基于阻抗的癌细胞迁移和入侵的实时测量

摘要

癌症是一种致命的疾病，由于其转移到不同器官的能力。确定癌细胞在各种治疗条件下迁移和入侵的能力对于评估治疗策略至关重要。该协议提供了一种评估胶质细胞瘤癌细胞系的实时转移能力的方法。

摘要

癌症产生是由于遗传不稳定、突变、环境和其他压力因素引起的细胞无节制。这些在复杂、多层分子信号网络中的异常导致异常细胞增殖和存活、细胞外基质退化和转移到远机关。据估计，大约90%的癌症相关死亡是由转移传播的直接或间接影响造成的。因此，建立一个高度可靠、全面的系统，以基因和环境操纵来描述癌细胞行为非常重要。这种系统可以清楚地理解癌症转移的分子调节，并有机会成功开发分层、精确的治疗策略。因此，准确确定癌细胞行为，如迁移和入侵与基因的增益或丧失功能，允许评估癌细胞的侵略性性质。基于细胞阻抗的实时测量系统使研究人员能够在整个实验中持续获取数据，并在各种实验条件下立即比较和量化结果。与传统方法不同，此方法不需要固定、染色和样品处理来分析迁移或入侵的细胞。本文着重介绍了胶质细胞瘤癌细胞迁移和入侵的实时测定过程。

引言

癌症是一种致命的疾病，由于其转移到不同器官的能力。确定癌症基因型和表型对于理解和设计有效的治疗策略至关重要。几十年的癌症研究已导致不同方法的发展和适应，以确定癌症基因型和表型。最新的技术发展之一是基于细胞阻抗对细胞迁移和入侵进行实时测量。细胞附着在基质和细胞接触中起着重要作用，细胞对细胞的沟通和组织调节、发育和维护。细胞粘附的异常导致细胞细胞接触丧失，细胞外基质（ECM）退化，细胞迁移和入侵能力的增强，所有这些都导致癌细胞转移到不同的器官^11，2。2各种方法可用于确定细胞迁移（伤口愈合和博伊登室测定）和入侵（马特里格尔-博伊登室测定）3，4，5。^3,4,5这些传统方法是半定量的，因为细胞需要在实验之前或之后用荧光染料或其他染料标记，以测量细胞表型。此外，在某些情况下，需要机械干扰来制造伤口，以测量细胞向伤口部位的迁移。此外，这些现有方法既耗时，且耗费人力，并且仅在一个时间点测量结果。此外，由于^{实验过程中处理}不一致，这些方法容易进行不准确的测量。

与传统方法不同，实时细胞分析系统可实时测量细胞阻抗，无需细胞预或后染色和机械损伤。更重要的是，实验的持续时间可以延长，以便生物效应能够以时间相关的方式确定。执行实验是时间效率高，而不是劳动密集型。分析数据相对简单准确。与其他方法相比，该方法是测量细胞迁移和入侵^{66、7、8、97,8,9}的最佳实时测量方法之一。

贾弗和基斯是第一个描述电极^表面10细胞群的阻抗测量的第一个。实时细胞分析系统的工作原理相同。每个微孔的面积大约 80% 覆盖着一系列黄金微电极。当电极表面区域由于细胞的粘附或扩散而被细胞占用时，电阻抗会发生变化。这种阻抗显示为细胞指数，它与穿透微孔膜（该膜的中位孔径为8^μm）11后覆盖电极表面积的细胞成正比。

Crk 和 CrkL 是含有 SH2 和 SH3 域的适应蛋白，在各种细胞功能中起着重要作用，如细胞骨架调节、细胞转化、增殖、粘附、上皮-梅辛位过渡、迁移、入侵和转移，通过调解许多信号通路¹1、12、13、14、15、16、17^15,16中的蛋白质-蛋白质^,12,13,14,相互作用^{，17, 18}.因此，确定癌细胞的Crk/CrkL依赖性迁移和侵入性能力非常重要。进行了实时细胞分析，以确定在Crk和CrkL基因敲除后胶质细胞细胞的迁移和侵入性能力。

本文描述了对人类胶质细胞细胞的Crk-和CrkL介导迁移和入侵的详细测量。

研究方案

注:所有细胞培养材料都需要无菌，整个实验必须在无菌条件下在生物安全柜中进行。

1. U-118MG 胶质细胞系的培养和电穿孔

1. 将U-118MG细胞系培养在含有Dulbecco改性鹰中（DMEM）（培养介质）的5%胎儿牛血清（FBS）中，并在含有5%CO₂培养箱（培养条件）的潮湿环境中保持在37°C。
2. 使用 70~ 80% 的汇合健康细胞进行电穿孔。
3. 对于收获细胞，用1x PBS清洗培养皿中生长的细胞，并加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。放入培养箱 30 s 中，取出胰蛋白酶-EDTA。将培养介质中的细胞收集到15 mL管中。
4. 使用手持式自动电池计数器对细胞进行计数，在 100 x g下对离心机进行 5 分钟，然后丢弃上清液。
5. 悬浮培养基中的细胞颗粒，将每个条件的600，000个细胞放入微离心管中。根据实验设计和生长速度调整细胞数。
6. 将细胞悬浮液转移到微离心管中，加入Dulbecco磷缓冲盐水（DPBS）的800μL。使用迷你离心机旋转 30 s 并丢弃上清液。
7. 在细胞颗粒中加入60μL的再悬浮缓冲液R，并将siRNA（即非靶向siRNA、Crk siRNA、CrkL siRNA或CrkL siRNA）的浓度在6μM的浓度中添加到各自的微离心管中。通过点击轻轻混合它们。
8. 电镀10 μL的电池，电镀系统为1，350 V，为10 ms与三个脉冲，并将电镀细胞转移到5 mL的培养介质。重复为每个情况准备的细胞的其余部分的电穿孔。
9. 完成所有相应的电穿孔。根据条件将电镀细胞转移到两个 35 mm 的菜肴中，并在培养条件下培养 3 天。
10. 第三天，在实际细胞阻抗测量前6小时处理含有DMEM（低血清中）的0.5%FBS中的所有电镀细胞。

2. 制备实时细胞分析系统、细胞入侵和迁移（CIM）板和电镀U-118MG电池进行电镀

1. 在实验开始前5-6小时将实时细胞分析系统置于CO₂培养箱中，以稳定系统到培养条件。
2. 对于入侵测定，在CIM板上腔的每个孔中，含有0.1 μg/μL的细胞外基质（ECM）凝胶的DMEM（普通介质）板50μL。为避免出现任何气泡，请使用反向移液方法。立即去除 30 μL ECM 凝胶，在井中留下 20 μL。
3. 在 ECM 凝胶涂层后，将板在培养条件下保持 4 小时，并盖上盖子。在 ECM 凝胶涂层和干燥过程中，采取预防措施，避免板上腔的电极与手、生物安全柜表面或 CO₂培养箱直接接触。
4. 要设置阻抗测量程序，请双击关联的软件图标（参见材料表）以打开系统软件应用程序（控制单元）。每个底座都有一个单独的窗口，具有不同的选项卡，用于设置实验条件、阻抗测量时间间隔和持续时间以及数据分析。
5. 在"布局"选项卡下，为每个生物条件设置四边形孔，并在"计划"选项卡下设置两步单元阻抗测量。第一步是进行一次性基线测量（一次扫描，间隔为 1 分钟），第二步是测量实际实验中各个底座中的细胞阻抗。对于迁移，在单独的底座中使用 145 次扫描间隔为 10 分钟，对于入侵，577 次扫描间隔为 10 分钟，单独设置）。
6. 在细胞阻抗测量开始之前一小时，在板下腔的孔中加入160 μL的DMEM，加入10%FBS作为化学吸引物。将装有 ECM 凝胶涂层井的上部腔或未涂布的井与下腔分别组装以测量入侵和迁移。
7. 将50μL的低血清介质填充上腔的井，并将其放入系统的底座中。单击"消息"选项卡，检查控制单元是否识别所有井。如果消息显示为"确定"，则底座中的板已准备好进行实验。
8. 在实时细胞分析系统底座进行测量之前，在培养条件下预孵化培养箱中完全包装的板，这对于包装板适应细胞培养条件至关重要。
9. 对于用低血清介质处理的收获细胞，尝试将细胞与步骤1.3一样，在低血清介质中收集，并将细胞计数为步骤1.4。
10. 计数后，在100 x g的离心机细胞5分钟，并丢弃上清。
11. 在800μL的低血清介质中重新悬浮800，000个细胞，用于迁移和入侵测定。此外，在2mL培养介质中重新悬浮300，000个细胞，并在35毫米的培养皿中重新悬浮300，000个细胞，用于西式印布分析，以确认Crk和CrkL的调节下。

3. 基线读数、细胞种子以及细胞阻抗测量和可视化

1. 通过单击底座"开始"按钮测量基线读数。在CO₂培养箱培养条件下，在实时细胞分析系统的摇篮中预孵1小时后，在将细胞播种到上腔室的相应孔之前，应读取基线。
   注:单击底座"开始"按钮后，控制单元将询问是否保存实验文件。保存文件后，底座分析器最初测量程序中设置的基线单元阻抗，然后进入暂停模式，直到再次单击底座"开始"按钮以测量第二步中的单元格阻抗。
2. 在基线测量后，从底座中取出用于迁移和入侵的板，并将其保存在生物安全柜中。
3. 在相应井中CIM板上腔的每个生物条件，在四倍体中播种100 μL的细胞（100，000个细胞），通过反向移液在摇篮控制单元中编程，以避免气泡。
4. 播种后，在室温下将板放在生物安全柜下 30 分钟，使细胞均匀地稳定到底部。将板移回相应的底座，然后单击底座启动按钮，开始测量 2.5 的第二步中编程的单元阻抗。
5. 最后一次扫描后，实验完成，结果将自动保存。
6. 在"数据分析"选项卡下，在实验完成期间或之后，以与时间相关的方式将单元格阻抗的变化可视化为单元格索引。通过单击"选项"框，可以单独或作为平均值和/或标准差来可视化四元位的每个条件。
7. 要将单元格索引数据导出到电子表格文件，请打开一个空电子表格文件，将光标放在数据分析窗口的中间，然后右键单击。在显示的对话框中，选择"将数据复制到列表格式"选项，并将数据粘贴到打开的电子表格中。
8. 调整原始数据中的时间以表示单元阻抗测量的实际开始时间。第二步开始时间设置为零。
   注:控制单元可以选择获取具有或不加规范化（即规范化单元格索引）的单元格索引，并将结果可视化为基于时间的图形表示。在此示例中，单元格索引数据导出时没有用于处理和图形表示的规范化。
9. 单击每个底座中的"释放"按钮，释放实验。

结果

有人建议，Crk和CrkL对于细胞迁移和入侵不同癌细胞系^13，17,17非常重要。虽然Crk和CrkL蛋白在结构和功能上彼此相似，并发挥基本的重叠功能16，19，20，21，许多基因敲除研究的Crk和CrkL没有明确解决是否具体的Crk，CrkL，或两者兼而有之。^16,19,20,21因此，不清?...

讨论

使用实时细胞分析系统实时测量细胞迁移和入侵是一种简单、快速和连续的监控过程，与在单个时间点提供数据的传统方法相比，具有多种显著的优势。与传统方法一样，必须针对实时细胞分析系统的每个细胞系优化实验条件，因为每个细胞系在粘附基、生长、细胞到细胞接触以及迁移和侵入性能力。由于这些差异，每个细胞系可能显示不同的细胞动力学和细胞阻抗。阻抗受井中种子的细胞数量?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk siRNA	Dharmacon	J-010503-10
CrkL siRNA	Ambion	ID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)	ATCC	302002	Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	51030285	CO2 incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Non-targeting siRNA	Dharmacon	D-001810-01	siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)	LI-COR Biosciences		Western blot imaging system
RTCA software	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc		Instrument used for experiment
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for experiment