Un saggio di migrazione dei graffi economico e adattabile

Riepilogo

Presentiamo un metodo conveniente per il test di migrazione dei graffi che fornisce un nuovo approccio per determinare la migrazione cellulare senza l'uso di metodi ad alta intensità di apparecchiature. Mentre i fibroblasti sono stati utilizzati in questo protocollo, possono essere adattati e utilizzati per studiare ulteriori tipi di cellule e influenze sulla migrazione cellulare.

Abstract

La migrazione cellulare è una componente chiave sia negli eventi fisiologici che patologici. La normale migrazione cellulare è necessaria per funzioni essenziali come lo sviluppo e il montaggio di una risposta immunitaria. Quando si verifica un difetto o un'alterazione con il processo di migrazione cellulare, può avere esiti dannosi (ad esempio, metastasi del cancro, guarigione delle ferite e formazione di cicatrici). A causa dell'importanza della migrazione cellulare, è necessario avere accesso a un test di migrazione cellulare conveniente, adattabile e ripetibile. Utilizzando il comune test di migrazione dei graffi, abbiamo sviluppato un nuovo approccio all'analisi della migrazione cellulare che utilizza apparecchiature di laboratorio generali. Il metodo descritto utilizza marcatori visivi che consentono di riconquistare aree specifiche di interesse senza l'uso di microscopia time-lapse. Inoltre, fornisce flessibilità nella progettazione sperimentale, che va dall'alterazione del substrato della matrice di migrazione all'aggiunta di modificatori farmacologici. Inoltre, questo protocollo delinea un modo per tenere conto dell'area di migrazione delle celle, che non viene presa in considerazione da diversi metodi quando si esamina la migrazione delle celle. Questo nuovo approccio offre un saggio di migrazione dei graffi a un pubblico più ampio e offrirà maggiori opportunità ai ricercatori di esaminare l'impatto fisiologico e fisiopatico della migrazione cellulare.

Introduzione

La migrazione cellulare è fondamentale per molti eventi fisiologici e patologici. È necessario durante lo sviluppo, per montare una risposta immunitaria e per una corretta guarigione delle^{ferite 1,2,3}. Molti di questi eventi di migrazione cellulare possono essere innescati da segnali fisici o chimici. Ad esempio, durante una risposta immunitaria, i leucociti migreranno verso un sito di lesione in risposta a un chemioattrattante². Inoltre, i leucociti rilasceranno anche citochine per indurre la migrazione di cellule immunitarie aggiuntive, così come altri tipi di cellule, come i fibroblasti, che sono coinvolti nel processo di guarigione delle ferite, e quindi, avviando una risposta multicellulare⁴. La capacità delle cellule di migrare è essenziale per una corretta funzione fisiologica; tuttavia, quando la migrazione cellulare non viene controllata, può avere una risposta avversa e contribuire a eventi patologici, come infiammazione cronica, malattia vascolare, metastasi tumorale e alterazione della guarigione delle^{ferite 2,3,4,5,6,7}. La guarigione delle ferite compromessa è una comune afflizione dei diabetici a causa di difetti nella migrazione cellulare e, se questi difetti non vengono affrontati, potrebbe portare a ulteriori complicazioni (ad esempio, amputazione^8,9). Questo studio, così come altri, hanno indicato la necessità di comprendere ulteriormente il processo attraverso il quale avviene la migrazione cellulare, sia in normali condizioni fisiologiche che patologiche, ed è vitale per promuovere questo campo di ricerca. A tal fine, sono disponibili test di migrazione accessibili e accessibili a quei ricercatori, che potrebbero non possedere le attrezzature necessarie per condurre questi test.

Attualmente, sono disponibili una varietà di test di migrazione per esaminare un'ampia gamma di argomenti relativi alla migrazione cellulare. Sono stati sviluppati sia modelli di migrazione 2D che 3D, ognuno dei quali mira ad aree specifiche che hanno un impatto sulla migrazione cellulare. I modelli di migrazione 3D sono tipicamente associati a studi sull'invasione cellulare e valutano l'impatto della matrice extracellulare sulla migrazione^{cellulare 10,11,12}, mentre i test di migrazione 2D hanno una maggiore gamma di applicazioni e vengono utilizzati principalmente per studiare la migrazione chemiotattica, la guarigione delle ferite e i cambiamenti funzionali durante la migrazione cellulare^13,14,15,16. Molti di questi saggi richiedono attrezzature aggiuntive, come camere Boyden o anelli di esclusione, che possono ridurre la disponibilità di questi test per alcuni ricercatori. Uno dei saggi più economici è il test scratch, che viene in genere utilizzato per valutare la guarigione delle ferite e i cambiamenti generali nella migrazione cellulare^14,17. Mentre la maggior parte dei laboratori sono attrezzati per condurre un test scratch, le apparecchiature utilizzate per tenere traccia della migrazione cellulare tendono ad essere non disponibili o troppo costose da acquistare. Ciò include la microscopia time-lapse, che richiede un microscopio invertito e un sistema di imaging dal vivo. Questi costosi pezzi di equipaggiamento non sono comunemente accessibili a tutti i laboratori. Pertanto, questa osservazione evidenzia la necessità di un nuovo protocollo che consenta la valutazione della migrazione cellulare con apparecchiature più prontamente disponibili.

Il protocollo qui presentato fornisce un modo nuovo e conveniente per valutare la migrazione cellulare. Questo metodo segue la stessa procedura associata ai test scratch ma differisce nell'analisi dell'esame della migrazione cellulare utilizzando apparecchiature più comunemente disponibili in un laboratorio di scienze di base. Questo protocollo che utilizza apparecchiature comuni consente una determinazione più accurata della migrazione cellulare senza l'uso di microscopia time-lapse. Oltre a determinare la migrazione, questo metodo rappresenta anche fattori variabili nell'area scratch che è stato notato per influire notevolmente sulla migrazione delle celle. Nel complesso, questo nuovo protocollo per l'analisi della migrazione cellulare offre a più laboratori l'opportunità di esplorare e contribuire al campo della migrazione cellulare.

Protocollo

1. Coltura cellulare generale

1. Fibroblasti cardiaci in coltura nel mezzo delle aquile modificate (DMEM) di Dulbecco contenente 1 g/L di glucosio, piruvato di sodio, L-glutammina, e integrato con 14,2 mM NaHCO₃, 14,9 mM HEPES, 15% siero bovino fetale inattivato termicamente (FBS), 2% L-glutammina e 0,02% reagente antimicrobico (vedi Tabella dei materiali)e mantenuto in incubatrice di CO₂ a 37 °C.
2. I fibroblasti cardiaci di coltura fino al 90-95% di confluenza raggiunte si raggiunge al passaggio 0 (P0). A questo punto i fibroblasti sono pronti per essere divisi in una piastra da 48 po ', che viene utilizzata per il test di migrazione.

2. Preparazione della piastra di migrazione

1. Preparare una piastra di coltura cellulare di 48 po 'disegnando una linea, usando un marcatore permanente giallo o di colore chiaro, verso il centro del pozzo. Quindi, disegna tre segni hash che dividono il pozzo in tre aree di interesse separate. Queste sezioni verranno utilizzate per l'imaging.
   NOTA: l'utilizzo di un marcatore permanente a colori chiaro consentirà una facile imaging delle cellule migrate. Marcatori scuri come il nero o il blu impediranno la visualizzazione delle celle di migrazione.
2. Se si valuta la migrazione su un substrato (ad esempio, collagene), rivestire il pozzo in questo momento seguendo le istruzioni e le concentrazioni utilizzate per il substrato specifico.
3. Placca ~15.000-20.000 fibroblasti cardiaci, P1, in ogni pozzo e cellule di coltura, in normali condizioni di coltura (condizioni elencate nella sezione precedente), fino a raggiungere il 90-95% di confluenza. La confluenza dovrebbe essere raggiunta tra le 24 e le 48 ore.
   NOTA: quando si imposta la piastra di migrazione assicurarsi di includere un controllo positivo (una cella migratrice nota, ad esempio celle 3T3¹⁸), un controllo negativo (celle non rimescolate) e un pozzo vuoto.

