עכבה מבוססי מדידה בזמן אמת של סרטן הגירה תאים ופלישה

Summary

סרטן היא מחלה קטלנית בשל יכולתה לעבור גרורות לאיברים שונים. קביעת היכולת של תאים סרטניים להגר ולפלוש תחת תנאי טיפול שונים חיונית להערכת אסטרטגיות טיפוליות. פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את היכולות גרורתית בזמן אמת של קו הסרטן הגלינובלסטומה.

Abstract

הסרטן מתעורר בשל התפשטות בלתי מבוקרת של תאים ביוזמת אי-יציבות גנטית, מוטציות, והסביבה גורמי מתח אחרים. אלה מומים שנרכשו ברשתות איתות מולקולריות מורכבות, לגרום להתפשטות והישרדות של תאים חריגה, השפלה מטריצה מרוכזת, גרורות לאיברים רחוקים. כ 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן מוערכים להיגרם על ידי אפקטים ישירים או עקיפים של הפצת גרורות. לכן, חשוב להקים מערכת מאוד אמינה ומקיפה כדי לאפיין את התנהגויות התא של הסרטן על מניפולציות גנטיות וסביבתיות. מערכת כזו יכולה לתת הבנה ברורה של הרגולציה המולקולרית של גרורות סרטן והזדמנות להתפתחות מוצלחת של אסטרטגיות מדויקות וטיפוליות. מכאן, קביעה מדויקת של התנהגויות תא סרטן כגון הגירה ופלישה עם רווח או אובדן של תפקוד של גנים (s) מאפשר הערכה של האופי האגרסיבי של תאים סרטניים. מערכת המדידה בזמן אמת מבוסס על עכבה התא מאפשר לחוקרים לרכוש ללא הרף נתונים במהלך ניסוי שלם ובאופן מיידי להשוות ולכמת את התוצאות בתנאים ניסיוניים שונים. שלא כמו שיטות קונבנציונליות, שיטה זו אינה דורשת קיבעון, כתמים ועיבוד לדוגמה לניתוח תאים העוברים או פולשים. נייר שיטה זה מדגיש הליכים מפורטים לקביעת זמן אמת של הגירה ופלישה של תאים הסרטניים gliנובלסטומה.

Introduction

סרטן היא מחלה קטלנית בשל יכולתה לעבור גרורות לאיברים שונים. קביעת גנוטיפים לסרטן ופנוטיפים הוא קריטי להבנת ולעצב אסטרטגיות טיפוליות אפקטיביות. עשורים של מחקר סרטן הובילו לפיתוח והסתגלות של שיטות שונות כדי לקבוע גנוטיפים הסרטן ופנוטיפים. אחת ההתפתחויות הטכניות העדכנית ביותר היא מדידה בזמן אמת של הגירה התא והפלישה מבוסס על עכבה תאים. הדבקה לתא לסובסטרטים ולאנשי קשר סלולריים ממלאים תפקיד חשוב בתקשורת ורגולציה של תא לתאים, פיתוח ותחזוקה של רקמות. חריגות בתא הדבקה להוביל לאובדן של מגע תא תא, השפלה של מטריקס מסחטות (ecm), ולהשיג יכולות נדידה והפולשים על ידי תאים, אשר כולם תורמים גרורות של תאים סרטניים לאיברים שונים^1,2. שיטות שונות זמינים כדי לקבוע את הגירה התא (ריפוי פצע ו-boyden הלשכה הקאמרית) ואת הפלישה (שיטת מטריג'ל-boyden קאמרית)^3,4,5. אלה שיטות קונבנציונליות הן חצי כמותית, כי התאים צריכים להיות מתויג עם צבע פלורסנט או צבעים אחרים או לפני או אחרי הניסוי כדי למדוד פנוטיפים תא. בנוסף, יש צורך בהפרעות מכניות במקרים מסוימים ליצירת פצע למדידת הגירה של תאים לאתר הפצע. יתר על כן, שיטות אלה קיימות צורכת זמן, אינטנסיבי עבודה, ולמדוד את התוצאות רק פעם אחת בלבד. בנוסף, שיטות אלה נוטות לבצע מדידות לא מדויקות עקב טיפול לא עקבי במהלך ההליך הניסיוני⁶.

שלא כמו שיטות קונבנציונליות, מערכת ניתוח התא בזמן אמת מודד העכבה התא בזמן אמת מבלי לדרוש טרום או כתמים ונזק מכני של תאים. וחשוב מכך, ניתן להאריך את משך הניסוי כך שניתן יהיה לקבוע את ההשפעות הביולוגיות באופן תלוי-זמן. ביצוע הניסוי הינו יעיל בזמן ולא מעמיק לעבודה. ניתוח נתונים הוא פשוט יחסית ומדויק. לעומת שיטות אחרות, שיטה זו היא אחת המידות הטובות ביותר בזמן אמת כדי למדוד הגירה תא ופלישה^6,7,8,9.

Giaever ו Keese היו הראשונים לתאר את המדידה מבוססת עכבה של אוכלוסיית התא על פני השטח של אלקטרודות¹⁰. מערכת ניתוח התא בזמן אמת פועלת על אותו עיקרון. השטח של כל מיקרופלייט היטב הוא כ 80% מכוסה במערך של מיקרואלקטרודות זהב. כאשר שטח האלקטרודה משטח מאוכלס על ידי תאים בשל דבקות או התפשטות של התאים, העכבה החשמלית משתנה. עכבה זו מוצגת כאינדקס התא, אשר ביחס ישיר לתאים המכסים את שטח פני האלקטרודה לאחר שהם חודרים קרום מיקרונקבובי (גודל הנקבובית החציוני של קרום זה הוא 8 μm)¹¹.

Crk ו crk הם מתאם חלבונים המכילים SH2 ו SH3 תחומים ולשחק תפקידים חשובים בפונקציות הסלולר השונות, כגון רגולציה השלד ציטותא, המרת תאים, התפשטות, הדבקה, אפיתל-mesenchymal מעבר, הגירה, פלישה, ו גרורות על-ידי מדיטינג אינטראקציות חלבון^{,17,14חלבון מסלולים15,16}רבים איתות^1,12,13 . ^{שמונה עשרה} לכן, חשוב לקבוע את Crk/Crk התלוי ביכולות הנדידה פולשנית של תאים סרטניים. בזמן אמת ניתוח התא בוצע כדי לקבוע את היכולות נדידה פולשנית של תאים גלינובלסטומה על הסתרה גן של Crk ו-Crk.

נייר שיטה זה מתאר מדידות מפורטות של הגירה Crk-ו-Crk-תיווך ופלישה של תאים גלינובלסטומה אנושיים.

Protocol

הערה: כל חומרי התרבות התא צריך להיות סטרילי ואת הניסוי כולו יש לבצע בארון בטיחות ביולוגי בתנאים סטרילי.

1. תרבות ואלקטרופורציה של קו ה-U-118MG התאים גלינובלסטומה

1. התרבות קו U-118MG ב 5% סרום העובר העוברי (FBS) המכיל בינונית נשר משתנה של Dulbecco (DMEM) (התרבות בינונית) ולשמור על 37 ° c באווירה לח המכיל 5% CO חממה₂ (תנאי תרבות).
2. השתמש ב-70 – 80% תאים בריאים בעלי שוטפת עבור אלקטרופורציה.
3. למסיק התאים, שטוף את התאים הגדלים במנות התרבות עם 1x PBS ולהוסיף 2 מ ל 0.05% טריפסין-EDTA. מקום בחממה עבור 30 ולהסיר את טריפסין-EDTA. לאסוף תאים בתווך התרבות לתוך שפופרת 15 mL.
4. לספור את התאים באמצעות מונה מחשב כף יד אוטומטי, תאים צנטריפוגה ב 100 x g עבור 5 דקות, ולמחוק את supernatant.
5. להשעות את הגלולה התא במדיום התרבות ולקחת 600,000 תאים עבור כל תנאי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. כוונן את מספר התאים בהתאם לעיצובים וקצבי הצמיחה הניסיוניים.
6. העבר את ההשעיה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 800 μL של מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). ספין למטה באמצעות minicentrifuge עבור 30 s ולהיפטר supernatant.
7. הוסף 60 μL של מאגר ההשעיה R אל הגלולה התא ולהוסיף את siRNAs (כלומר, לא המיקוד Sirnas, Crk Sirnas, Crk Sirnas, או שניהם Crk ו-Crk siRNAs) בריכוז של 6 μM לצינור המיקרוצנטריפוגה המתאים. לערבב אותם בעדינות על ידי הקשה.
8. אלקטרופורטה 10 μL של תאים עם מערכת אלקטרופורציה ב 1,350 V עבור 10 ms עם שלושה פולסים ולהעביר את התאים electroporate לתוך 5 מ ל של מדיום התרבות. חזור על האלקטרופורציה עבור שאר התאים המוכנים לכל תנאי.
9. השלם את כל האלקטרופורציה המתאימה. העבר תאים electroporated לתוך 2 35 mm מנות לכל מצב ותרבות אותם בתנאי תרבות במשך 3 ימים.
10. ביום השלישי, לטפל בכל התאים electroporated ב 0.5% FBS המכיל DMEM דיום (בינוני סרום נמוך) עבור 6 h לפני מדידת העכבה בפועל התא.

2. הכנת מערכת ניתוח תאים בזמן אמת, הפלישה תא והגירה (CIM) צלחות, ו Electroporated U-118MG תאים עבור ציפוי

1. מניחים את מערכת ניתוח התא בזמן אמת בחממה של CO₂ תחת מצבי תרבות 5 – 6 h לפני תחילת הניסוי כדי לייצב את המערכת לתנאי התרבות.
2. עבור שיטת הפלישה, צלחת 50 μL של DMEM (רגיל בינוני) המכיל מטריצה החילוץ (ECM) ג'ל ב 0.1 μg/μL בכל הבאר של החדר העליון של הצלחת CIM. כדי למנוע בועות אוויר, השתמש בשיטת הליטוף ההפוכה. להסיר מיד 30 μL של ג'ל ECM, עוזב 20 μL בבאר.
3. לאחר ציפוי ג'ל ECM, לשמור על הצלחת בחממה תחת תנאי התרבות עבור 4 h עם המכסה שלה. במהלך הציפוי והייבוש של ECM ג'ל, נקוט באמצעי מניעה כדי להימנע ממגע ישיר של האלקטרודות של החדר העליון של הצלחות עם הידיים, המשטחים של הקבינט הביובטיאלי, או החממה של CO₂ .
4. כדי להגדיר את תוכנית מדידת העכבה, לחץ פעמיים על סמל התוכנה המשויכת (ראה טבלת חומרים) כדי לפתוח את יישום תוכנת המערכת (יחידת בקרה). כל עריסה יש חלון יחיד עם כרטיסיות שונות כדי לקבוע את התנאים הניסיוניים, העכבה מרווח זמן ומשך, וניתוח נתונים.
5. תחת הכרטיסיה פריסה , הגדר בארות מקוודלות עבור כל תנאי ביולוגי וקבע מדידות עכבה של שתי שלבים תחת הכרטיסיה תזמון . השלב הראשון הוא עבור מדידה בסיסית חד פעמי (בדיקה אחת עם מרווח של 1 דקות), והשלב השני הוא למדוד את העכבה של התא בעריסות בודדות המתאימות לניסוי בפועל. עבור הגירה, השתמש 145 מטאטא עם מרווח 10 דקות, ועבור פלישה, 577 מטאטא עם 10 דקות מרווח, בנפרד להגדיר) בעריסות בודדות בהתאמה.
6. אחד h לפני תחילת מדידת העכבה התא, להוסיף 160 μL של DMEM עם 10% FBS כימוג בבארות של החדר התחתון של הצלחת. להרכיב את החדר העליון המכיל את הבארות מצופה ג'ל ECM או בארות בלתי מצופה עם החדר התחתון כדי למדוד את הפלישה והגירה, בהתאמה.
7. למלא את הבארות בתא העליון עם 50 μL של מדיום סרום נמוך ולמקם אותם בעריסה של המערכת. בדוק אם כל הבארות מזוהות על-ידי יחידת הבקרה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה הודעה . אם ההודעה מוצגת כאישור, הצלחת בעריסה מוכנה לניסוי.
8. לקדם את הצלחות ארוז לחלוטין בחממה תחת תנאי תרבות עבור 1 h לפני מדידות בעריסה בזמן אמת מערכת ניתוח תא, אשר חיוני להתרגל של צלחת ארוזה לתנאי תרבות התא.
9. עבור התאים לאסוף שטופלו בינונית סרום נמוך, טריסיזציה התאים כמו בשלב 1.3, לאסוף אותם במדיום סרום נמוך, ולספור את התאים כמו בשלב 1.4.
10. לאחר ספירה, בתאי צנטריפוגה ב 100 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
11. השהה מחדש 800,000 תאים ב 800 μL של מדיום סרום נמוך עבור הגירה assays הפלישה. בנוסף, השעיה מחדש 300,000 תאים ב 2 מ ל של תרבות בינונית וזרע בצלחת 35 מ"מ עבור ניתוח כתמי המערבי כדי לאשר את הנוק מוסדר של Crk ו-Crk.

3. קריאה בסיסית, זריעת התאים ומדידת העכבה של התא והדמיה

1. למדוד את הקריאה הבסיסית על ידי לחיצה על לחצן התחל עריסה. בסיס הבסיס צריך להיקרא לאחר לקדם את הצלחות עבור 1 h בעריסה של מערכת ניתוח התא בזמן אמת בתנאים התרבות בחממה₂ CO ולפני זריעת התאים לבארות המתאימות בחדר העליון.
   הערה: לאחר לחיצה על לחצן התחלת העריסה, יחידת הבקרה תשאל אם לשמור את הקובץ הניסיוני. לאחר שמירת הקובץ, מנתח העריסה מודד את העכבה של התא הבסיסי כפי שנקבע בתוכנית בתחילה ומזינה מצב השהיה עד שלחצן התחל העריסה נלחץ שוב כדי למדוד את העכבה של התא בשלב השני.
2. להוציא את שתי הצלחות עבור הגירה ופלישה מן העריסות לאחר מדידה בסיסית ולשמור אותם בארון בטיחות.
3. הזרע 100 μL של תאים (100,000 תאים) ב quad, עבור כל תנאי ביולוגי בחדר העליון של לוחית CIM בבארות המתאימות כפי שתוכנתו ביחידת הבקרה של העריסה על ידי לאחור ליטוף כדי למנוע בועות אוויר.
4. לאחר זריעה, לשמור את הצלחת תחת ארון בטיחות ביולוגי עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים באופן שווה להתיישב למטה. להעביר את הצלחת בחזרה את העריסה בהתאמה ולחץ על כפתור התחל העריסה כדי להתחיל למדוד את העכבה התא כפי שתוכנתו בשלב השני של 2.5.
5. לאחר הסריקה האחרונה, הניסוי מסתיים והתוצאות נשמרות באופן אוטומטי.
6. תחת הכרטיסיה ניתוח נתונים , דמיין את השינויים בעכבה של תאים כאינדקס תאים באופן תלוי-זמן במהלך או לאחר סיום הניסוי. כל אחד מהתנאים המתאימים של הקוורופליטים יכול להיות מדומה באופן אינדיבידואלי או כממוצע או כסטיות סטנדרטיות על-ידי לחיצה על תיבות האפשרויות עבור סטיית הממוצע והתקן.
7. כדי לייצא נתוני אינדקס תאים לקובץ גיליון אלקטרוני, פתח קובץ גיליון אלקטרוני ריק, הצב את הסמן באמצע חלון ניתוח הנתונים ולחץ לחיצה ימנית. בתיבת הדו שמופיעה, בחר את האפשרות העתק נתונים לתבנית רשימהוהדבק את הנתונים בגיליון האלקטרוני הפתוח.
8. כוונן את הזמן בנתונים הגולמיים כדי לייצג את שעת ההתחלה בפועל של מדידת העכבה של התא. שעת ההתחלה של השלב השני מוגדרת כאפס.
   הערה: ליחידת הבקרה יש אפשרות להשיג את אינדקס התא עם או ללא נורמליזציה (כלומר, אינדקס תאים מנורמל) ולהמחיש את התוצאות כמצגת גרפית באופן תלוי-זמן. בדוגמה זו, נתוני אינדקס תאים מיוצאים ללא נורמליזציה לצורך עיבוד ומצגת גרפית.
9. שחררו את הניסוי על ידי לחיצה על לחצן השחרור בכל עריסה.

תוצאות

זה הוצע כי crk ו crk הם חשובים עבור הגירה תא ופלישה בתאי סרטן שונים^13,17. למרות crk ו crk חלבונים הם בצורה מבנית ופונקציונלית דומה זה לזה ולשחק פונקציות חופפים חיוניים^16,19,20,21, הרבה גנים המ, מחקרים ע...

Discussion

המדידה בזמן אמת של הגירה התא והפלישה באמצעות מערכת ניתוח התא בזמן אמת הוא תהליך פשוט, מהיר, ניטור רציף עם מספר רב, יתרונות משמעותיים על השיטות המסורתיות המספקים נתונים בנקודה אחת בזמן. כמו בשיטות המסורתיות, התנאים הניסיוניים חייבים להיות ממוטבים עבור כל קו תאים עבור מערכת ניתוח התא בזמן אמ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk siRNA	Dharmacon	J-010503-10
CrkL siRNA	Ambion	ID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)	ATCC	302002	Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	51030285	Co2 incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Non-targeting siRNA	Dharmacon	D-001810-01	siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)	LI-COR Biosciences		Western blot imaging system
RTCA software	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc		Instrument used for experiment
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for experiment