Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses

Résumé

Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. Déterminer la capacité des cellules cancéreuses à migrer et à envahir dans diverses conditions de traitement est crucial pour évaluer les stratégies thérapeutiques. Ce protocole présente une méthode pour évaluer les capacités métastatiques en temps réel d’une lignée de cellules cancéreuses de glioblastome.

Résumé

Le cancer survient en raison de la prolifération incontrôlée des cellules initiées par l’instabilité génétique, les mutations, et l’environnement et d’autres facteurs de stress. Ces anomalies acquises dans les réseaux de signalisation moléculaire complexes et multicouches induisent la prolifération et la survie aberrantes de cellules, la dégradation extracellulaire de matrice, et la métastase aux organes éloignés. On estime qu’environ 90 % des décès liés au cancer sont causés par les effets directs ou indirects de la dissémination métastatique. Par conséquent, il est important d’établir un système très fiable et complet pour caractériser les comportements des cellules cancéreuses sur les manipulations génétiques et environnementales. Un tel système peut donner une compréhension claire de la régulation moléculaire des métastases cancéreuses et la possibilité de développer avec succès des stratégies thérapeutiques stratifiées et précises. Par conséquent, une détermination précise des comportements des cellules cancéreuses telles que la migration et l’invasion avec gain ou perte de fonction du gène(s) permet d’évaluer la nature agressive des cellules cancéreuses. Le système de mesure en temps réel basé sur l’impédance cellulaire permet aux chercheurs d’acquérir continuellement des données au cours d’une expérience entière et de comparer et de quantifier instantanément les résultats dans diverses conditions expérimentales. Contrairement aux méthodes conventionnelles, cette méthode ne nécessite pas de fixation, de coloration et de traitement d’échantillon pour analyser les cellules qui migrent ou envahissent. Ce document de méthode met l’accent sur les procédures détaillées pour la détermination en temps réel de la migration et l’invasion des cellules cancéreuses de glioblastome.

Introduction

Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. La détermination des génotypes et des phénotypes du cancer est essentielle à la compréhension et à la conception de stratégies thérapeutiques efficaces. Des décennies de recherche sur le cancer ont mené au développement et à l’adaptation de différentes méthodes pour déterminer les génotypes et les phénotypes du cancer. L’un des derniers développements techniques est la mesure en temps réel de la migration cellulaire et l’invasion basée sur l’impédance cellulaire. L’adhérence cellulaire aux substrats et aux contacts cellulaires joue un rôle important dans la communication et la régulation des cellules à cellule, le développement et l’entretien des tissus. Les anomalies dans l’adhérence cellulaire conduisent à la perte de contact cellule-cellule, la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM), et le gain des capacités migratrices et envahissantes par les cellules, qui contribuent tous à la métastase des cellules cancéreuses à différents organes^1,2. Diverses méthodes sont disponibles pour déterminer la migration cellulaire (cicatrisation des plaies et les essais de chambre Boyden) et l’invasion (Matrigel-Boyden chamber assay)^3,4,5. Ces méthodes conventionnelles sont semi-quantitatives parce que les cellules doivent être étiquetées avec un colorant fluorescent ou d’autres colorants avant ou après l’expérience pour mesurer les phénotypes cellulaires. En outre, des perturbations mécaniques sont nécessaires dans certains cas pour créer une plaie pour mesurer la migration des cellules vers le site de la plaie. En outre, ces méthodes existantes sont longues, à forte intensité de main-d’œuvre, et mesurent les résultats à un moment donné. En outre, ces méthodes sont sujettes à faire des mesures inexactes en raison de la manipulation incohérente au cours de la procédure expérimentale⁶.

Contrairement aux méthodes conventionnelles, le système d’analyse cellulaire en temps réel mesure l’impédance cellulaire en temps réel sans nécessiter de dommages pré- ou post-posts et mécaniques des cellules. Plus important encore, la durée d’une expérience peut être prolongée afin que les effets biologiques puissent être déterminés d’une manière dépendante du temps. L’exécution de l’expérience est efficace dans le temps et n’est pas exigeante en main-d’œuvre. L’analyse des données est relativement simple et précise. Par rapport à d’autres méthodes, cette méthode est l’une des meilleures mesures en temps réel pour mesurer la migration cellulaire et l’invasion^6,7,8,9.

Giaever et Keese ont été les premiers à décrire la mesure basée sur l’impedance d’une population cellulaire à la surface des électrodes¹⁰. Le système d’analyse cellulaire en temps réel fonctionne sur le même principe. La superficie de chaque puits de microplaque est couverte à environ 80 % d’une gamme de microélectrtrodes en or. Lorsque la surface de l’électrode est occupée par des cellules en raison de l’adhérence ou de la propagation des cellules, l’obstacle électrique change. Cet obstacle est affiché comme l’indice cellulaire, qui est directement proportionnel aux cellules couvrant la surface de l’électrode après qu’ils pénètrent dans la membrane microporous (la taille médiane de pores de cette membrane est de 8 m)¹¹.

Crk et CrkL sont des protéines adaptatrices contenant des domaines SH2 et SH3 et jouent des rôles importants dans diverses fonctions cellulaires, telles que la régulation du cytosquelette, la transformation cellulaire, la prolifération, l’adhérence, la transition épithéliale-mésenchymale, la migration, l’invasion et la métastase en médiateur des interactions protéines-protéines dans de nombreuses voies de signalisation^{1,12,13,14,15,}16 ,^{16, 17, 18}. Par conséquent, il est important de déterminer les capacités migratrices et invasives dépendantes de Crk/CrkL des cellules cancéreuses. L’analyse de cellules en temps réel a été effectuée pour déterminer les capacités migratrices et invasives des cellules de glioblastoma sur le knockdown de gène de Crk et de CrkL.

Ce document de méthode décrit des mesures détaillées de la migration et de l’invasion de cellules de glioblastome humain.

Protocole

REMARQUE: Tous les matériaux de culture cellulaire doivent être stériles et toute l’expérience doit être effectuée dans une armoire de biosécurité dans des conditions stériles.

1. Culture et électroporation de la lignée cellulaire U-118MG Glioblastoma

1. Culture la lignée cellulaire U-118MG dans le sérum bovin fœtal (FBS) à 5 % contenant le medium d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco (milieu culturel) et maintenue à 37 oC dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂ incubateur (conditions culturelles).
2. Utilisez des cellules saines confluentes de 70 à 80 % pour l’électroporation.
3. Pour la récolte des cellules, laver les cellules qui poussent dans des plats de culture avec 1x PBS et ajouter 2 ml de trypsin-EDTA de 0,05%. Placer dans l’incubateur pendant 30 s et retirer la trypsin-EDTA. Recueillir des cellules dans le milieu de la culture dans un tube de 15 mL.
4. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé de poche, des cellules centrifuges à 100 x g pendant 5 min, et jetez le supernatant.
5. Suspendre la pastille cellulaire dans le milieu de la culture et prendre 600 000 cellules pour chaque condition dans un tube de microcentrifuge. Ajuster le nombre de cellules en fonction des conceptions expérimentales et des taux de croissance.
6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifuge et ajouter 800 L de la solution saline tamponnée par le phosphate (DPBS) de Dulbecco. Vers le bas à l’aide d’une minicentrifugeuse pour 30 s et jeter le supernatant.
7. Ajoutez 60 l de tampon de résuspension R à la pastille cellulaire et ajoutez les siARN (c.-à-d. siRNA non-ciblage, Crk siRNA, CrkL siRNA, ou les deux siRNAs Crk et CrkL) à une concentration de 6 m au tube de microcentrifuge respectif. Mélangez-les doucement en tapant.
8. Électroporé 10 L de cellules avec un système d’électroporation à 1.350 V pour 10 ms avec trois impulsions et transférer les cellules électropolées dans 5 mL du milieu de culture. Répétez l’électroporation pour le reste des cellules préparées pour chaque condition.
9. Complétez toutes les électroporations respectives. Transférer les cellules électropolées dans deux plats de 35 mm par condition et les culturer dans des conditions culturelles pendant 3 jours.
10. Le troisième jour, traiter toutes les cellules électropolées dans 0,5% FBS contenant DMEM (milieu de sérum faible) pendant 6 h avant la mesure réelle de l’impédance cellulaire.

2. Préparation du système d’analyse cellulaire en temps réel, des plaques d’invasion et de migration cellulaires (ICM) et des cellules U-118MG électropolées pour le platage

1. Placez le système d’analyse cellulaire en temps réel dans un incubateur de CO₂ dans des conditions culturelles de 5 à 6 h avant le début de l’expérience pour stabiliser le système aux conditions de culture.
2. Pour l’essai d’invasion, la plaque 50 L de DMEM (moyen uni) contenant le gel de matrice extracellulaire (ECM) à 0,1 g/l dans chaque puits de la chambre haute de la plaque de l’ICM. Pour éviter d’avoir des bulles d’air, utilisez la méthode de tuyauterie inversée. Retirez immédiatement 30 L de gel ECM, en laissant 20 ll dans le puits.
3. Après le revêtement de gel ECM, garder l’assiette dans l’incubateur dans des conditions de culture pendant 4 h avec son couvercle allumé. Pendant le revêtement et le séchage du gel ECM, prenez des mesures préventives pour éviter le contact direct des électrodes de la chambre haute des plaques avec les mains, les surfaces de l’armoire de biosécurité, ou l’incubateur de CO_2.
4. Pour configurer le programme de mesure de l’impedance, cliquez deux fois sur l’icône logicielle associée (voir Tableau des matériaux) pour ouvrir l’application logicielle du système (unité de contrôle). Chaque berceau dispose d’une fenêtre individuelle avec des onglets différents pour définir les conditions expérimentales, l’impédance mesurant l’intervalle de temps et la durée, et l’analyse des données.
5. Sous l’onglet Layout, placez les puits quadruplicate pour chaque affection biologique et définissez les mesures d’impédance cellulaire en deux étapes sous l’onglet Annexe. La première étape est pour une mesure de base unique (un balayage avec un intervalle de 1 min), et la deuxième étape consiste à mesurer l’impédance cellulaire dans les berceaux individuels respectifs pour une expérience réelle. Pour la migration, utilisez 145 balayages avec un intervalle de 10 minutes, et pour l’invasion, 577 balaye avec un intervalle de 10 minutes, individuellement mis) dans les berceaux individuels respectifs.
6. Un h avant le début de la mesure de l’impédance cellulaire, ajouter 160 L de DMEM avec 10% FBS comme chimioattractant dans les puits de la chambre basse de la plaque. Assembler soit la chambre haute contenant les puits enduits de gel ECM ou les puits non revêtus avec la chambre basse pour mesurer l’invasion et la migration, respectivement.
7. Remplissez les puits de la chambre haute de 50 l de milieu de sérum bas et placez-les dans le berceau du système. Vérifiez si tous les puits sont reconnus par l’unité de contrôle en cliquant sur l’onglet Message. Si le message s’affiche comme OK, la plaque dans le berceau est prête pour l’expérience.
8. Préinventer les plaques complètement emballées dans l’incubateur dans des conditions de culture pendant 1 h avant les mesures dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel, qui est essentiel pour l’aclimatation d’une plaque emballée aux conditions de culture cellulaire.
9. Pour la récolte des cellules traitées avec un milieu de sérum bas, trypsiniser les cellules comme dans l’étape 1.3, les recueillir dans le milieu de sérum bas, et compter les cellules comme dans l’étape 1.4.
10. Après le comptage, les cellules de centrifugeuses à 100 x g pendant 5 min et jettent le supernatant.
11. Résuspendez 800 000 cellules dans 800 l de milieu de sérum bas pour les essais de migration et d’invasion. De plus, réutilisez 300 000 cellules dans un milieu de culture et des graines de 2 ml dans un plat de 35 mm pour l’analyse des taches occidentales afin de confirmer le knockdown réglementé de Crk et CrkL.

3. Lecture de base, ensemencement des cellules et mesure et visualisation de l’impédance cellulaire

1. Mesurez la lecture de base en cliquant sur le bouton De démarrage du berceau. La ligne de base doit être lue après avoir préincubé les plaques pendant 1 h dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel dans des conditions de culture dans l’incubateur de CO₂ et avant d’ensemencer les cellules aux puits respectifs de la chambre haute.
   REMARQUE: Une fois que le bouton De démarrage du berceau est cliqué, l’unité de contrôle se demandera s’il y a à enregistrer le fichier expérimental. Une fois le fichier enregistré, l’analyseur de berceau mesure l’impédance cellulaire de base telle qu’elle est définie dans le programme au départ et entre en mode pause jusqu’à ce que le bouton De démarrage du berceau soit cliqué à nouveau pour mesurer l’impédance cellulaire dans la deuxième étape.
2. Prenez les deux plaques pour la migration et l’invasion des berceaux après la mesure de base et gardez-les dans l’armoire de biosécurité.
3. Graine 100 L de cellules (100 000 cellules) dans les quadruplicates pour chaque état biologique de la chambre haute de la plaque de l’ICM dans les puits respectifs, comme programmé dans l’unité témoin du berceau en faisant marche arrière pour éviter les bulles d’air.
4. Après l’ensemencement, garder la plaque sous une armoire de biosécurité pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de s’installer uniformément vers le bas. Transférer la plaque vers le berceau respectif et cliquez sur le bouton de démarrage du berceau pour commencer à mesurer l’impédance cellulaire comme programmé dans la deuxième étape de 2,5.
5. Après le dernier balayage, l’expérience est terminée, et les résultats sont enregistrés automatiquement.
6. Sous l’onglet Analyse des données, visualisez les changements dans l’impédance cellulaire en tant qu’index cellulaire d’une manière dépendante du temps pendant ou après la fin de l’expérience. Chacune des conditions respectives des quadruplicates peut être visualisée individuellement ou en moyenne et/ou en cliquant sur les cases Option pour un écart moyen et standard.
7. Pour exporter des données d’index cellulaires vers un fichier de feuilles de calcul, ouvrez un fichier de tableur vide, placez le curseur au milieu de la fenêtre d’analyse des données et cliquez à droite. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, choisissez l’option Copy Data dans le format de listeet collez les données dans la feuille de calcul ouverte.
8. Ajuster le temps dans les données brutes pour représenter l’heure de début réelle de la mesure de l’obstacle cellulaire. L’heure de début de la deuxième étape est définie comme nulle.
   REMARQUE: L’unité témoin a la possibilité d’obtenir l’index cellulaire avec ou sans normalisation (c.-à-d. l’indice cellulaire normalisé) et de visualiser les résultats comme une présentation graphique d’une manière dépendante du temps. Dans cet exemple, les données de l’index cellulaire sont exportées sans normalisation pour le traitement et la présentation graphique.
9. Relâchez l’expérience en cliquant sur le bouton Libération dans chaque berceau.

Résultats

Il a été suggéré que Crk et CrkL sont importants pour la migration cellulaire et l’invasion dans différentes lignées de cellules cancéreuses^13,17. Bien que les protéines Crk et CrkL soient structurellement et fonctionnellement semblables les unes aux autres et jouent les fonctions de chevauchement essentielles^16,19,20,21, beau...

Discussion

La mesure en temps réel de la migration cellulaire et de l’invasion à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel est un processus de surveillance simple, rapide et continu avec des avantages multiples et significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles qui fournissent des données à un moment donné. Comme pour les méthodes traditionnelles, les conditions expérimentales doivent être optimisées pour chaque lignée cellulaire pour le système d’analyse cellulaire en temps réel, car chaque...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk siRNA	Dharmacon	J-010503-10
CrkL siRNA	Ambion	ID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)	ATCC	302002	Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	51030285	Co2 incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Non-targeting siRNA	Dharmacon	D-001810-01	siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)	LI-COR Biosciences		Western blot imaging system
RTCA software	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc		Instrument used for experiment
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for experiment