经济高效且适应性强的划痕迁移检测

摘要

我们为划痕迁移分析提供了一种经济高效的方法，它提供了一种无需使用设备密集型方法即可确定细胞迁移的新方法。虽然本协议使用了成纤维细胞，但它可以被改编并用于研究其他细胞类型和对细胞迁移的影响。

摘要

细胞迁移是生理和病理事件的关键组成部分。正常细胞迁移是基本功能（如开发和安装免疫反应）所需的。当细胞迁移过程中发生缺陷或改变时，它可能会产生有害的结果（即癌症转移、伤口愈合和疤痕形成）。由于细胞迁移的重要性，有必要获得经济实惠、适应性强且可重复的细胞迁移检测。利用常见的划痕迁移测定，我们开发了一种使用一般实验室设备分析细胞迁移的新方法。所述方法使用视觉标记，无需使用延时显微镜即可重述特定感兴趣的区域。此外，它还在实验设计中提供了灵活性，从改变迁移基质基质到添加药理修饰剂。此外，此协议概述了一种解释单元格迁移区域的方法，在检查单元格迁移时，有几种方法没有考虑该区域。这种新方法为更多的受众提供了划痕迁移分析，并将为研究人员提供更大的机会来研究细胞迁移的生理和病理生理影响。

引言

细胞迁移对于许多生理和病理事件都至关重要。这是需要在开发过程中，安装免疫反应，并适当的伤口愈合^1，2，3。许多这些细胞迁移事件可能由物理或化学信号触发。例如，在免疫反应期间，白细胞会因化疗2而向损伤发生地^迁移。此外，白细胞也将释放细胞因子，诱导其他免疫细胞的迁移，以及其他细胞类型，如成纤维细胞，参与伤口愈合过程，从而启动多细胞反应^4。细胞的迁移能力对适当的生理功能至关重要;然而，当细胞迁移不加控制时，它可以有不良反应，并促成病理事件，如慢性炎症，血管疾病，癌症转移，和受损的伤口愈合^{2，3，4，5，6，7。}受损的伤口愈合是糖尿病患者常见的疾病，由于细胞迁移的缺陷，如果这些缺陷不得到解决，它可能导致进一步的并发症（例如，截肢^8，9）。这项研究，以及其他人，已经表明需要进一步了解细胞迁移的过程，无论是正常的生理或病理条件下，这对于推进这一领域的研究至关重要。为了做到这一点，需要提供迁移测定，这些研究人员可能不具备进行这些测定所需的设备，而且能够负担得起。

目前，有多种迁移分析可用于检查有关细胞迁移的广泛主题。已开发 2D 和 3D 迁移模型，每个模型都针对影响单元迁移的特定区域。3D迁移模型通常与细胞入侵研究相关，并评估细胞外基质对细胞迁移10、11、12的影响，而2D迁移分析具有更大的应用范围，主要用于研究细胞迁移过程中的化疗迁移、伤口愈合和功能^变化。其中一些检测需要额外的设备，如博伊登室或排除环，这可以降低这些测定的可用性，某些研究人员。一个更经济效率的检测是划痕分析，它通常用于评估伤口愈合和细胞迁移的一般^{变化14，17。}虽然大多数实验室都配备进行划痕检测，但用于跟踪细胞迁移的设备往往不可用或过于昂贵，无法购买。这包括延时显微镜，这需要倒置显微镜和实时成像系统。这些昂贵的设备通常不是每个实验室都能接触到的。因此，这一观察突出了需要一个新的协议，允许评估细胞迁移与更容易获得的设备。

此处介绍的协议提供了一种新的且经济实惠的方法来评估单元迁移。此方法遵循与划痕测定相关的相同过程，但在利用基础科学实验室环境中更常见的设备来检查细胞迁移的分析中有所不同。该协议使用通用设备，无需使用延时显微镜即可更准确地确定细胞迁移。除了确定迁移之外，此方法还考虑到划痕区域中的可变因素，这些因素已注意到对单元迁移产生很大影响。总体而言，这一新的细胞迁移分析协议为更多的实验室提供了探索和贡献细胞迁移领域的机会。

研究方案

1. 一般细胞培养

1. Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM） 中的培养性心脏成纤维细胞，含有 1 g/L 葡萄糖， 丙酮酸钠、L-谷氨酰胺，并辅以14.2 mM NaHCO 3、14.9 mM HEPES、15%热灭活胎儿牛血清（FBS）、2%L-谷氨酰胺和0.02%抗菌试剂（见材料表），并在37°C的_CO2培养箱中保存。
2. 培养心脏成纤维细胞，直到90-95%汇合到达通道0（P0）。此时，成纤维细胞已准备好被分割成一个48井板，用于迁移测定。

2. 准备迁移板

1. 在井中心向下绘制一条线，使用黄色或浅色永久标记，准备一个 48 井的细胞培养板。然后，绘制三个哈希标记，将井划分为三个独立的感兴趣区域。这些部分将用于成像。
   注:使用浅色永久标记可轻松成像迁移细胞。黑色或蓝色等深色标记将阻止迁移单元格的可视化。
2. 如果评估基材（如胶原蛋白）的迁移，请按照特定基材的指令和浓度，此时涂覆井。
3. 板 +15，000-20，000 心脏成纤维细胞，P1，进入每个井和培养细胞，在正常培养条件下（前一节所列条件），直到它们达到90-95%的汇合。应在 24-48 小时内到达汇合。
   注:设置迁移板时，请确保包括正对照（已知迁移细胞，如 3T3 细胞^18）、负对照（未刮接的细胞）和空白井。

3. 划痕迁移检测和固定

1. 一旦细胞达到90-95%的汇合，用无菌P200移液器尖端去除介质并沿绘制的线划段。
   注:P200移液器尖端是用于划痕测定^{10、14、19的常用移液器尖端}。此外，使用 P200 尖端仅进行一次通过，因为多次尝试可能会导致多条划痕线。
2. 用低血清介质（1.5% FBS）冲洗井，以去除任何未连接的心脏成纤维细胞。
3. 在每个井中加入500μL的低血清介质。如果使用任何药理剂，此时添加它们。
   注:使用低血清介质是因为它允许/促进细胞迁移发生，并防止成纤维细胞增殖，这可能扭曲迁移测定^结果20。对于此协议，使用了 1.5% FBS。
4. 在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中孵化成纤维细胞之前，捕获 0 小时图像，24 小时。
   1. 使用 20 倍目标的倒置显微镜捕获 0 小时图像。每井拍摄两张 0 小时图像。这将允许更全面地覆盖迁移线。
   2. 使用标记（线条和破折号）定位井以捕获划痕线的上半部分。避免对中间破折号进行成像，以确保相同的迁移区域不会成像两次，这可能会扭曲结果。
   3. 使用成像软件 （材料表） 捕获 0 小时图像#1.然后移动板，在摄像机的视野中定位井/划痕线的下半部分。同样，避免捕获中间破折号。一旦到位，捕获 0 小时图像#2（图 1）。
      注意:避免两个 0 h 图像的中间破折号将阻止捕获迁移区域两次，如果这样做可能会产生重复的结果和扭曲数据。
5. 孵育24小时后，从井中去除介质，用1x非无菌PBS清洗井（因此，使用的所有1x PBS都是非无菌的）。
6. 在烟罩中，向井中加入 500 μL 的 4% 对甲醛，并在室温 （RT） 下孵育 10 分钟。
7. 去除甲醛，用1x PBS清洗3倍，在RT下各洗5分钟。
8. 一旦细胞被洗净，继续捕捉24小时图像或添加1xPBS到每个井，并放在4°C，直到以后的时间。细胞可以在4°C下停留1-2周，直到准备好成像。
   1. 通过向每井添加300μL的渗透溶液（1x PBS和0.01%三吨X-100），使细胞渗透。在RT下，用温和、持续摇动的细胞/板孵育细胞/板30分钟。
   2. 去除渗透溶液，加入1%的库马西辉煌蓝色污渍（3%库马西辉煌蓝，10%醋酸，45%甲醇，和45%dH₂O）10分钟，在RT温和，持续摇摆。
      注:如果板涂有细胞外基质基板，在进行迁移检测之前，请务必用库马西染色测试涂层板。 图2 演示了基质基板可用于此测定，而不是影响细胞的可视化。
   3. 在RT下用1x PBS清洗井3倍，每次连续摇动5分钟。
   4. 洗涤后，添加300μL的1xPBS，并捕获24小时图像。
   5. 通过将井对齐到用于捕获 0 小时图像的相同位置，捕获 24 小时图像。为此，打开以前捕获的 0 h 图像并使用永久标记的标记，将井对齐到同一位置。中间的线和附加的破折号应允许在 24 小时图像和 0 h 图像之间保持紧密对齐（图 1）。

4. 准备 0 小时和 24 小时图像

1. 打开 0 小时和 24 小时拍摄的相同井和成像软件位置的图像 （材料表） 。
2. 在 0 h 图像上创建新图层。然后，单击新图层，通过双击文本将图层名称更改为"线图层"。
   注:从这个角度看，此图层将称为线层。
3. 单击画笔 工具 （画笔图标），将大小设置为 10 px，将颜色设置为红色。
4. 选择线图层后，绘制两条单独的线，以勾勒出划痕区域的轮廓。由于这些线标记迁移区域，因此这些线不应接触任何单元格。
5. 单击 "移动 工具"（箭头图标），然后按下 Ctrl 按钮，然后单击线条和背景图层。
6. 单击 0 小时图像的中心，然后将两个图层拖动到 24 小时图像的中间。
7. 现在使用 24 小时图像，单击 0 小时背景图层，将不透明度更改为 50%。
8. 按住 Ctrl 按钮 ，单击 0 小时背景层和线图层，然后自由变换图层（编辑>自由变换）。使用自由变换，将 0 小时背景和线条图像与 24 小时背景图像对齐。此步骤导致覆盖 0 h 和 24 h 图像，这是将标记迁移区域的线条定位在 24 h 图像上的正确位置所必需的。
9. 在成功将 0 小时背景和线图层叠加到 24 小时背景图像上后，删除 0 小时背景图层。通过单击 0 小时背景图层删除，然后右键单击，然后单击删除图层。
10. 删除 0 h 背景图像将只留下线条和 24 小时背景图层（现在称为迁移图像）。线层将指示 24 h 图像上的迁移/刮擦区域，并可用于确定迁移单元的数量。
11. 作为新的迁移图像保存为照片店文件和 TIFF/JPEG。注:图 3 中介绍了描述此过程 的代表性图。

5. 计算迁移单元格的数量

1. 打开迁移映像。这可以在接受TIFF/JPEG文件的程序中完成（材料表）。
2. 计算位于两者之间的单元格数，以及触摸两条红线。
3. 记录每个图像的迁移单元格数。每个井将有两个迁移映像，这些值应在迁移区域的修正后合并（详见下一节）。

6. 确定移徙区域

1. 打开第 5 节（材料表）中包含成像软件程序中的迁移线的 24 小时图像。
2. 保存为此图像为"迁移区域图像"。
3. 保存后，单击背景图层，右键单击，然后单击删除图层。这应该只留下图像上的暂行（图 3）。
4. 使用画笔工具（画笔图标）填充划痕线之间的区域。将画笔的颜色与用于绘制迁移线条的颜色相匹配。
5. 将图像更改为灰度以生成黑白图像（图像>Mode>灰度），然后保存图像（图 4）。
6. 启动分析软件（材料表），然后在分析软件中打开"迁移区域"文件。
7. 要确定迁移行的面积，请单击"图像 >调整"和"阈值"。黑色迁移区域将变红，百分比区域将在"阈值"框中指示。与图像中捕获的整个区域相比，该区域将报告为迁移行覆盖的区域的百分比。
8. 记录迁移行的百分比区域，并确保此值与同一图像的迁移单元格数配对。

7. 数据分析

1. 将迁移单元格的数量规范化为划痕的百分比区域。将迁移单元格的数量除以迁移行的百分比区域（# 迁移单元格% 迁移区域）。按图像执行此工作，而不是根据每个井的迁移进行平均值。
2. 对每个图像的值进行规范化后，添加两个图像的值，这表示单个井。此值将用于图形和统计分析。如果实验设计包含多个复制。统计分析前的平均复制值。

结果

此过程记录了研究细胞迁移的新方法，这种方法对大多数实验室来说既经济高效又易于适应。许多研究都使用延时显微镜来评估细胞迁移，但许多实验室都不容易获得这种方法所需的设备。而利用线和破折号进行标界，可以重新获得不同时间点的特定感兴趣区域，而无需使用昂贵的设备（图1 和 图3）。虽然使用标界对于这一新方法至关重要，但这种方...

讨论

这种新的划痕迁移测定方法为研究人员提供了一种更容易访问的方法，可以检查细胞迁移的变化。虽然此测定遵循与其他划痕测定类似的划痕相同的过程，但它确实为细胞迁移¹⁰的成像和准确分析提供了一种新方法。这种方法没有使用设备密集型的延时显微镜和活细胞成像室方法，而是详细介绍了常用实验室设备的使用情况。利用一般的倒置显微镜和照相机，可以同时捕获迁移?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
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