АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Рак является смертельным заболеванием из-за его способности метастазировать в различные органы. Определение способности раковых клеток мигрировать и вторгаться в различных условиях лечения имеет решающее значение для оценки терапевтических стратегий. Этот протокол представляет метод оценки метастатических способностей в реальном времени линии раковых клеток глиобластомы.

Аннотация

Рак возникает из-за неконтролируемого распространения клеток, инициированных генетической нестабильностью, мутациями, а также экологическими и другими факторами стресса. Эти приобретенные аномалии в сложных, многослойных молекулярных сигнальных сетях вызывают аномальное пролиферацию и выживание клеток, внеклеточную деградацию матрицы и метастазирование в отдаленные органы. Приблизительно 90% случаев смерти, связанных с раком, по оценкам, вызваны прямыми или косвенными последствиями метастатического распространения. Поэтому важно создать высоконадежную, всеобъемлющую систему для характеристики поведения раковых клеток при генетических и экологических манипуляциях. Такая система может дать четкое представление о молекулярной регуляции метастазах рака и возможности для успешного развития стратифицированных, точных терапевтических стратегий. Таким образом, точное определение поведения раковых клеток, таких как миграция и вторжение с увеличением или потерей функции генов (ы) позволяет оценить агрессивный характер раковых клеток. Система измерений в реальном времени, основанная на клеточной импедании, позволяет исследователям постоянно получать данные в ходе всего эксперимента и мгновенно сравнивать и количественно оценивать результаты в различных экспериментальных условиях. В отличие от обычных методов, этот метод не требует фиксации, окрашивания и обработки образцов для анализа клеток, которые мигрируют или вторгаются. В этом методическом документе особое внимание уделяется подробным процедурам определения миграции и вторжения раковых клеток глиобластомы в режиме реального времени.

Введение

Рак является смертельным заболеванием из-за его способности метастазировать в различные органы. Определение генотипов и фенотипов рака имеет решающее значение для понимания и разработки эффективных терапевтических стратегий. Десятилетия исследований рака привели к разработке и адаптации различных методов определения генотипов и фенотипов рака. Одним из последних технических разработок является измерение миграции и вторжения в реальном времени на основе клеточного импеданса. Сливки клеток к субстратам и контактам клеток играют важную роль в связи и регуляции, развитии и поддержании тканей. Аномалии в клеточной адгезии приводят к потере клеточного контакта, деградации внеклеточной матрицы (ECM) и приобретению мигрирующих и вторгающихся возможностей клетками, которые способствуют метастазам раковых клеток в различные органы1,2. Различные методы доступны для определения миграции клеток (заживление ран и Бойден камеры анализы) и вторжения (Matrigel-Boyden камеры анализ)3,4,5. Эти обычные методы являются полуколичественными, потому что клетки должны быть помечены флуоресцентным красителем или другими красителями до или после эксперимента для измерения фенотипов клеток. Кроме того, в некоторых случаях необходимы механические сбои для создания раны для измерения миграции клеток в место раны. Более того, эти существующие методы отнимают много времени, трудоемки и измеряют результаты только в одно время. Кроме того, эти методы склонны к неточным измерениям из-за непоследовательной обработки во время экспериментальной процедуры6.

В отличие от обычных методов, система анализа клеток в реальном времени измеряет клеточные импеданс в режиме реального времени, не требуя предварительного или постстождения и механического повреждения клеток. Что еще более важно, продолжительность эксперимента может быть продлена, с тем чтобы биологические эффекты могли определяться зависящим от времени образом. Выполнение эксперимента является эффективным по времени и не трудоемким. Анализ данных является относительно простым и точным. По сравнению с другими методами, этот метод является одним из лучших измерений в реальном времени для измерения миграции клеток и вторжения6,,77,8,,9.

Giaever и Keese были первыми, кто описал импеданс-измерение популяции клеток на поверхности электродов10. Система анализа клеток в реальном времени работает по тому же принципу. Площадь каждого микроплитного колодца составляет примерно 80% покрыто массивом золотых микроэлектродов. Когда площадь поверхности электрода занята клетками из-за присоединения или распространения клеток, электрический импульс меняется. Этот импеданс отображается как индекс клеток, который прямо пропорционален клеткам, покрывающим область поверхности электрода после того, как они проникают в микропористую мембрану (средний размер пор этой мембраны 8 мкм)11.

Crk и CrkL являются адаптерными белками, содержащими SH2 и SH3 домены и играют важную роль в различных клеточных функций, таких как цитоскелет регулирования, преобразование клеток, пролиферация, адгезия, эпителиал-мезенхимальный переход, миграция, вторжение, и метастазирование по среде белково-белковых взаимодействий во многих сигнальных путей1,12,13,14,15,16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16,151617, 18. Поэтому важно определить, что crk/CrkL-зависимые мигрирующие и инвазивные возможности раковых клеток. Анализ клеток в реальном времени был проведен для определения мигрирующих и инвазивных способностей клеток глиобластомы при подделке генов Crk и CrkL.

Этот метод документ описывает подробные измерения Crk- и CrkL-опосредованной миграции и вторжения клеток глиобластомы человека.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы клеточной культуры должны быть стерильными, и весь эксперимент должен быть выполнен в шкафу биобезопасности в стерильных условиях.

1. Культура и электропорация линии глиобластомы U-118MG

  1. Культура U-118MG клеточной линии в 5% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS), содержащий Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) (культура среды) и поддерживать при 37 градусов по Цельсию во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 инкубатор (культурные условия).
  2. Используйте 70- 80% сольясь здоровые клетки для электропорации.
  3. Для сбора клеток, мыть клетки, растущие в культуре блюда с 1x PBS и добавить 2 мл 0,05% трипсин-EDTA. Поместите в инкубатор на 30 с и удалите трипсин-ЭДТА. Сбор клеток в среде культуры в трубку 15 мл.
  4. Подсчитайте клетки с помощью портативного автоматизированного счетчика клеток, центрифуги на 100 х г в течение 5 минут, и отбросить супернатант.
  5. Приостановить клеточные гранулы в среде культуры и принять 600000 клеток для каждого состояния в микроцентрифугтрубки. Отрегулируйте число клеток в зависимости от экспериментальных конструкций и темпов роста.
  6. Перенесите суспензию клеток в микроцентрифуговую трубку и добавьте 800 Л л фосфатно-буферного солина Дульбекко (DPBS). Спин вниз с помощью миницентрифуги в течение 30 с и отказаться от супернатанта.
  7. Добавьте 60 зЛ буфера повторного действия R в клеточные гранулы и добавьте siRNA (т.е. нетаргетингss siRNA, Crk siRNA, или crk и CrkL siRNA) в концентрации 6 мкм в соответствующую микроцентрифугную трубку. Смешайте их осторожно, нажав.
  8. Электропорет 10 л клеток с системой электропорации на 1350 В на 10 мс с тремя импульсами и переносит электропоранные клетки в 5 мл культуры среды. Повторите электропорацию для остальных клеток, подготовленных для каждого состояния.
  9. Завершите все соответствующие электропорации. Перенесите электропорированные клетки в две 35 мм посуды на состояние и культивацию их в культурных условиях в течение 3 дней.
  10. На третий день, лечить все электропонные клетки в 0,5% FBS, содержащий DMEM (низкая среда сыворотки) в течение 6 ч до фактического измерения импеданс клетки.

2. Подготовка системы анализа клеток в режиме реального времени, клеточного вторжения и миграции (CIM) пластин, а также электропоганных U-118MG ячеек для покрытия

  1. Поместите систему анализа клеток в реальном времени в инкубатор CO2 в культурных условиях 5–6 ч до начала эксперимента по стабилизации системы в культурных условиях.
  2. Для проведения интаф-ассса пластина 50 зл DMEM (простая средняя), содержащая внеклеточный матричного матечного (ECM) гель на уровне 0,1 мкг/л в каждой скважине верхней камеры пластины CIM. Чтобы избежать пузырьков воздуха, используйте метод обратного пипетки. Немедленно удалите 30 л eCM геля, оставляя 20 Лл в колодце.
  3. После eCM гель покрытие, держать пластину в инкубаторе в культурных условиях в течение 4 ч с его крышкой. Во время eCM гель покрытие и сушки, принять превентивные меры, чтобы избежать прямого контакта электродов верхней камеры пластин с руками, поверхностей шкафа биобезопасности, или CO2 инкубатора.
  4. Чтобы настроить программу измерения импеданса, дважды щелкните значок связанного программного обеспечения (см. Таблица Материалов),чтобы открыть системное программное приложение (блок управления). Каждая колыбель имеет отдельное окно с различными вкладками, чтобы установить экспериментальные условия, impedance измерения интервала времени и продолжительности, а также анализа данных.
  5. Под вкладкой Layout установите четырехсторонние скважины для каждого биологического состояния и установите двухступенчатые измерения импеданса клеток под вкладкой «Расписание». Первый шаг предназначен для одноразового базового измерения (один развертки с интервалом 1 мин), а второй шаг заключается в измерении клеточного импеданса в соответствующих отдельных колыбели для фактического эксперимента. Для миграции используйте 145 зачисток с интервалом 10 мин, а для вторжения 577 зачисток с интервалом 10 мин, индивидуально установленных) в соответствующих отдельных колыбели.
  6. Один ч до начала измерения клеточного импедеданса добавьте 160 л DMEM с 10% FBS в качестве химиоаттрактора в колодцах нижней камеры пластины. Соберите либо верхнюю камеру, содержащую eCM гель покрытием скважин или без покрытия скважин с нижней камерой для измерения вторжения и миграции, соответственно.
  7. Заполните колодцы в верхней камере 50 зл и сыворотки средней и поместите их в колыбель системы. Проверьте, распознаются ли все скважины блоком управления, нажав на вкладку Сообщение. Если сообщение отображается как ОК,пластина в колыбели готова к эксперименту.
  8. Preincubate полностью упакованы пластин в инкубаторе в условиях культуры в течение 1 ч до измерений в режиме реального времени системы анализа клеток колыбели, которая имеет важное значение для акклиматизации упакованной пластины в условиях клеточной культуры.
  9. Для сбора клеток, обработанных низкой средой сыворотки, протрите клетки как в шаге 1.3, соберите их в среде низкой сыворотки и подсчитайте клетки как в шаге 1.4.
  10. После подсчета, центрифуги клетки на 100 х г в течение 5 минут и отбросить супернатант.
  11. Resuspend 800,000 клеток в 800 л низкой среде сыворотки для миграции и вторжения анализов. Кроме того, resuspend 300000 клеток в 2 мл культуры среды и семян в 35 мм блюдо для западного анализа помок, чтобы подтвердить регулируемый нокдаун Crk и CrkL.

3. Базовое чтение, посев клеток, и клеточной импеданс измерения и визуализации

  1. Измерьте базовое чтение, Start нажав кнопку "Запуск колыбели". Базовый удлинитель следует прочитать после предварительного инкубации пластин на 1 ч в колыбели системы анализа клеток в реальном времени в условиях культуры в инкубаторе CO2 и перед посевом клеток в соответствующих скважинах в верхней камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После нажатия кнопки «Запуск колыбели» блок управления спросит, следует ли сохранить экспериментальный файл. После сохранения файла анализатор колыбели измеряет импеданд исходной ячейки, установленный в программе изначально, и вводит режим паузы до тех пор, пока кнопка «Запуск колыбели» не нажата снова для измерения импеданса ячейки на втором этапе.
  2. Выняйте обе пластины для миграции и вторжения из колыбелей после базового измерения и держать их в кабинете биобезопасности.
  3. Семя 100 л клеток (100 000 клеток) в четырехместных для каждого биологического состояния в верхней камере пластины CIM в соответствующих скважинах, как запрограммировано в блоке управления колыбели обратным пайпеттингом, чтобы избежать пузырьков воздуха.
  4. После посева, держать пластину под биобезопасности шкаф в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы клетки равномерно оседать на дно. Перенесите пластину обратно в соответствующую колыбели и нажмите кнопку запуска колыбели, чтобы начать измерение импеданса ячейки, как запрограммировано на втором этапе 2,5.
  5. После последнего развертки эксперимент завершается, и результаты сохраняются автоматически.
  6. Под вкладкой «Анализ данных» визуализируйте изменения в клеточной импедале и индексе клеток в зависимости от времени во время или после завершения эксперимента. Каждое из соответствующих условий четырехкомнатных может быть визуализировано либо индивидуально, либо в виде средних и/или стандартных отклонений, нажав на коробки Опциона для среднего и стандартного отклонения.
  7. Для экспорта данных индекса ячейки в файл электронной таблицы откройте пустой файл электронной таблицы, поместите курсор в середину окна анализа данных и нажмите правой кнопкой мыши. В поле диалога, которое появляется, выберите опцию Копирование данных в формат спискаи вставьте данные в открытую таблицу.
  8. Отрегулируйте время в исходных данных, чтобы представить фактическое время начала измерения клеточного импеданса. Время начала второго шага устанавливается как ноль.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блок управления имеет возможность получить индекс ячейки с или без нормализации (т.е. нормализованный индекс ячейки) и визуализировать результаты в качестве графического представления в зависимости от времени образом. В этом примере данные сотового индекса экспортируются без нормализации для обработки и графической презентации.
  9. Отпустите эксперимент, нажав кнопку Release в каждой колыбели.

Результаты

Было высказано предположение, что Crk и CrkL имеют важное значение для миграции клеток и вторжения в различных линиях раковых клеток13,17. Хотя белки Crk и CrkL структурно и функционально похожи друг на друга и играют важные перекрывающиеся функции16,<...

Обсуждение

Измерение миграции и вторжения в реальном времени с использованием системы анализа ячеек в реальном времени представляет собой простой, быстрый и непрерывный процесс мониторинга с многочисленными значительными преимуществами по сравнению с традиционными методами, предоставляя дан?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Оливию Фанк за техническую помощь в подготовке данных системы анализа ячеек в режиме реального времени. Мы также благодарим Медицинский центр письма в Детском Милосердии Канзас-Сити за редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Томом Keaveny Наделенный Фонд детских исследований рака (TP) и Детские милосердия больницы Midwest рака Альянс Партнерский консультативный совет финансирования (TP).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinetThermoFisher Scientific1300 Series Class II, Type A2
CIM platesCell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc5665825001Cell invasion and migration plates
Crk siRNADharmaconJ-010503-10
CrkL siRNAAmbionID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)ATCC302002Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco21-031-CVDPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermoFisher Scientific51030285Co2 incubator
MatrigelBD Bioscience354234Extracellular matrix gel
Neon electroporation systemThermoFisher ScientificMPK5000Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kitThermoFisher ScientificMPK1025Electroporation kit
Non-targeting siRNADharmaconD-001810-01siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)LI-COR BiosciencesWestern blot imaging system
RTCA softwareCell Analysis Division of Agilent Technologies, IncInstrument used for experiment
ScepterMilliporeC85360Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTAGibco25300-054
U-118MGATCCATCC HTB15Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DPCell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc380601050Instrument used for experiment

Ссылки

  1. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
  4. Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
  5. Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  6. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
  7. Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
  8. Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
  9. Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  10. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  11. Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
  12. Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
  13. Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
  14. Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
  15. Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
  16. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  17. Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
  18. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  19. Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
  20. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  21. Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

158Crk

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены