализировать причинно-следственную связь между кием и клеточным поведением.

Метод, представленный в этой работе, использует карбоксилат модифицированные полистиролные бусы, которые могут ковалентно связываться с любыми амино-реактивными молекулами, включая белки в виде лигандов. В частности, мы использовали амин-реактивную форму родамин Red-X в качестве лигана, чтобы сделать бисер как визуально отслеживаемый и клей к клетке. Карбоксильные группы поверхности бисера и первичные группы амина молекулы лиганд соединены водорастворимым карбодиамидом 1-этил-3-(диметиламинопропил) карбодиамидом (EDAC)8,9. Полученные клеевые бусы позволяют эффекты механического сигнала на клеточной динамике10. Мы использовали этот метод для определения механических сигналов, необходимых для ориентации деления клеток10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Приготовление клейкой полистирора

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не требует асептической техники.

  1. Взвесьте 10 мг карбоксилата модифицированных полистирола в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки.
  2. Для мытья бисера добавьте 1 мл 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) буфера в трубку. Поскольку буфер МЧС не содержит фосфатов и ацетата, которые могут снизить реактивность карбодиимида, он подходит для использования в реакции сцепления белков. Вихрь трубки, чтобы смешать бисер.
  3. Спин трубки для 60 с на 2000 х г через скамейке центрифуги.
  4. Откажитесь от супернатанта, тщательно выкладывая буфер.
  5. Снова вымойте бисер 1 мл буфера МЧС, выдвив на шаг 1.2-1.4.
  6. Добавьте 1 мл буфера МЧС, содержащего 10 мг EDAC, в трубку, чтобы активировать поверхностные группы карбоксила. Вихрь трубки, чтобы смешать бисер.
  7. Поверните и инкубировать трубку в течение 15 минут при комнатной температуре.
  8. Спин вниз бисера для 60 с на 2000 х г.
  9. Откажитесь от супернатанта, тщательно выкладывая буфер.
  10. Для мытья бисера добавьте 1 мл фосфатного буферного солья (PBS) в трубку. Вихрь трубки, чтобы смешать бисер.
  11. Спин вниз трубки для 60 с на 2000 х г.
  12. Откажитесь от супернатанта, тщательно выкладывая буфер.
  13. Снова вымойте бисер 1 мл PBS, выдвивая следующие шаги 1.10-1.12.
  14. Окончательная концентрация родамина используется будет зависеть от штамма, образуемого. Приготовьте 1 мл 1-, 10-, 100- и 1000-кратной раз разбавления серии родамин Красный X из 0,65 мм родамин Red-X фондового раствора.
  15. Пипетка 20 л бусин в каждую серийную продавить трубку.
  16. Поверните и инкубировать трубку в течение 5 минут при комнатной температуре.
  17. Вымойте бисер дважды 1 мл PBS, повторяя шаги 1.10-1.12.
  18. Добавьте 1 мл PBS в трубку и храните ее при 4 градусах По Цельсию в течение 6 недель. Проверьте интенсивность флуоресценции бисера под микроскопом, используемым для живой визуализации. Соответствующая концентрация родамин красно-X succinimidyl эфир зависит от условий изображения(Рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бусы без лечения родамин красно-X не прилипают к клетке. Родамин Red-X служит маркером флуоресценции, а также клейкой молекулы. Электростатическое взаимодействие между положительно заряженным родамином Red-X и отрицательно заряженной плазменной мембраной является податливой причиной спайки.

2. Сборка устья пипетки

  1. Вырезать широкий (6,35 мм внутреннего диаметра) и узкие (3,175 мм внутреннего диаметра) Тайгон труб около 25 см и 40 см в длину, соответственно (Рисунок 2).
  2. Соедините трубки Tygon с фильтром политетрафторэтилена (PTFE) (размер поры 0,2 мкм)(рисунок 2).
  3. Разберите коммерчески доступную трубку аспиратора и прикрепите ее капиллярный держатель и мундштук к концу узких и широких труб Тайгона, соответственно(рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: PTFE фильтр был использован для предотвращения вдыхания паров гипохлоритного раствора через рот пипетки.

3. Изоляция эмбриона бластомер

ПРИМЕЧАНИЕ: Носите перчатки и лабораторное пальто, чтобы избежать разреза и контакта с раствором отбеливания.

  1. Держите каждый конец микрокапилляра (емкость; 10 л) правой и левой рукой.
  2. Потяните микрокапилляр к обоим концам, чтобы применить напряжение и принести центр капилляра над горелкой, чтобы сделать два ручной вытягивания капилляров(Рисунок 3A).
  3. Обрезать кончики ручных капилляров щипцами под рассекающим сядр и прикрепите вытянутый капилляр в ротовой аппарат(рисунок 2). Подготовьте два типа пипетков. Размеры наконечника для пипетки должны быть примерно в 2 раза и 1x короткая длина оси C. elegans эмбрионов (30 мкм) для переноса эмбриона и удаления яичной скорлупы, соответственно Рисунок 3B-D).
  4. Пипетка 45 л раствора яичной соли на скважину многовелл-слайда(рисунок 4A;дно).
  5. Поместите 5-10 взрослых C. elegans на хорошо содержащий раствор яичной соли.
  6. Чтобы получить ранние эмбрионы C. elegans, разрежьте взрослых на куски, распомещая две иглы вправо и влево от тела C. elegans и сдвинув иглы мимо друг друга(рисунок 4A; верхняя схема).
  7. Пипетка 45 Л гипохлоритного раствора на скважину рядом с хорошо содержащим раствор яичной соли(рисунок 4В).
  8. Пипетка 45 л среды роста Шелтона на последующие три скважины рядом с хорошо содержащим гипохлоритный раствор(рисунок 4B).
  9. Передача 1-клеточной стадии и ранних 2-клеточных эмбрионов стадии в гипохлоритный раствор с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона(рисунок 4В).
  10. Подождите 40-55 с.
  11. Вымойте эмбрионы путем передачи эмбрионов из гипохлоритного раствора в среду роста Шелтона с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона(рисунок 4В).
  12. Вымойте эмбрионы снова путем передачи эмбрионов в новый колодец шелтона роста среды рот пипеттинг с рисованной капиллярдля для переноса эмбриона(Рисунок 4B).
  13. Перенесите вымытые эмбрионы в новый колодец среды роста Шелтона с помощью ротовой трубы с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона. Используя нарисованный вручную капилляр для удаления яичной скорлупы, тщательно повторите пипетку(рисунок 4C;средние схемы). Если яичная скорлупа будет успешно удалена, эмбриональные клетки станут более сферическими(рисунок 4C;справа).
  14. Отделить 2-клеточный этап эмбриональных бластомеров мягко и непрерывно pipetting с рисованной капиллярдля для удаления яичной скорлупы (Рисунок 4D).

4. Восстановление контактных моделей с бластомером и бисором

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа под микроскопом изображения, чтобы избежать диссоциации клетки от биса и для облегчения своевременного приобретения изображения.

  1. Для наблюдения с помощью перевернутого микроскопа подготовьте камеру изображения, как на рисунке 5.
    1. Поместите крышку на держатель для обкрытии(рисунок 5A).
    2. Лента края крышки, чтобы стабилизировать его. Сторона с лентой является "назад" стороны(рисунок 5A,B).
    3. Переверните держатель крышки к стороне 'передней' и нарисуйте круг на крышке с гидрофобной ручкой(рисунок 5C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое стеклянное дно блюдо также работает, при условии, эмбрионы манипулируют рот пипетка.
  2. Добавить среды роста Шелтона в круге обращается гидрофобный маркер(Рисунок 5D).
  3. Перенесите изолированные бластомеры в камеру изображения.
  4. Распределите небольшой объем химически функционированных бусин с использованием нарисованного от руки капилляра для переноса эмбриона.
  5. Контролируйте положение полистирола, дуя в нарисованный от руки капилляр до тех пор, пока шарик не прикрепится к изолированному бластомере.
  6. Установите крышку, чтобы избежать испарения среды(рисунок 5E). Выполните живую визуализацию.

5. Подготовка важных реагентов

  1. Раствор яйцеклетки соль (10 мл): Смешайте 235 л из 5 M NaCl и 240 л из 2 M KCl с 9525 л dH2O.
  2. Гипохлоритный раствор (10 мл): Смешайте 7,5 мл clorox (содержащий примерно 7,5% гипохлорит натрия) с 2,5 мл 10 N NaOH (окончательная концентрация гипохлорит натрия составляет примерно 5,625%).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя многие опубликованные методы использовали хитиназа для переваривания хитинозных яичной скорлупы, мы приняли метод с использованием гипохлоритного раствора11. Избегая пакетных вариаций хитиназа, мы считаем, что этот метод является более воспроизводимым и рентабельным.
  3. Раствор инулина 0,81 м/м (40 мл)
    1. Добавьте 0,2 г инулина до 40 мл дН2О.
    2. Автоклав для растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняет в течение 1 месяца при 4 градусах Цельсия.
  4. Буфер МЧС 0,5 м (500 мл)
    1. Растворите 48,81 г МЧС в 400 мл дистиллированной воды (дН2О).
    2. Отрегулируйте рН до 6.0.
    3. Довести общий объем до 500 мл с dH2O.
  5. Решение PBS (1 л)
    1. Чтобы сделать 10-кратный раствор PBS, растворите 1 пакет порошка premix PBS в 1 l dH2O.
    2. Объедините 100 мл 10-кратного раствора PBS с 900 мл dH2O.
  6. 5% Поливинилпирролидон (PVP) Решение (4 мл)
    1. При стерильных условиях растворите 0,2 г PVP в 4 мл медиума Дрозофилы Шнайдера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда открывайте средний запас Шнайдера в тканевой культуре (ТК) капюшоном. Хранить в течение 1 месяца при 4 градусах По Цельсию.
  7. Раствор запаса родамин Red-X 0,65 мм (2 мл)
    1. Взвесите 1 мг родамина Red-X.
    2. Добавьте 2 мл диметилсульфида (DMSO) для растворения.
    3. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
  8. Средний рост Шелтона (SGM) (10.25 мл)
    1. В стерильных условиях сочетайте в себе 8 мл медиума Дрозофилы Шнайдера, 1 мл раствора PVP, 1 мл раствора Инулина, 1 мл базальных средних орлов (BME) витаминов, 50 л пенициллина-стрептомицина и 100 мл липидного концентрата вместе.
    2. Aliquot 325 Л SGM в микротрубках 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить около 1 месяца при 4 градусах По Цельсию.
    3. В день изоляции бластомер добавьте 175 кЛ сыворотки плода (FBS) в SGM (общим объемом 500 л).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните FBS при -20 градусов и оттаивайте его перед использованием. FBS не нужно быть тепло убитым.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для приготовления бисера мы определили оптимальное количество родеамина Red-X succinimidyl ester для трансгенного штамма, выражающего GFP-миозин II и mCherry-histone(рисунок 1A-D). Мы использовали mCherry помечены гистон в качестве маркера прогрессии клеточного цикла. Поскольку и Рода?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Восстановление упрощенных моделей контакта клеток позволит исследователям проверить роли конкретных моделей контакта клеток в различных аспектах морфогенеза. Мы использовали этот метод, чтобы показать, что ось деления клеток контролируется физическим контактом с клеевыми шариками<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Мы благодарим Джеймса Присса и Брюса Бауэрмана за советы и предоставление штаммов C. elegans, Дона Мормана, Кота Мизумото и Института биологических наук Imaging Core Facility для совместного использования оборудования и реагентов, Аои Хироясу, Лизы Фернандо, Мина Джи Кима за содержание C. elegans и критическое чтение нашей рукописи. Наша работа поддерживается Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochlorideAlfa AesarAAA1080703For the bead preparation
Aspirator Tube AssemblyDrummond21-180-13For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-typeCaenorhabditis Genetics CenterN2Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37in houseKSG5Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µLDrummond21-180-13For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter)KISKER BiotechPPS-30.0COOHPFor the bead preparation
CD Lipid ConcentrateLife Technologies11905031For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
CloroxCloroxN. A.For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holderIn houseN.A.For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.Carl ZeissStemi 508For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada originGibcoA3160701For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gaugeBD14-826AAFor the blastomere isolation
InulinAlfa AesarAAA1842509For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)Gibco11120052For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals)Fisher BioReagentsBP300-100For the bead preparation
Multitest Slide 10 WellMP BiomedicalsICN6041805For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x PowderFisher BioReagentsBP665-1For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140148For the blastomere isolation.
PolyvinylpyrrolidoneFisher BioReagentsBP431-100For the blastomere isolation
Potassium ChlorideBioshopPOC888For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomerMolecular ProbesR6160For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile MediumGibco21720024For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium ChlorideBioshopSOD001For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 NFisher ChemicalSS255-1For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.Intelligent Imaging InnovationN.A.For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-SterileBasix13100115For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-862For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-854For the blastomere isolation.

Ссылки

  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624(2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены