Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kanser, farklı organlara metastaz yeteneği nedeniyle ölümcül bir hastalıktır. Kanser hücrelerinin çeşitli tedavi koşulları altında göç ve işgal yeteneğini belirlemek terapötik stratejilerin değerlendirilmesi için çok önemlidir. Bu protokol glioblastoma kanser hücre hattının gerçek zamanlı metastatik yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunar.

Özet

Kanser genetik istikrarsızlık, mutasyonlar ve çevresel ve diğer stres faktörleri tarafından başlatılan hücrelerin kontrolsüz çoğalması nedeniyle ortaya çıkar. Karmaşık, çok katmanlı moleküler sinyal ağlarında elde edilen bu anormallikler anormal hücre çoğalması ve sağkalım, hücre dışı matriks bozulması ve uzak organlara metastaz neden olur. Kansere bağlı ölümlerin yaklaşık %90'ının metastatik yayılmanın doğrudan veya dolaylı etkilerinden kaynaklandığı tahmin edilmektedir. Bu nedenle, genetik ve çevresel manipülasyonlar üzerine kanser hücresi davranışlarını karakterize etmek için son derece güvenilir, kapsamlı bir sistem kurmak önemlidir. Böyle bir sistem kanser metastazımoleküler düzenleme ve tabakalı, hassas tedavi stratejilerinin başarılı gelişimi için fırsat net bir anlayış verebilir. Bu nedenle, gen (ler) kazanç veya fonksiyon kaybı ile göç ve invazyon gibi kanser hücresi davranışlarının doğru belirlenmesi kanser hücrelerinin agresif doğasının değerlendirilmesini sağlar. Hücre empedansına dayalı gerçek zamanlı ölçüm sistemi, araştırmacıların tüm deney sırasında sürekli olarak veri edinmelerine ve çeşitli deneysel koşullar altında sonuçları anında karşılaştırmalarına ve ölçmelerine olanak tanır. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu yöntem göç eden veya istila eden hücreleri analiz etmek için fiksasyon, boyama ve numune işleme gerektirmez. Bu yöntem kağıt göç ve glioblastoma kanser hücrelerinin invazyonu gerçek zamanlı belirlenmesi için ayrıntılı prosedürleri vurgulamaktadır.

Giriş

Kanser, farklı organlara metastaz yeteneği nedeniyle ölümcül bir hastalıktır. Kanser genotipleri ve fenotiplerinin belirlenmesi, etkili tedavi stratejilerinin anlaşılması ve tasarlanması açısından önemlidir. Onlarca yıllık kanser araştırmaları, kanser genotipleri ve fenotiplerini belirlemek için farklı yöntemlerin geliştirilmesine ve uyarlanındı. En son teknik gelişmelerden biri hücre empedansı dayalı hücre göçü ve invazyonu gerçek zamanlı ölçüm. Hücre adezyonu substratlar ve hücre-hücre temasları hücre-hücre iletişimi ve düzenlenmesi, geliştirilmesi ve dokuların bakımında önemli bir rol oynar. Hücre adezyonu anormallikleri hücre-hücre teması nın kaybına yol açar, hücre dışı matriks bozulması (ECM), ve hücreler tarafından göç ve işgal yetenekleri kazanç, hepsi farklı organlara kanser hücrelerinin metastazıkatkıda1,2. Çeşitli yöntemler hücre göçü belirlemek için kullanılabilir (yara iyileşmesi ve Boyden odası tahlilleri) ve invazyon (Matrigel-Boyden oda tahlil)3,4,5. Hücre fenotiplerini ölçmek için deneyden önce veya sonra hücrelerin floresan boya veya diğer boyalarla etiketlenmeleri gerektiğinden, bu geleneksel yöntemler yarı kantitatiftir. Buna ek olarak, bazı durumlarda hücrelerin yara bölgesine geçişini ölçmek için bir yara oluşturmak için mekanik bozulmalara ihtiyaç vardır. Ayrıca, bu mevcut yöntemler zaman alıcı, emek yoğun ve sadece bir zaman noktada sonuçları ölçmek. Buna ek olarak, bu yöntemler deneysel prosedür6sırasında tutarsız işleme nedeniyle yanlış ölçümler yapmaya eğilimlidir.

Geleneksel yöntemlerin aksine, gerçek zamanlı hücre analiz sistemi hücrelerin ön veya poststaining ve mekanik hasar gerektirmeden gerçek zamanlı hücre empedansını ölçer. Daha da önemlisi, biyolojik etkilerin zamana bağlı bir şekilde belirlenebilmeleri için bir deneyin süresi uzatılabilir. Denemenin yürütülmesi zaman etkindir ve emek yoğun değildir. Verileri analiz etmek nispeten basit ve doğrudur. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem hücre göç ve invazyonuölçmekiçin en iyi gerçek zamanlı ölçümler biridir 6,7,8,9.

Giaever ve Keese elektrotlar yüzeyinde bir hücre popülasyonunun empedans tabanlı ölçüm tanımlamak için ilk10. Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi aynı prensipte çalışır. Her mikroplaka kuyunun alanı yaklaşık % 80 altın mikroelektrotlar bir dizi ile kaplıdır. Elektrot yüzey alanı, hücrelerin yapışması veya yayılması nedeniyle hücreler tarafından işgal edildiğinde, elektriksel empedans değişir. Bu empedans, mikro gözenekli membrana girdikten sonra elektrot yüzey alanını kaplayan hücrelerle doğru orantılı olan hücre indeksi olarak görüntülenir (bu zarın ortanca gözenek boyutu 8 μm'dir)11.

Crk ve CrkL, SH2 ve SH3 etki alanlarını içeren adaptör proteinlerdir ve sitoiskelet düzenlemesi, hücre dönüşümü, çoğalma, yapışma, epitel-mezenkimal geçiş, göç, invazyon ve metastaz gibi çeşitli hücresel fonksiyonlarda önemli rol oynayan birçok sinyal yolu 1,12,13,14,15,16,17,17 18 yaşında. Bu nedenle, kanser hücrelerinin Crk/CrkL'ye bağımlı göçmen ve invaziv yeteneklerini belirlemek önemlidir. Crk ve CrkL'nin gen nakavtı üzerine glioblastoma hücrelerinin göçmen ve invaziv yeteneklerini belirlemek için gerçek zamanlı hücre analizi yapıldı.

Bu yöntem ödevinde Crk ve CrkL aracılı göç ve insan glioblastom hücrelerinin invazyonunun ayrıntılı ölçümleri açıklanmaktadır.

Protokol

NOT: Tüm hücre kültürü materyalleri steril olmalı ve tüm deney steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.

1. U-118MG Glioblastoma Hücre Hattının Kültürü ve Elektroporasyonu

  1. Kültür U-118MG hücre hattı 5% fetal sığır serumu (FBS) Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM) içeren ve 37 °C nemli bir atmosferde% 5 CO2 kuluçka (kültür koşulları) içeren koruyun.
  2. Elektroporasyon için %70-80 eşzamanlı sağlıklı hücre kullanın.
  3. Hasat hücreleri için kültür yemeklerinde yetişen hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve %0,05 tripsin-EDTA'dan 2 mL ekleyin. 30 s için kuvöz yerleştirin ve tripsin-EDTA çıkarın. Kültür ortamındaki hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
  4. El otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın, 5 dakika için 100 x g'de hücreleri santrifüj edin ve supernatant'ı atın.
  5. Kültür ortamda hücre pelet askıya ve mikrosantrifüj tüp içine her durum için 600.000 hücre almak. Deneysel tasarımlara ve büyüme hızlara bağlı olarak hücre numarasını ayarlayın.
  6. Hücre süspansiyonuna mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininin (DPBS) 800 μL'sini ekleyin. 30 s için bir minicentrifuge kullanarak aşağı spin ve supernatant atın.
  7. Hücre peletine 60 μL resuspension tampon R ekleyin ve ilgili mikrocentrifuge tüpüne 6 μM konsantrasyonla siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA veya crkl ve crkl siRNA'ları ekleyin. Dokunarak hafifçe karıştırın.
  8. Elektroporate 10 μL elektroporasyon sistemi ile 10 ms için üç darbe ile 10 ms ve kültür ortamının 5 mL içine elektroporated hücreleri aktarın. Her durum için hazırlanan hücrelerin geri kalanı için elektroporasyon tekrarlayın.
  9. İlgili tüm elektroporasyonu tamamlayın. Elektroporated hücreleri her koşulda 35 mm'lik iki tabak halinde aktarın ve kültür koşullarında 3 gün boyunca kültürlendirin.
  10. Üçüncü gün, gerçek hücre empedansı ölçümü öncesinde 6 saat dmem (düşük serum orta) içeren% 0.5 FBS tüm elektrohaps hücreleri tedavi.

2. Gerçek Zamanlı Hücre Analiz Sistemi, Hücre İnvazı ve Göç (CIM) Plakalarının hazırlanması ve Kaplama için Elektroporated U-118MG Hücreleri

  1. Sistemi kültür koşullarına stabilize etmek için denemebaşlamadan önce gerçek zamanlı hücre analiz sistemini kültür koşullarına göre 5-6 saat önce bir CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
  2. İstila tadına göre, CIM plakasının üst haznesinin her bir kuyusunda 0,1 μg/μL'de hücre dışı matriks (ECM) jel içeren 50 μL'lik DMEM (düz orta) plakası. Hava kabarcıkları olmaması için ters pipetleme yöntemini kullanın. Hemen 30 μL ECM jeli çıkarın ve kuyuda 20 μL bırakarak.
  3. ECM jel kaplamadan sonra, tabağı kapağı kapalı 4 saat boyunca kültür koşullarında kuvözde tutun. ECM jel kaplama ve kurutma sırasında, plakaların üst haznesinin elektrotlarının ellerle, biyogüvenlik kabininin yüzeyleriyle veya CO2 kuluçka makinesiyle doğrudan temasını önlemek için önleyici tedbirler alın.
  4. Empedans ölçüm programını ayarlamak için, sistem yazılım uygulamasını (kontrol birimi) açmak için ilişkili yazılım simgesini (Bkz. Malzeme Tablosu)'nuçift tıklatın. Her beşik, deneysel koşulları, empedans ölçüm zaman aralığı ve süresini ve veri analizini ayarlamak için farklı sekmelere sahip ayrı bir pencereye sahiptir.
  5. Düzen sekmesi altında, her biyolojik durum için dört katına kuyular ayarlayın ve Zamanlama sekmesi altında iki aşamalı hücre empedansı ölçümleri ayarlayın. İlk adım bir kerelik temel ölçüm için (1 dk aralıklı bir süpürme) ve ikinci adım gerçek bir deney için ilgili tek beşiklerde hücre empedansını ölçmektir. Geçiş için, 10 dk aralıklı 145 süpürme kullanın ve işgal için, 577 10 dk aralıklı, tek tek ayarlanmış) ilgili beşiklerde süpürür.
  6. Hücre empedansı ölçümü başlamadan önce bir h, plakanın alt haznesinin kuyularında kemoattractant olarak %10 FBS ile 160 μL DMEM ekleyin. ECM jel kaplı kuyuları içeren üst odayı veya sırasıyla istila ve göçü ölçmek için alt odaile kaplamasız kuyuları bir araya getirin.
  7. Üst haznedeki kuyuları 50 μL düşük serum ortamı ile doldurun ve sistemin beşiğine yerleştirin. İleti sekmesini tıklatarak tüm kuyuların kontrol birimi tarafından tanıyıp tanınmadığını kontrol edin. İleti Tamamolarak görüntülerse, beşikteki plaka deneme için hazırdır.
  8. Hücre kültürü koşullarına uygun bir paket inkuvöz için gerekli olan gerçek zamanlı hücre analiz sistemi beşiğindeki ölçümlerden önce 1 saat boyunca kültür koşullarında tamamen paketlenmiş plakaları preincubate edin.
  9. Düşük serum ortamı ile tedavi edilen hücrelerin hasat için, 1.3 adımdaki gibi hücreleri deneyin, düşük serum ortamda toplayın ve hücreleri 1.4 adımda olarak sayın.
  10. Sayma sonra, 5 dakika için 100 x g santrifüj hücreleri ve supernatant atın.
  11. Göç ve invazyon tahlilleri için 800 μL düşük serum ortasında 800.000 hücreyi yeniden askıya alın. Ayrıca, Crk ve CrkL'nin düzenlenmiş nakavtını onaylamak için Batı leke analizi için 35 mm'lik bir çanakta 2 mL kültür ortamı ve tohumda 300.000 hücreyi yeniden askıya alın.

3. Temel Okuma, Hücrelerin Tohumlanması ve Hücre Empedansı Ölçümü ve Görselleştirme

  1. Beşik Başlat düğmesini tıklatarak taban çizgisi okumasını ölçün. Taban çizgisi, co2 inkübatöründeki kültür koşulları altında gerçek zamanlı hücre analiz sisteminin beşiğinde 1 saat boyunca plakaları preinkübasladıktan ve hücreleri üst odadaki ilgili kuyulara tohumlamadan önce okumalıdır.
    NOT: Beşik Başlat düğmesi tıklandığında, kontrol birimi deneysel dosyayı kaydedip kaydetmememi sorar. Dosya kaydedildikten sonra, beşik çözümleyicisi başlangıçta programda ayarlanan temel hücre empedansını ölçer ve ikinci adımda hücre empedansını ölçmek için beşik Başlat düğmesi tekrar tıklanana kadar bir duraklama moduna girer.
  2. Temel ölçümden sonra beşiklerden göç ve istila için her iki plakayı da alın ve biyogüvenlik kabininde tutun.
  3. 100 μL'lik (100.000 hücre) ilgili kuyularda CIM plakasının üst haznesinde bulunan her biyolojik durum için dört katına çıkarve hava kabarcıklarını önlemek için ters borulama ile beşiğin kontrol ünitesinde programlandı.
  4. Tohumlamadan sonra, hücrelerin eşit olarak dibe yerleşmesini sağlamak için tabağı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik dolabının altında tutun. Plakayı ilgili beşiğe geri aktarın ve 2,5'in ikinci basamacında programlanmış hücre empedansını ölçmeye başlamak için beşik başlat düğmesini tıklatın.
  5. Son süpürmeden sonra deneme tamamlanır ve sonuçlar otomatik olarak kaydedilir.
  6. Veri Çözümlemesi sekmesi altında, hücre imedansındaki değişiklikleri deneme sırasında veya tamamlanmasından sonra zamana bağlı bir şekilde hücre indeksi olarak görselleştirin. Dörtlüklerin ilgili koşullarının her biri, ortalama ve standart sapma için Seçenek kutularına tıklayarak tek tek veya ortalama ve/veya standart sapma olarak görüntülenebilir.
  7. Hücre dizini verilerini elektronik tablo dosyasına dışa aktarmak için boş bir elektronik tablo dosyası açın, imleci Veri Analizi penceresinin ortasına yerleştirin ve sağ tıklatın. Görünen iletişim kutusunda, Verileri Liste Biçimine Kopyalaseçeneğini seçin ve verileri açık elektronik tabloya yapıştırın.
  8. Hücre empedansı ölçümünün gerçek başlangıç saatini temsil edecek şekilde ham verilerdeki zamanı ayarlayın. İkinci adım başlangıç saati sıfır olarak ayarlanır.
    NOT: Kontrol ünitesi, hücre dizini normalleştirmeli veya normalleştirmesiz hücre dizini alma ve sonuçları zamana bağlı bir grafik sunumu olarak görselleştirme seçeneğine sahiptir. Bu örnekte, hücre dizin verileri işleme ve grafik sunum için normalleştirme olmadan dışa aktarılır.
  9. Her beşikteki Serbest Bırakma düğmesini tıklatarak denemeyi bırakın.

Sonuçlar

Bu Crk ve CrkL farklı kanser hücre hatları13,,17hücre göçü ve invazyonu için önemli olduğu ileri sürülmüştür . Crk ve CrkL proteinleri yapısal ve işlevsel olarak birbirine benzer ve temel örtüşen fonksiyonlar oynamak rağmen16,19,20,21, Crk ve CrkL için birçok gen yıkılması çalışmaları açıkça knockdown ya...

Tartışmalar

Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi kullanılarak hücre geçişi ve istilasının gerçek zamanlı ölçümü, tek bir zaman noktasında veri sağlayan geleneksel yöntemlere göre birden fazla, önemli avantajlara sahip basit, hızlı ve sürekli bir izleme işlemidir. Geleneksel yöntemlerde olduğu gibi, her hücre hattı gerçek zamanlı hücre analiz sistemi için her hücre hattı için en iyi duruma getirilmelidir, çünkü her hücre hattı substrat, büyüme, hücre-hücre temasları ve göç ve invaziv yete...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Olivia Funk'a gerçek zamanlı hücre analiz sistemi verilerine yaptığı teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Bu el yazması düzenleme için Çocuk Mercy Kansas City Tıp Yazma Merkezi teşekkür ederiz. Bu çalışma Tom Keaveny Endowed Fonu Pediatrik Kanser Araştırma (TP için) ve Çocuk Mercy Hastanesi Midwest Kanser İttifakı Ortak Danışma Kurulu fon (TP) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinetThermoFisher Scientific1300 Series Class II, Type A2
CIM platesCell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc5665825001Cell invasion and migration plates
Crk siRNADharmaconJ-010503-10
CrkL siRNAAmbionID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)ATCC302002Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco21-031-CVDPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermoFisher Scientific51030285Co2 incubator
MatrigelBD Bioscience354234Extracellular matrix gel
Neon electroporation systemThermoFisher ScientificMPK5000Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kitThermoFisher ScientificMPK1025Electroporation kit
Non-targeting siRNADharmaconD-001810-01siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)LI-COR BiosciencesWestern blot imaging system
RTCA softwareCell Analysis Division of Agilent Technologies, IncInstrument used for experiment
ScepterMilliporeC85360Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTAGibco25300-054
U-118MGATCCATCC HTB15Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DPCell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc380601050Instrument used for experiment

Referanslar

  1. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
  4. Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
  5. Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  6. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
  7. Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
  8. Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
  9. Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  10. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  11. Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
  12. Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
  13. Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
  14. Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
  15. Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
  16. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  17. Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
  18. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  19. Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
  20. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  21. Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmaSay 158kanserginvazyonempedans tabanlger ek zamanl l mglioblastomaCrk

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır