Misurazione in tempo reale dell'invasione e dell'invasione delle cellule tumorali basata sull'impedimento

Riepilogo

Il cancro è una malattia letale a causa della sua capacità di metastasi a diversi organi. Determinare la capacità delle cellule tumorali di migrare e invadere in varie condizioni di trattamento è fondamentale per valutare le strategie terapeutiche. Questo protocollo presenta un metodo per valutare le capacità metastatiche in tempo reale di una linea cellulare del cancro del glioblastoma.

Abstract

Il cancro nasce a causa della proliferazione incontrollata delle cellule iniziata dall'instabilità genetica, mutazioni e fattori ambientali e di altro tipo. Queste hanno acquisito anomalie in complesse reti di segnalazione molecolare a più livelli che inducono la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule aberranti, la degradazione della matrice extracellulare e la metastasi a organi distanti. Si stima che circa il 90% dei decessi correlati al cancro sia causato dagli effetti diretti o indiretti della diffusione metastatica. Pertanto, è importante stabilire un sistema altamente affidabile e completo per caratterizzare i comportamenti delle cellule tumorali sulle manipolazioni genetiche e ambientali. Tale sistema può dare una chiara comprensione della regolazione molecolare della metastasi del cancro e l'opportunità di sviluppare con successo strategie terapeutiche stratificate e precise. Pertanto, una determinazione accurata dei comportamenti delle cellule tumorali come la migrazione e l'invasione con guadagno o perdita di funzione dei geni consente di valutare la natura aggressiva delle cellule tumorali. Il sistema di misurazione in tempo reale basato sull'impedimento cellulare consente ai ricercatori di acquisire continuamente dati durante un intero esperimento e di confrontare e quantificare istantaneamente i risultati in varie condizioni sperimentali. A differenza dei metodi convenzionali, questo metodo non richiede fissazione, colorazione ed elaborazione del campione per analizzare le celle che migrano o invadono. Questo documento sul metodo enfatizza le procedure dettagliate per la determinazione in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali del glioblastoma.

Introduzione

Il cancro è una malattia letale a causa della sua capacità di metastasi a diversi organi. Determinare i genotipi e i fenotipi del cancro è fondamentale per comprendere e progettare strategie terapeutiche efficaci. Decenni di ricerca sul cancro hanno portato allo sviluppo e all'adattamento di diversi metodi per determinare i genotipi e i fenotipi del cancro. Uno degli ultimi sviluppi tecnici è la misurazione in tempo reale della migrazione cellulare e dell'invasione basata sull'impedimento cellulare. L'adesione cellulare ai substrati e ai contatti cellulare svolge un ruolo importante nella comunicazione e nella regolazione cellulare-cellulare, nello sviluppo e nella manutenzione dei tessuti. Le anomalie nell'adesione cellulare portano alla perdita del contatto cellulare, alla degradazione della matrice extracellulare (ECM), e al guadagno di capacità migratorie e invasive da parte delle cellule, che contribuiscono alla metastasi delle cellule tumorali a diversi organi^1,2. Sono disponibili vari metodi per determinare la migrazione cellulare (guarigione delle ferite e saggi della camera di Boyden) e l'invasione (saggio della camera Matrigel-Boyden)^3,4^,5.⁵ Questi metodi convenzionali sono semiquantitativi perché le cellule devono essere etichettate con un colorante fluorescente o altri coloranti prima o dopo l'esperimento per misurare i fenotipi cellulari. Inoltre, sono necessari disturbi meccanici in alcuni casi per la creazione di una ferita per misurare la migrazione delle cellule al sito della ferita. Inoltre, questi metodi esistenti richiedono molto tempo, richiedono molto lavoro e misurano i risultati in un solo momento. Inoltre, questi metodi sono inclini a effettuare misurazioni imprecise a causa di una manipolazione incoerente durante la procedura sperimentale⁶.

A differenza dei metodi convenzionali, il sistema di analisi cellulare in tempo reale misura l'impedimento cellulare in tempo reale senza richiedere danni pre o post-staining e meccanici delle cellule. Ancora più importante, la durata di un esperimento può essere estesa in modo che gli effetti biologici possano essere determinati in modo dipendente dal tempo. L'esecuzione dell'esperimento è efficiente in termini di tempo e non richiede molto lavoro. L'analisi dei dati è relativamente semplice e accurata. Rispetto ad altri metodi, questo metodo è una delle migliori misurazioni in tempo reale per misurare la migrazione cellulare e l'invasione^6,7,8,9.

Giaever e Keese sono stati i primi a descrivere la misurazione basata sull'impedanza di una popolazione cellulare sulla superficie degli elettrodi¹⁰. Il sistema di analisi cellulare in tempo reale funziona sullo stesso principio. L'area di ogni pozzo di micropiastra è circa l'80% coperto da una serie di microelettrodi d'oro. Quando la superficie dell'elettrodo è occupata dalle cellule a causa dell'aderenza o della diffusione delle cellule, l'impedimento elettrico cambia. Questo impedimento viene visualizzato come indice cellulare, che è direttamente proporzionale alle cellule che coprono la superficie dell'elettrodo dopo che penetrano la membrana microporosa (la dimensione mediana dei pori di questa membrana è di 8 m)¹¹.

Crk e CrkL sono proteine adattatori e contenenti domini SH2 e SH3 e svolgono ruoli importanti in varie funzioni cellulari, come la regolazione del citoscheletro, la trasformazione cellulare, la proliferazione, l'adesione, la transizione epiteliale-mesenchy, la migrazione, l'invasione e la metastasi mediando le interazioni proteina-proteina in molte vie di segnalazione^{1,12,13,14,15,}16^{,1717. 18}. Pertanto, è importante determinare le capacità migratorie e invasive dipendenti da Crk/CrkL delle cellule tumorali. L'analisi cellulare in tempo reale è stata eseguita per determinare le capacità migratorie e invasive delle cellule glioblastoma al knockdown genico di Crk e CrkL.

Questo documento di metodo descrive misurazioni dettagliate della migrazione mediata da Crk- e CrkL e l'invasione delle cellule glioblastoma umane.

Protocollo

NOT: Tutti i materiali di coltura cellulare devono essere sterili e l'intero esperimento deve essere eseguito in un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.

1. Cultura ed elettroporazione della linea cellulare Glioblastoma U-118MG

1. Cultura la linea cellulare U-118MG nel siero bovino fetale 5% (FBS) contenente Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (mezzo di coltura) e Mantenere a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umida contenente il 5% di incubatore di CO₂ (condizioni di coltura).
2. Utilizzare 70– 80% cellule sane confluenti per l'elettroporazione.
3. Per le cellule di raccolta, lavare le cellule che crescono in piatti di coltura con 1x PBS e aggiungere 2 mL di 0.05% trypsin-EDTA. Mettere nell'incubatrice per 30 s e rimuovere la trypsin-EDTA. Raccogliere le cellule nel mezzo di coltura in un tubo da 15 mL.
4. Contare le cellule usando un contatore cellulare automatizzato portatile, centrifugare le cellule a 100 x g per 5 min, e scartare il supernatale.
5. Sospendere il pellet cellulare nel mezzo di coltura e prendere 600.000 cellule per ogni condizione in un tubo di microcentrismo. Regolare il numero di cella in base ai progetti sperimentali e ai tassi di crescita.
6. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrismo e aggiungere 800 l of Dulbecco's fosfated-buffered salina (DPBS). Girare verso il basso con una minicentrifuga per 30 s e scartare il supernatante.
7. Aggiungere al pellet cellulare 60 ll di buffer di sospensione e aggiungere i siRNA (ad esempio siRNA non targeting, siRNA Crk, siRNA CrkL o entrambi siRNA Crk e CrkL) ad una concentrazione di 6 m al rispettivo tubo di microfusione. Mescolare delicatamente toccando.
8. Elettroporate 10 -L di cellule con un sistema di elettroporazione a 1.350 V per 10 ms con tre impulsi e trasferire le cellule elettropolrate in 5 mL del mezzo di coltura. Ripetere l'elettroporazione per il resto delle cellule preparate per ogni condizione.
9. Completare tutta l'elettroporazione. Trasferire le cellule elettroporate in due piatti da 35 mm per condizione e colture in condizioni di coltura per 3 giorni.
10. Il terzo giorno, trattare tutte le cellule elettroporate in 0,5% FBS contenenti DMEM (medio siero basso) per 6 h prima della misurazione effettiva dell'impendenza cellulare.

2. Preparazione del sistema di analisi cellulare in tempo reale, delle piastre CIM (Cell Invasion and Migration) e delle celle U-118MG elettroporate per la placcatura

1. Collocare il sistema di analisi cellulare in tempo reale in un incubatore di CO₂ in condizioni di coltura 5–6 h prima dell'inizio dell'esperimento per stabilizzare il sistema alle condizioni di coltura.
2. Per il test di invasione, piatto 50 -L di DMEM (mezzo semplice) contenente gel a matrice extracellulare (ECM) a 0,1 g/l in ogni pozzetto della camera superiore della piastra CIM. Per evitare di avere bolle d'aria, utilizzare il metodo di pipettatura inversa. Rimuovere immediatamente 30 l di gel ECM, lasciando 20 .L nel pozzo.
3. Dopo il rivestimento in gel ECM, tenere la piastra nell'incubatrice in condizioni di coltura per 4 ore con il coperchio. Durante il rivestimento e l'essiccazione in gel ECM, adottare misure preventive per evitare il contatto diretto degli elettrodi della camera superiore delle piastre con le mani, le superfici dell'armadio di biosicurezza o l'incubatrice di CO_2.
4. Per impostare il programma di misurazione dell'imputazione, fare doppio clic sull'icona del software associato (vedere Tabella dei materiali) per aprire l'applicazione software di sistema (unità di controllo). Ogni culla ha una singola finestra con schede diverse per impostare le condizioni sperimentali, l'impedimento dell'intervallo di tempo di misurazione e della durata e l'analisi dei dati.
5. Nella scheda Layout, impostare i pozze di quadruplicazione per ogni condizione biologica e impostare le misurazioni di impedimento delle celle in due fasi nella scheda Pianificazione. Il primo passo è per una misurazione una tantando della linea di base (uno sweep con un intervallo di 1 min), e il secondo passo è quello di misurare l'impedimento cellulare nelle rispettive culle individuali per un esperimento vero e proprio. Per la migrazione, utilizzare 145 sweep con un intervallo di 10 min, e per l'invasione, 577 spazza con un intervallo di 10 min, impostato singolarmente) nelle rispettive culle individuali.
6. Una h prima dell'inizio della misurazione dell'impedibile cellulare, aggiungere 160 L di DMEM con 10% FBS come chemioattraente nei pozzi della camera inferiore della piastra. Assemblare la camera superiore contenente i pozzi rivestiti in gel ECM o i pozzi non rivestiti con la camera inferiore per misurare rispettivamente l'invasione e la migrazione.
7. Riempire i pozze nella camera superiore con 50 gradi l di medio siero basso e metterli nella culla del sistema. Verificare se tutti i pozzi vengono riconosciuti dall'unità di controllo facendo clic sulla scheda Messaggio. Se il messaggio viene visualizzato come OK, la targa nella culla è pronta per l'esperimento.
8. Preincubare le piastre completamente imballate nell'incubatrice in condizioni di coltura per 1 h prima delle misurazioni nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale, che è essenziale per l'acclimatamento di una piastra imballata alle condizioni di coltura cellulare.
9. Per le cellule di raccolta trattate con un mezzo di siero basso, provare le cellule come al punto 1.3, raccoglierle in un mezzo di siero basso e contare le cellule come nel punto 1.4.
10. Dopo il conteggio, centrifugare le cellule a 100 x g per 5 min e scartare il super-natante.
11. Risolvi 800.000 cellule in 800 - L di medio siero basso per i saggi di migrazione e invasione. Inoltre, risospendere 300.000 cellule in 2 mL di mezzo di coltura e semi in una parabola da 35 mm per l'analisi delle macchie occidentali per confermare l'abbattimento regolamentato di Crk e CrkL.

3. Lettura di base, semina delle cellule e misurazione e visualizzazione dell'impotenza cellulare

1. Misurare la lettura della linea di base facendo clic sul pulsante Start della culla. La linea di base deve essere letta dopo aver preincubato le piastre per 1 h nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale in condizioni di coltura nell'incubatrice di CO₂ e prima di semine delle cellule ai rispettivi pozzi nella camera superiore.
   NOT: Una volta fatto clic sul pulsante Start della culla, l'unità di controllo chiederà se salvare il file sperimentale. Dopo aver salvato il file, l'analizzatore culla misura l'impedibile della cella di base come impostato nel programma inizialmente ed entra in modalità pausa fino a quando non viene fatto di nuovo clic sul pulsante Start della culla per misurare l'impedito cellulare nel secondo passaggio.
2. Estrarre entrambe le piastre per la migrazione e l'invasione dalle culle dopo la misurazione di base e tenerle nell'armadietto della biosicurezza.
3. Seme 100 L di cellule (100,000 cellule) in quadruplicati per ogni condizione biologica nella camera superiore della piastra CIM nei rispettivi pozzi, come programmato nell'unità di controllo della culla invertendo pipetting per evitare bolle d'aria.
4. Dopo la semina, tenere la piastra sotto un armadietto di biosicurezza per 30 min a temperatura ambiente per consentire alle cellule di stabilirsi uniformemente sul fondo. Trasferire la piastra sulla rispettiva culla e fare clic sul pulsante di avvio della culla per iniziare a misurare l'impedimento cellulare come programmato nel secondo passaggio di 2.5.
5. Al termine dell'ultima sweep, l'esperimento viene completato e i risultati vengono salvati automaticamente.
6. Nella scheda Analisi dati, visualizzate le modifiche nell'impedimento delle celle come indice delle celle in modo dipendente dal tempo durante o dopo il completamento dell'esperimento. Ognuna delle rispettive condizioni dei quadruplicati può essere visualizzata singolarmente o come medie e/o deviazioni standard facendo clic sulle caselle Opzione per la media e la deviazione standard.
7. Per esportare i dati dell'indice di cella in un file di foglio di calcolo, aprire un file di foglio di calcolo vuoto, posizionare il cursore al centro della finestra Analisi dati e fare clic con il pulsante destro del mouse. Nella finestra di dialogo visualizzata scegliere l'opzione Copia dati in Formato elencoe incollare i dati nel foglio di calcolo aperto.
8. Regolare l'ora nei dati grezzi per rappresentare l'ora di inizio effettiva della misurazione dell'impendenza della cella. L'ora di inizio del secondo passaggio è impostata su zero.
   NOT: L'unità di controllo ha la possibilità di ottenere l'indice della cella con o senza normalizzazione (cioè indice di cella normalizzato) e visualizzare i risultati come presentazione grafica in modo dipendente dal tempo. In questo esempio, i dati dell'indice di cella vengono esportati senza normalizzazione per l'elaborazione e la presentazione grafica.
9. Rilasciare l'esperimento facendo clic sul pulsante Rilascia in ogni culla.

Risultati

È stato suggerito che Crk e CrkL sono importanti per la migrazione cellulare e l'invasione in diverse linee cellulari tumorali^13,17. Anche se le proteine Crk e CrkL sono strutturalmente e funzionalmente simili tra loro e svolgono funzioni sovrapposte essenziali^16,19,20^,21, molti studi di abbattimento genico per Crk e CrkL non hanno chiaramente affrontato se i...

Discussione

La misurazione in tempo reale della migrazione e dell'invasione cellulare utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale è un processo di monitoraggio semplice, rapido e continuo con molteplici e significativi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali che forniscono dati in un singolo momento. Come per i metodi tradizionali, le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate per ogni linea cellulare per il sistema di analisi cellulare in tempo reale, perché ogni linea cellulare può essere diversa in termi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk siRNA	Dharmacon	J-010503-10
CrkL siRNA	Ambion	ID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)	ATCC	302002	Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	51030285	Co2 incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Non-targeting siRNA	Dharmacon	D-001810-01	siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)	LI-COR Biosciences		Western blot imaging system
RTCA software	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc		Instrument used for experiment
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for experiment