3. Test e fissazione della migrazione dei graffi

1. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza del 90-95%, rimuovere il supporto e graffiare lungo la linea disegnata utilizzando una punta sterile per pipetta P200.
   NOTA: Una punta di pipetta P200 è la comune punta della pipetta dimensionata utilizzata con il saggio scratch^10,14,19. Inoltre, fai solo un passaggio con la punta P200 poiché più di un tentativo può causare più linee scratch.
2. Risciacquare il pozzo con mezzi sieri bassi (1,5% FBS) per rimuovere eventuali fibroblasti cardiaci non attaccati.
3. Aggiungere 500 μL di mezzi a basso contenuto di siero ad ogni pozzo. Se si utilizzano agenti farmacologici, aggiungerli in questo momento.
   NOTA: Viene utilizzato un basso supporto siero perché consente/promuove la migrazione cellulare e impedisce la proliferazione di fibroblasti che potrebbero distorcere i risultati del saggio di migrazione²⁰. Per questo protocollo, è stato utilizzato l'1,5% di FBS.
4. Cattura immagini di 0 ore prima di incubare i fibroblasti in un incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C per 24 ore.
   1. Cattura immagini 0 h usando un microscopio invertito con un obiettivo 20x. Scatta due immagini da 0 ore per pozzo. Ciò consentirà una copertura più completa della linea di migrazione.
   2. Utilizzando le marcature (linea e trattini), posizionare il pozzo per catturare la metà superiore della linea di graffi. Evitare di creare immagini del trattino centrale per assicurarsi che la stessa area di migrazione non sia immagine due volte, il che potrebbe distorcere i risultati.
   3. Utilizzare il software di imaging (Table of Materials) per acquisire immagini a 0 #1. Quindi spostare la piastra per posizionare la metà inferiore del pozzo / linea di graffio in vista della fotocamera. Ancora una volta, evitare di catturare il trattino centrale. Una volta in posizione, acquisire l'immagine 0 h #2(Figura 1).
      NOTA: Evitare il trattino centrale in entrambe le immagini 0 h impedirà di acquisire aree di migrazione due volte, il che, se fatto, potrebbe produrre risultati ripetuti e distorcere i dati.
5. Dopo aver incubato per 24 ore, rimuovere il supporto dal pozzo e lavare il pozzo con 1 PBS nonsterile (d'ora in poi tutti i 1x PBS utilizzati non sono asterile).
6. Nella cappa aspirante aggiungere al pozzo 500 μL di paraformaldeide al 4% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
7. Rimuovere la paraformaldeide e lavare 3 volte con 1 PBS per 5 minuti ciascuno a RT.
8. Una volta lavate le cellule, procedere all'acquisizione di immagini 24 ore su 24 o aggiungere 1 PBS a ciascun pozzo e posizionarlo a 4 °C fino a un secondo momento. Le cellule possono rimanere a 4 °C per 1-2 settimane fino a quando non sono pronte per l'immagine.
   1. Permeabilizzare le cellule aggiungendo 300 μL di soluzione permeabilizzabile (1x PBS e 0,01% tritone X-100) ad ogni pozzo. Incubare cellule / piastre con dondolo delicato e continuo per 30 minuti a RT.
   2. Rimuovere la soluzione permeabilizzante e aggiungere l'1% di macchia Blu Brillante Coomassie (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% acido acetico, 45% metanolo e 45% dH₂O) per 10 min con dondolo delicato e continuo a RT.
      NOTA: Se le piastre sono rivestite con un substrato a matrice extracellulare, assicurarsi di testare una piastra rivestita con colorazione Coomassie prima di condurre il test di migrazione. La figura 2 dimostra che un substrato matriciale può essere utilizzato con questo saggio e non con la visualizzazione dell'impatto delle cellule.
   3. Lavare i pozzi 3x con 1x PBS a RT con dondolo continuo per 5 minuti ciascuno.
   4. Dopo i lavaggi, aggiunto 300 μL di 1x PBS e catturare immagini 24 ore su 24.
   5. Cattura immagini 24 ore su 24 allineando il pozzo nella stessa posizione utilizzata per catturare le immagini 0 h. Per raggiungere questo obiettivo, aprire le immagini 0 h acquisite in precedenza e utilizzando la marcatura effettuata con il marcatore permanente, allineare il pozzo nella stessa posizione. La linea lungo i trattini centrali e aggiuntivi deve consentire uno stretto allineamento tra l'immagine 24 ore su 24 e l'immagine 0 h (Figura 1).

4. Preparazione di immagini da 0 h e 24 ore

1. Aprire le immagini di 0 h e 24 ore prese dello stesso pozzo e della stessa posizione nel software di imaging(Table of Materials).
2. Create un nuovo livello sull'immagine 0 h. Quindi, fate clic sul nuovo livello e modificate il nome del livello in "livello linea" facendo doppio clic sul testo.
   NOTA: questo livello verrà definito livello linea da questo punto in poi.
3. Fare clic sull'strumento Pennello (icona del pennello) e impostare la dimensione su 10 px e il colore su rosso.
4. Con il livello linea selezionato, disegnare due linee separate che delineano l'area del graffio. Le linee non devono toccare alcuna parte a causa di queste linee che contrassegnano l'area di migrazione.
5. Fare clic sullo strumento Sposta (icona a forma di freccia), quindi premere CTRL e fare clic sui livelli linea e sfondo.
6. Fate clic al centro dell'immagine 0 h e trascinate entrambi i livelli al centro dell'immagine di 24 ore.
7. Ora usando l'immagine 24 ore su 24, fai clic sul livello di sfondo 0 h e cambia l'opacità al 50%.
8. Tenendo premuto il pulsante CTRL, fate clic sia sullo sfondo 0 che sul livello linea, quindi liberate la trasformazione dei livelli (Edit>Free Transform). Utilizzando la trasformazione gratuita, allineare lo sfondo 0 h e l'immagine di linea all'immagine di sfondo di 24 ore. Questo passaggio comporta la sovrapposizione dell'immagine 0 h e 24 h, necessaria per posizionare le linee che contrassegnano l'area di migrazione nella posizione corretta sull'immagine 24 ore su 24.
9. Dopo aver superato correttamente la sovrapposizione dei livelli di sfondo e linea 0 h sull'immagine di sfondo di 24 ore, eliminare il livello di sfondo 0 h. Eliminare facendo clic sul livello di sfondo 0 h, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere elimina livello.
10. L'eliminazione dell'immagine di sfondo 0 h lascerà solo la linea e il livello di sfondo di 24 ore (ora indicato come immagine di migrazione). Il livello linea indicherà l'area di migrazione/graffio sull'immagine 24 ore su 24 e può essere utilizzato per determinare il numero di celle migrate.
11. Salvate come nuova immagine di migrazione sia come file photoshop che come TIFF/JPEG. NOTA: una figura rappresentativa che illustra questo processo è presentata nella figura 3.

5. Conteggio del numero di celle migrate

1. Aprire l'immagine di migrazione. Questa impostazione può essere eseguita in un programma che accetta file TIFF/JPEG (Table of Materials).
2. Contare il numero di celle che si trovano nel mezzo e toccare le due linee rosse.
3. Registrare il numero di celle di migrazione per immagine. Ci saranno due immagini di migrazione per pozzo e questi valori non devono essere combinati fino a quando i valori non saranno stati corretti per l'area di migrazione (dettagliata nella sezione successiva).

6. Determinare l'area di migrazione

1. Aprire l'immagine 24 ore su 24 contenente le linee di migrazione nel programma software di imaging nella sezione 5 (Tabella dei materiali).
2. Salvare come immagine come "Immagine area di migrazione".
3. Dopo il salvataggio, fare clic sul livello di sfondo, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere elimina livello. Ciò dovrebbe lasciare solo le linee scratch sull'immagine (Figura 3).
4. Utilizzando lo strumento Pennello (icona pennello) riempire l'area tra le linee di graffio. Abbinare il colore del pennello al colore utilizzato per disegnare le linee per la migrazione.
5. Modificare l'immagine in una scala di grigi per generare un'immagine in bianco e nero (Image>Mode>Grayscale) e quindi salvare l'immagine (Figura 4).
6. Avviare il software di analisi (Table of Materials) e quindi aprire il file "Area of Migration" all'interno del software di analisi.
7. Per determinare l'area della riga di migrazione, fare clic su Immagine>Regola>Threshold. L'area di migrazione nera diventerà rossa e l'area percentuale verrà indicata nella casella Soglia. L'area verrà segnalata come percentuale di area che la linea di migrazione copre rispetto all'intera area catturata nell'immagine.
8. Registrare l'area percentuale per la riga di migrazione e assicurarsi che questo valore sia associato al numero di celle di migrazione per la stessa immagine.

7. Analisi dei dati

1. Normalizzare il numero di celle di migrazione nell'area percentuale del graffio. Dividere il numero di celle migrate per l'area percentuale della riga di migrazione (# celle migrate % Area di migrazione). Eseguire questa attività per immagine e non una media basata sulla migrazione per pozzo.
2. Dopo aver normalizzare i valori per immagine, aggiungere i valori delle due immagini, che rappresentano un pozzo individuale. Questo valore verrà utilizzato per l'analisi grafica e statistica. Se il progetto sperimentale conteneva più repliche. Valori medi di replica prima dell'analisi statistica.

Risultati

Questa procedura documenta un nuovo approccio allo studio della migrazione cellulare che sia conveniente e facilmente adattabile per la maggior parte dei laboratori. Molti studi hanno utilizzato la microscopia time-lapse per valutare la migrazione cellulare, ma le attrezzature necessarie per questo metodo non sono prontamente disponibili per molti laboratori. considerando che l'utilizzo di linee e trattini per la demarcazione consente di riconquistare aree specifiche di interesse in diversi punti di tempo senza l'uso di<...

Discussione

Questo nuovo approccio al test di migrazione dei graffi fornisce un metodo più accessibile per i ricercatori per esaminare i cambiamenti nella migrazione cellulare. Sebbene questo saggio segua la stessa procedura per la somministrazione di un graffio simile ad altri test scratch, fornisce un nuovo metodo per l'imaging e l'analisi accurata della migrazione^{cellulare 10}. Invece di utilizzare metodi ad alta intensità di apparecchiature di microscopia time-lapse e camere di imaging a celle vive, ques...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase