Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

Zusammenfassung

Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung der Fähigkeit von Krebszellen, unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu wandern und einzudringen, ist entscheidend für die Beurteilung therapeutischer Strategien. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der metastasierenden Fähigkeiten einer Glioblastom-Krebszelllinie in Echtzeit dar.

Zusammenfassung

Krebs entsteht durch unkontrollierte Proliferation von Zellen, die durch genetische Instabilität, Mutationen sowie Umwelt- und andere Stressfaktoren ausgelöst werden. Diese erworbenen Anomalien in komplexen, mehrschichtigen molekularen Signalnetzwerken induzieren aberrante Zellproliferation und Überleben, extrazellulären Matrixabbau und Metastasierung enferner Organe. Schätzungen zufolge werden etwa 90 % der krebsbedingten Todesfälle durch die direkten oder indirekten Auswirkungen der metastasierenden Verbreitung verursacht. Daher ist es wichtig, ein hochzuverlässiges, umfassendes System zur Charakterisierung des Verhaltens von Krebszellen bei genetischen und Umweltmanipulationen zu etablieren. Ein solches System kann ein klares Verständnis der molekularen Regulation von Krebsmetastasen und die Möglichkeit für eine erfolgreiche Entwicklung geschichteter, präziser therapeutischer Strategien vermitteln. Daher ermöglicht eine genaue Bestimmung von Krebszellverhalten wie Migration und Invasion mit Gewinn oder Verlust der Funktion der Gene(n) die Beurteilung der aggressiven Natur von Krebszellen. Das auf Derimpedanz basierende Echtzeit-Messsystem ermöglicht es Forschern, während eines ganzen Experiments kontinuierlich Daten zu erfassen und die Ergebnisse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen sofort zu vergleichen und zu quantifizieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden erfordert diese Methode keine Fixierung, Färbung und Probenverarbeitung, um Zellen zu analysieren, die migrieren oder eindringen. Dieses Methodenpapier legt den Schwerpunkt auf detaillierte Verfahren zur Echtzeitbestimmung der Migration und Invasion von Glioblastom-Krebszellen.

Einleitung

Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung von Krebsgenotypen und Phänotypen ist entscheidend für das Verständnis und die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien. Jahrzehnte der Krebsforschung haben zur Entwicklung und Anpassung verschiedener Methoden zur Bestimmung von Krebsgenotypen und Phänotypen geführt. Eine der neuesten technischen Entwicklungen ist die Echtzeitmessung der Zellmigration und -invasion auf der Grundlage der Zellimpedanz. Die Zellhaftung an Substraten und Zell-Zell-Kontakten spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-zu-Zell-Kommunikation und -Regulierung, Entwicklung und Pflege von Geweben. Anomalien in der Zelladhäsion führen zum Verlust des Zell-Zell-Kontakts, zum Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) und zur Verstärkung von Migrations- und Invasionsfähigkeiten durch Zellen, die alle zur Metastasierung von Krebszellen in verschiedene Organe beitragen^1,2. Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung, um die Zellmigration (Wundheilung und Boyden-Kammer-Assays) und Invasion (Matrigel-Boyden Chamber Assay)^3,4,5zu bestimmen. Diese konventionellen Methoden sind semiquantitativ, da Zellen vor oder nach dem Experiment mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder anderen Farbstoffen gekennzeichnet werden müssen, um Zellphänotypen zu messen. Darüber hinaus sind in einigen Fällen mechanische Störungen erforderlich, um eine Wunde zur Messung der Migration von Zellen an die Wundstelle zu bilden. Darüber hinaus sind diese bestehenden Methoden zeitaufwändig, arbeitsintensiv und messen die Ergebnisse nur zu einem Zeitpunkt. Darüber hinaus sind diese Methoden anfällig für ungenaue Messungen aufgrund inkonsistenter Handhabung während des experimentellen Verfahrens⁶.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden misst das Echtzeit-Zellanalysesystem die Zellimpedanz in Echtzeit, ohne dass eine Vor- oder Nachfärbung und mechanische Beschädigung von Zellen erforderlich ist. Noch wichtiger ist, dass die Dauer eines Experiments verlängert werden kann, so dass biologische Effekte zeitabhängig bestimmt werden können. Die Durchführung des Experiments ist zeiteffizient und nicht arbeitsintensiv. Die Analyse von Daten ist relativ einfach und genau. Im Vergleich zu anderen Methoden ist diese Methode eine der besten Echtzeitmessungen zur Messung der Zellmigration und Invasion^6,7,8,9.

Giaever und Keese waren die ersten, die die Impedanz-basierte Messung einer Zellpopulation auf der Oberfläche von Elektroden^{10 beschrieben.} Das Echtzeit-Zellanalysesystem arbeitet nach dem gleichen Prinzip. Die Fläche jedes Mikroplattenbrunnens ist zu ca. 80% mit einer Reihe von Goldmikroelektroden bedeckt. Wenn die Elektrodenoberfläche aufgrund der Haftung oder Desasion der Zellen von Zellen belegt wird, ändert sich die elektrische Impedanz. Diese Impedanz wird als Zellindex angezeigt, der direkt proportional zu den Zellen ist, die die Elektrodenoberfläche abdecken, nachdem sie die mikroporöse Membran durchdrungen haben (die mittlere Porengröße dieser Membran beträgt 8 m)¹¹.

Crk und CrkL sind Adapterproteine, die SH2- und SH3-Domänen enthalten und spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Funktionen, wie Zytoskelettregulation, Zelltransformation, Proliferation, Adhäsion, epithelialer-mesenchymaler Übergang, Migration, Invasion und Metastasierung durch Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vielen Signalwegen^{1,12,13,14,15,16,17, 18}. Daher ist es wichtig, die Crk/CrkL-abhängigen Migrations- und invasiven Fähigkeiten von Krebszellen zu bestimmen. Die Echtzeit-Zellanalyse wurde durchgeführt, um die migrations- und invasiven Fähigkeiten von Glioblastomzellen nach dem Gen-Knockdown von Crk und CrkL zu bestimmen.

Dieses Methodenpapier beschreibt detaillierte Messungen der crk- und CrkL-vermittelten Migration und Invasion menschlicher Glioblastomzellen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Zellkulturmaterialien müssen steril sein und das gesamte Experiment muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Kultur und Elektroporation der U-118MG Glioblastom-Zelllinie

1. Kultur die U-118MG-Zelllinie in 5% fetalem Rinderserum (FBS), das Dulbeccoes Modified Eagle Medium (DMEM) (Kulturmedium)₂ enthält, und Bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre halten, die 5% CO2-Inkubator (Kulturbedingungen) enthält.
2. Verwenden Sie 70– 80% konfluente gesunde Zellen für die Elektroporation.
3. Für die Ernte von Zellen, waschen Sie die Zellen, die in Kulturgerichten mit 1x PBS wachsen, und fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzu. Legen Sie in den Inkubator für 30 s und entfernen Sie die Trypsin-EDTA. Sammeln Sie Zellen im Kulturmedium in einem 15 ml Rohr.
4. Zählen Sie die Zellen mit einem handgeführten automatisierten Zellzähler, Zentrifugenzellen bei 100 x g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand.
5. Setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium aus und nehmen Sie 600.000 Zellen für jede Bedingung in ein Mikrozentrifugenrohr. Passen Sie die Zellenzahl in Abhängigkeit von experimentellen Designs und Wachstumsraten an.
6. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie 800 L der Phosphat-gepufferten Saline (DPBS) von Dulbecco hinzu. Drehen Sie mit einer Minizentrifuge für 30 s nach unten und entsorgen Sie den Überstand.
7. Fügen Sie dem Zellpellet 60 l Resuspensionspuffer R hinzu und fügen Sie die siRNAs (d. h. nicht zielgerichtete siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA oder crk und CrkL siRNAs) mit einer Konzentration von 6 M in das jeweilige Mikrozentrifugenrohr ein. Mischen Sie sie sanft durch Tippen.
8. Elektropoat 10 l Zellen mit einem Elektroporationssystem bei 1.350 V für 10 ms mit drei Impulsen und übertragen die elektropoierten Zellen in 5 ml des Kulturmediums. Wiederholen Sie die Elektroporation für die restlichen Zellen, die für jede Bedingung vorbereitet sind.
9. Vervollständigen Sie alle entsprechenden Elektroporationen. Übertragen Sie elektropoierte Zellen in zwei 35 mm Gerichte pro Zustand und kulturkultural für 3 Tage.
10. Behandeln Sie am dritten Tag alle elektropoierten Zellen in 0,5% FBS, die DMEM (niedriges Serummedium) enthalten, 6 h vor der eigentlichen Messung der Zellimpedanz.

2. Vorbereitung des Echtzeit-Zellanalysesystems, Zellinvasions- und -migrationsplatten (CIM) und elektropoierter U-118MG-Zellen zur Beschichtung

1. Platzieren Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem₂ in einem CO2-Inkubator unter Kulturbedingungen 5–6 h vor Dem Beginn des Experiments, um das System an die Kulturbedingungen zu stabilisieren.
2. Für den Invasionstest die Platte 50 l DMEM (einfaches Medium) mit extrazellulärem Matrix-Gel (ECM) bei 0,1 g/l in jeder Bohrung der oberen Kammer der CIM-Platte. Um Luftblasen zu vermeiden, verwenden Sie die Reverse Pipetting-Methode. Entfernen Sie sofort 30 l ECM-Gel, so dass 20 l im Brunnen bleiben.
3. Nach der ECM-Gelbeschichtung die Platte im Inkubator unter Kulturbedingungen für 4 h mit eingeschaltetem Deckel aufbewahren. Während der ECM-Gelbeschichtung und -trocknung vorbeugende Maßnahmen ergreifen, um einen direkten Kontakt der Elektroden der oberen Kammer₂ der Platten mit den Händen, den Oberflächen des Biosicherheitsschranks oder des CO2-Inkubators zu vermeiden.
4. Um das Impedanzmessprogramm einzurichten, doppelklicken Sie auf das zugehörige Softwaresymbol (siehe Tabelle der Materialien), um die Systemsoftwareanwendung (Steuereinheit) zu öffnen. Jede Wiege verfügt über ein individuelles Fenster mit unterschiedlichen Registerkarten, um die experimentellen Bedingungen, das Impedanzmessintervall und die Dauer sowie die Datenanalyse festzulegen.
5. Legen Sie unter der Registerkarte Layout Quadruplicate-Bohrungen für jeden biologischen Zustand fest, und legen Sie zweistufige Zellimpedanzmessungen unter der Registerkarte Zeitplan fest. Der erste Schritt ist eine einmalige Basismessung (ein Sweep mit einem Intervall von 1 min), und der zweite Schritt besteht darin, die Zellimpedanz in den jeweiligen einzelnen Wiegen für ein tatsächliches Experiment zu messen. Für die Migration verwenden Sie 145 Sweeps mit einem Intervall von 10 min, und für die Invasion 577 Sweeps mit einem 10 min Intervall, einzeln eingestellt) in den jeweiligen einzelnen Wiegen.
6. Ein h vor Beginn der Zellimpedanzmessung fügen Sie 160 l DMEM mit 10% FBS als Chemoattraktion in den Brunnen der unteren Kammer der Platte hinzu. Montieren Sie entweder die obere Kammer mit den ECM-Gel-beschichteten Brunnen oder unbeschichtete Brunnen mit der unteren Kammer, um Invasion bzw. Migration zu messen.
7. Füllen Sie die Brunnen in der oberen Kammer mit 50 l niedrigem Serummedium und legen Sie sie in die Wiege des Systems. Überprüfen Sie, ob alle Brunnen von der Steuereinheit erkannt werden, indem Sie auf die Registerkarte Nachricht klicken. Wenn die Meldung als OKangezeigt wird, ist die Platte in der Wiege für das Experiment bereit.
8. Die vollständig verpackten Platten im Inkubator unter Kulturbedingungen vor Messungen in der In-Time-Zellanalyse-System-Wiege voranlegen, was für die Akklimatisierung einer verpackten Platte an die Zellkulturbedingungen unerlässlich ist.
9. Für die Ernte von Zellen, die mit niedrigem Serummedium behandelt werden, versuchen Sie die Zellen wie in Schritt 1.3, sammeln Sie sie in niedrigem Serummedium und zählen Sie die Zellen wie in Schritt 1.4.
10. Zentrifugenzellen nach dem Zählen 5 min bei 100 x g und den Überstand entsorgen.
11. Setzen Sie 800.000 Zellen in 800 L niedrigem Serummedium für die Migrations- und Invasionstests aus. Zusätzlich, resuspend 300,000 Zellen in 2 ml Kulturmedium und Samen in einer 35 mm Schale für Western Blot Analyse, um die regulierte Knockdown von Crk und CrkL zu bestätigen.

3. Baseline-Lesung, Seeding der Zellen und Zellimpedanzmessung und -visualisierung

1. Messen Sie den Basiswert, indem Sie auf die Schaltfläche "Start in der Wiege" klicken. Die Grundlinie sollte nach der Vorinkubation der Platten für 1 h in der Wiege des Echtzeit-Zellanalysesystems unter Kulturbedingungen im CO2-Inkubator und vor dem Aussaat der Zellen an die jeweiligen Brunnen in der oberen Kammer gelesen werden.
   HINWEIS: Sobald auf die Schaltfläche "Start" der Wiege geklickt wurde, fragt das Steuergerät, ob die experimentelle Datei gespeichert werden soll. Nachdem die Datei gespeichert wurde, misst der Wiegeanalysator die im Programm festgelegte Grundwertzellenimpedanz und wechselt in den Pausenmodus, bis im zweiten Schritt erneut auf die Schaltfläche "Start" der Wiege geklickt wird, um die Zellimpedanz zu messen.
2. Nehmen Sie beide Platten für Migration und Invasion aus den Wiegen nach der Basismessung heraus und halten Sie sie im Biosicherheitsschrank.
3. Samen 100 l Zellen (100.000 Zellen) in Quadruplizierten für jeden biologischen Zustand in der oberen Kammer der CIM-Platte in den jeweiligen Brunnen, wie in der Steuereinheit der Wiege durch umgekehrte Pipettierung programmiert, um Luftblasen zu vermeiden.
4. Nach der Aussaat die Platte 30 min bei Raumtemperatur unter einem Biosicherheitsschrank aufbewahren, damit sich die Zellen gleichmäßig nach unten absetzen können. Übertragen Sie die Platte zurück auf die jeweilige Wiege und klicken Sie auf die Wiegestarttaste, um die im zweiten Schritt 2.5 programmierte Messzellenimpedanz wie programmiert zu starten.
5. Nach dem letzten Sweep ist das Experiment abgeschlossen, und die Ergebnisse werden automatisch gespeichert.
6. Visualisieren Sie auf der Registerkarte Datenanalyse die Änderungen der Zellimpedanz als Zellindex zeitabhängig während oder nach Abschluss des Experiments. Jede der jeweiligen Bedingungen von Quadruplizierten kann entweder einzeln oder als Mittelwerte und/oder Standardabweichungen visualisiert werden, indem Sie auf die Optionsfelder für Durchschnitts- und Standardabweichungen klicken.
7. Um Zellindexdaten in eine Tabellenkalkulationsdatei zu exportieren, öffnen Sie eine leere Tabellenkalkulationsdatei, platzieren Sie den Cursor in der Mitte des Fensters Datenanalyse, und klicken Sie mit der rechten Maustaste. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld die Option Daten in listenformat kopierenaus, und fügen Sie die Daten in die geöffnete Kalkulationstabelle ein.
8. Passen Sie die Zeit in den Rohdaten an, um die tatsächliche Startzeit der Zellenimpedanzmessung darzustellen. Die Startzeit im zweiten Schritt wird als Null festgelegt.
   HINWEIS: Das Steuergerät hat die Möglichkeit, den Zellindex mit oder ohne Normalisierung (d. h. normalisierter Zellindex) zu erhalten und die Ergebnisse zeitabhängig als grafische Darstellung zu visualisieren. In diesem Beispiel werden Zellindexdaten ohne Normalisierung für die Verarbeitung und grafische Darstellung exportiert.
9. Lösen Sie das Experiment, indem Sie in jeder Wiege auf die Schaltfläche "Freigeben" klicken.

Ergebnisse

Es wurde vorgeschlagen, dass Crk und CrkL sind wichtig für die Zellmigration und Invasion in verschiedenen Krebszelllinien^13,17. Obwohl Crk- und CrkL-Proteine strukturell und funktional einander ähnlich sind und wesentliche überlappende Funktionen^16,19,20,21spielen, haben viele Gen-Knockdown-Studien für Crk und CrkL nicht klar anges...

Diskussion

Die Echtzeitmessung der Zellmigration und -invasion mit hilfe des Echtzeit-Zellanalysesystems ist ein einfacher, schneller und kontinuierlicher Überwachungsprozess mit mehreren, signifikanten Vorteilen gegenüber den herkömmlichen Methoden, die Daten zu einem einzigen Zeitpunkt bereitstellen. Wie bei den herkömmlichen Methoden müssen die experimentellen Bedingungen für jede Zelllinie für das Echtzeit-Zellanalysesystem optimiert werden, da jede Zelllinie hinsichtlich ihrer Haftung auf dem Substrat, dem Wachstum, den...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk siRNA	Dharmacon	J-010503-10
CrkL siRNA	Ambion	ID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)	ATCC	302002	Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	51030285	Co2 incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Non-targeting siRNA	Dharmacon	D-001810-01	siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)	LI-COR Biosciences		Western blot imaging system
RTCA software	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc		Instrument used for experiment
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for experiment