תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

Summary

אנו מציגים שיטה חסכונית לגיירת השריטות המספקת גישה חדשה לקביעת העברת תאים ללא שימוש בשיטות עתירות ציוד. בעוד פיברובלסטים שימשו בפרוטוקול זה, זה יכול להיות מותאם ומנוצל כדי ללמוד סוגי תאים נוספים והשפעות על העברת תאים.

Abstract

העברת תאים היא מרכיב מרכזי הן באירועים פיזיולוגיים והן באירועים פתולוגיים. העברת תאים רגילה נדרשת עבור פונקציות חיוניות כגון פיתוח והרכבה של תגובה חיסונית. כאשר מתרחש פגם או שינוי עם תהליך העברת התא, זה יכול להיות תוצאות מזיקות (כלומר, גרורות סרטן, ריפוי הפצע, היווצרות צלקת). בשל החשיבות של העברת תאים, יש צורך בגישה להעברה סלולרית, הניתנת להתאמה ותוכלית לחזרה. תוך שימוש בהגידת השריטות הנפוצה, פיתחנו גישה חדשה לניתוח נדידת תאים המשתמשת בציוד מעבדה כללי. השיטה המתוארת משתמשת בסמנים חזותיים המאפשרים לכידת אזורים מסוימים בעלי עניין ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף, היא מספקת גמישות בעיצוב הניסיוני, החל משינוי המטריצת הנדידה ועד לתוספת של משנה תרופתי. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר דרך לתת דין וחשבון על האזור של העברת תאים, אשר אינו נחשב על-ידי מספר שיטות בעת בדיקת העברת תאים. גישה חדשה זו מציעה אסיא הגירה שריטה לקהל גדול יותר ותספק הזדמנות גדולה יותר לחוקרים לבחון את ההשפעה הפיזיולוגית והפתופיזיולוגית של העברת תאים.

Introduction

העברת תאים היא חיונית עבור אירועים פיזיולוגיים רבים, כמו גם פתולוגיים. הוא נדרש במהלך הפיתוח, להרכבת תגובה חיסונית, ולריפוי^{פצעים נאותים 1,2,3}. רבים מאירועי העברת תאים אלה יכולים להיות מופעלים על ידי אותות פיזיקליים או כימיים. לדוגמה, במהלך תגובה חיסונית, leukocytes לנדדו לעבר אתר של פציעה בתגובה כימותרפיה². בנוסף, leukocytes גם לשחרר ציטוקינות כדי לגרום הגירה של תאים חיסוניים נוספים, כמו גם סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים, אשר מעורבים בתהליך ריפוי הפצע, ובכך, ייזום תגובה רב^{תאית 4}. היכולת של תאים לנדוד חיונית לתפקוד פיזיולוגי תקין; עם זאת, כאשר נדידת תאים עוברת ללא בדיקה, זה יכול להיות תגובה שלילית ולתרום לאירועים פתולוגיים, כגון דלקת כרונית, מחלת כלי דם, גרורות סרטן, וריפוי פצע^{לקוי 2,3,4,5,6,7}. ריפוי פצעים לקויים הוא סבל נפוץ של חולי סוכרת עקב פגמים בנדידה לתאים, ואם פגמים אלה אינם מטופלים, זה יכול להוביל לסיבוכים נוספים (למשל,^{קטיעה 8,9}). מחקר זה, כמו גם אחרים, הצביעו על הצורך להבין עוד יותר את התהליך שבו מתרחשת נדידת תאים, בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים רגילים, והוא חיוני גם להם לאורך תחום מחקר זה. כדי להשיג זאת, צריך להיות הגירה זמין כי הם נגישים ובמחיר סביר עבור אותם חוקרים, מי לא יכול להיות בעל הציוד הדרוש כדי לנהל את ההתאסות האלה.

נכון לכך, קיימים מגוון של העברות הזמינות לבחינת מגוון רחב של נושאים הנוגעים להעברה של תאים. פותחו מודלים של העברה תלת-מיתית ותלת-מיוד, שכל אחד מהם מתמקד באזורים ספציפיים המשפיעים על העברת תאים. מודלים נדידת 3D קשורים בדרך כלל מחקרים פלישת תאים ולהעריך את ההשפעה של מטריצה^{חוץ תאית}על נדידת תאים 10^,11,12, בעוד 2D הגירה יש מגוון גדול יותר של יישום והם משמשים בעיקר כדי ללמוד הגירה chemotactic, ריפוי פצעים, ושינויים פונקציונליים^{במהלך נדידת תאים 13,14,15,16}. חלק מהאסמים הללו דורשים ציוד נוסף, כגון תאי ביידן או טבעות הדרה, מה שיכול להפחית את הזמינות של בדיקות אלה לחוקרים מסוימים. אחד האברים חסכוניים יותר הוא אחסון השריטות, המשמש בדרך כלל להערכת ריפוי פצעים ושינויים כלליים^{בהדחת תאים 14,17}. בעוד רוב המעבדות מצוידות לנהל אחסון שריטה, הציוד המשמש למעקב אחר העברת תאים נוטים להיות גם לא זמין או יקר מדי לרכישה. זה כולל מיקרוסקופ זמן לשגות, אשר דורש מיקרוסקופ הפוך ומערכת הדמיה חיה. פריטי ציוד יקרים אלה אינם נגישים בדרך כלל לכל מעבדה. לכן, תצפית זו מדגישה את הצורך בפרוטוקול חדש המאפשר הערכה של העברת תאים עם ציוד זמין יותר.

הפרוטוקול המוצג כאן מספק דרך חדשה ובמחיר סביר להעריך את העברת התאים. שיטה זו פועלת על פי אותו הליך המשויך לבדיקות שריטה אך שונה בניתוח של בדיקת העברת תאים על-ידי שימוש בציוד הזמין בדרך כלל בהגדרת מעבדה בסיסית במדעים. פרוטוקול זה באמצעות ציוד משותף מאפשר קביעה מדויקת יותר של העברת תאים ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף לקביעת ההעברה, שיטה זו מהווה גם גורמים משתנים באזור השריטה אשר הונו להשפיע מאוד על העברת תאים. בסך הכל, פרוטוקול חדש זה לניתוח העברת תאים מספק הזדמנות למעבדות נוספות לחקור ולתרום לתחום העברת התאים.

Protocol

1. תרבות תאים כללית

1. פיברובלסטים לבביים תרבותיים במדיום הנשרים המותאם (DMEM) של דולבקו המכילים 1 גרם/ל גלוקוז, נתרן פירובלט, L-גלוטמין, בתוספת עם 14.2 mM NaHCO₃, 14.9 mM HEPES, 15% סרום חום לא פעיל של צופר עוברי (FBS), 2% L-גלוטמין, ו 0.02% מיקרוגנט מיקרוביאלי (ראה טבלת חומרים)ומתוחזק בחממה CO₂ ב 37 °C.
2. פיברובלסט לב תרבות עד 90-95% confluency הוא הגיע במעבר 0 (P0). בשלב זה הפיברובלסטים מוכנים להתחלק לצלחת של 48 בארות, המשמשת להעברה.

2. הכנת לוחית ההעברה

1. הכן לוח תרבות תא 48 באר על ידי ציור קו, באמצעות סמן קבוע צהוב או בהיר, במורד מרכז הבאר. לאחר מכן, צייר שלושה סימני Hash המפרקים את הבאר לשלושה תחומי עניין נפרדים. מקטעים אלה ישמשו להדמיה.
   הערה: שימוש בסמן קבוע בצבע בהיר יאפשר הדמיה קלה של תאים נודדים. סמנים כהים כגון שחור או כחול ימנעו הדמיה חזותית של תאים נודדים.
2. אם בוחנים הגירה בצוללת (לדוגמה, קולגן), תחפו את הבאר בשלב זה בעקבות הוראות וריכוזים המשמשים לצוע הספציפי.
3. צלחת ~ 15,000-20,000 פיברובלסטים לב, P1, לתוך כל באר ותאי תרבות, בתנאי culturing נורמליים (תנאים המפורטים בסעיף הקודם), עד שהם מגיעים 90-95% confluency. יש להגיע לשלב בין השעות 24-48.
   הערה: בעת הגדרת לוח ההעברה הקפד לכלול פקד חיובי (תא העברה ידוע, כגון תאי 3T3¹⁸), פקד שלילי (תאים לא מרוטים) ובאר ריקה.

3. העברה לגרד העברה & קיבעון

1. ברגע שהתאים מגיעים ל-90-95% קונפלואנציות, הסר את המדיה וגרד לאורך הקו המצויר באמצעות קצה פיפט P200 סטרילי.
   הערה: קצה פיפטה P200 הוא קצה פיפטה נפוץ בגודל בשימוש עם אחסון^{השריטה 10,14,19}. כמו כן, לבצע רק מעבר אחד עם קצה P200 כמו יותר מניסיון אחד עלול לגרום קווי שריטה מרובים.
2. לשטוף את הבאר עם מדיית סרום נמוכה (1.5% FBS) כדי להסיר את כל פיברובלסט לב לא מחובר.
3. הוסף 500 μL של מדיית סרום נמוכה לכל באר. אם משתמשים בחומרים תרופתיים כלשהם, הוסיפו אותם כעת.
   הערה: נעשה שימוש למדיית סרום נמוכה מכיוון שהיא מאפשרת/מקדמת העברת תאים ומונעת פיברובלסטים מהתרבות אשר עלול להטות את התוצאות של העברה assay²⁰. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- 1.5% FBS.
4. צלם תמונות של 0 שעות לפני דגירה של הפיברובלסטים ב-5% אינקובטור CO₂ ב-37°C למשך 24 שעות.
   1. צלם תמונות של 0 שעות באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מטרה של 20x. קח שתי תמונות של 0 שעות לבאר. פעולה זו תאפשר כיסוי מלא יותר של קו ההעברה.
   2. באמצעות הסימונים (קו ומקפים), מקם את הבאר כדי ללכוד את החצי העליון של קו השריטה. הימנע מהדמיה של המקף האמצעי כדי להבטיח שאותו אזור העברה לא יצוין פעמיים, דבר שיכול להטות את התוצאות.
   3. השתמש תוכנת הדמיה (טבלת חומרים) כדי ללכוד 0 שעות #1. לאחר מכן הזז את הלוח כדי למקם את החצי התחתון של באר / קו שריטה מול המצלמה. שוב, הימנע מלכידת המקף האמצעי. לאחר המקום, ללכוד 0 שעות תמונה #2 (איור 1).
      הערה: הימנעות מקף האמצע בשתי תמונות 0 שעות תמנע לכידת אזורי העברה פעמיים אשר אם נעשה יכול לייצר תוצאות חוזרות ולהטות את הנתונים.
5. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, הסר את המדיה מהבאר, ושטוף את הבאר עם PBS לא סטרילי אחד (מעתה ואילך כל 1x PBS בשימוש אינו סטרילי).
6. בכסה המנוע אדים, להוסיף 500 μL של 4% paraformaldehyde לבאר דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
7. הסר את paraformaldehyde ושטוף פי 3 עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחד ב-RT.
8. לאחר שטיפה של תאים, המשך ללכידת תמונות של 24 שעות או הוסף PBS אחד לכל באר והמקם ב-4°C עד לשעה מאוחרת יותר. תאים יכולים להישאר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות עד מוכן לתמונה.
   1. לחלחל את התאים על ידי הוספת 300 μL של פתרון permeabilizing (1 x PBS ו 0.01% triton X-100) לכל באר. דגירה תאים / צלחת עם עדין, נדנדה מתמשכת במשך 30 דקות ב RT.
   2. הסר פתרון permeabilizing ולהוסיף 1% כתם כחול מבריק Coomassie (3% Coomassie כחול מבריק, 10% חומצה אצטית, 45% מתנול, ו 45% dH₂O) במשך 10 דקות עם עדין, נדנדה מתמדת ב RT.
      הערה: אם לוחות מצופים במצע מטריצה חוץ-תאי, הקפד לבדוק צלחת מצופה עם כתמי Coomassie לפני ביצוע אסימת הגירה. איור 2 מדגים שניתן להשתמש במטע מטריצה עם תרגום זה ולא להשפיע על הדמיה של תאים.
   3. לשטוף בארות 3x עם 1 pBS ב RT עם נדנדה מתמדת במשך 5 דקות כל אחד.
   4. לאחר שטיפה, הוסיף 300 μL של 1x PBS וללכוד 24 שעות תמונות.
   5. ללכוד תמונות 24 שעות על-ידי יישור הבאר לאותה מיקום ששימש ללכידת תמונות 0 שעות. כדי להשיג זאת, פתח את התמונות שנלכדו בעבר 0 שעות ובשימוש בסימון שנעשה עם הסמן הקבוע, יישר את הבאר לאותה תנוחה. הקו במהלך האמצע וסימנים נוספים של מקף אמורים לאפשר יישור קרוב בין התמונה של 24 שעות לתמונה של 0 שעות(איור 1).

4. הכנת תמונות של 0 שעות ו-24 שעות

1. פתח 0 שעות ו-24 שעות שצולמו באותה באר ומיקום בתוכנה להדמיה(טבלת חומרים).
2. צור שכבה חדשה בתמונה של 0 שעות. לאחר מכן, לחצו על השכבה החדשה ושנו את שם השכבה ל"שכבת קו" על-ידי לחיצה כפולה על הטקסט.
   הערה: שכבה זו תיקרא שכבת קו מנקודות אלה ואילך.
3. לחצו על הכלי מברשת (סמל מברשת) והגדירו את הגודל ב- 10 px ואת הצבע לאדום.
4. כאשר שכבת הקו נבחרת, צייר שני קווים נפרדים המתארים את אזור השריטה. הקווים אינם אמורים לגעת בתאים עקב שורות אלה המציינות את אזור ההעברה.
5. לחץ על הכלי הזזה (סמל חץ) ולאחר מכן לחץ על לחצן Ctrl לחוץ ולחץ הן על שכבות הקו והן על שכבות הרקע.
6. לחצו במרכז התמונה של 0 שעות וגררו את שתי השכבות הללו לאמצע התמונה של 24 שעות.
7. כעת, באמצעות התמונה 24 שעות, לחץ על שכבת הרקע של 0 שעות ושנה את האטימות ל- 50%.
8. החזקת לחצן Ctrl, לחץ על שניהם 0 h רקע שכבת קו ולאחר מכן חינם להפוך את השכבות (עריכה>שינוי צורה חינם). באמצעות שינוי צורה חופשי, ישר את הרקע 0 שעות ותדמית הקו לתדמית הרקע של 24 שעות. שלב זה תוצאה של שכבת-על של התמונה 0 h ו- 24 h, אשר יש צורך למקם את הקווים הסמן את אזור ההעברה במיקום הנכון בתמונה 24 שעות.
9. לאחר שכבת-על מוצלחת של שכבות הרקע והקו של 0 שעות על תמונת הרקע של 24 שעות, מחק את שכבת הרקע של 0 שעות. מחק על-ידי לחיצה על שכבת הרקע של 0 שעות ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית ולחץ על מחק שכבה.
10. מחיקת תמונת הרקע של 0 שעות תשאיר רק את הקו ואת שכבת הרקע של 24 שעות (המכונה כעת תמונת העברה). שכבת הקו תציין את אזור ההעברה/שריטה בתמונה של 24 שעות ותו לא תאפק לקביעת מספר התאים הנודדים.
11. שמור כתדמית ההעברה החדשה הן כקובץ photoshop והן כתוכת TIFF/JPEG. הערה: דמות מייצגת המתארת תהליך זה מוצגת באות 3.

5. ספירת מספר התאים הנודדים

1. פתח את תמונת ההעברה. ניתן לעשות זאת בתוכנית המקבלת קבצי TIFF/JPEG (טבלת חומרים).
2. ספור את מספר התאים הממוקמים בין לבין ולגעת בשני הקווים האדומים.
3. רמת מספר התאים הנודדים לכל תמונה. יהיו שתי תמונות נודדות לבאר, ואין לשלב ערכים אלה עד לאחר תיקון הערכים עבור אזור ההעברה (מפורט בסעיף הבא).

6. קביעת אזור ההעברה

1. פתח את התמונה 24 שעות המכילה את שורות ההעברה בתוכנית ההדמיה בסעיף 5(טבלת חומרים).
2. שמור כתמונה זו כ"תמונת אזור העברה".
3. לאחר השמירה, לחצו על שכבת הרקע, לחצו לחיצה ימנית ולחצו על 'מחק שכבה'. פעולה זו אמורה להשאיר רק את קווי השריטה בתמונה (איור 3).
4. בעזרת הכלי מברשת (סמל מברשת) למלא את האזור בין קווי השריטה. התאם את צבע המברשת לצבע המשמש לצימורה של הקווים להעברה.
5. שנה את התמונה לגווני אפור כדי ליצור תמונה בשחור-לבן (תמונה>מצב>גווני אפור)ולאחר מכן שמור את התמונה (איור 4).
6. הפעל את תוכנת הניתוח (טבלת חומרים) ולאחר מכן פתח את הקובץ "אזור ההעברה" בתוכנת ניתוח.
7. כדי לקבוע את אזור קו ההעברה, לחץ על תמונה>כוונן>סף. אזור ההעברה השחור יהפוך לאדום ואזור האחוזים יצוין בתיבה סף. האזור ידווח כעוצב שטח שקו הנדידה מכסה בהשוואה לאזור כולו שנלכד בתמונה.
8. רשם את אזור האחוזים עבור שורת ההעברה וודא שערך זה מזווג למספר התאים הנודדים עבור אותה תמונה.

7. ניתוח נתונים

1. נרמל את מספר התאים הנודדים לאזור האחוזים של השריטה. חלק את מספר התאים ההעברה לפי אחוז ים של קו ההעברה (# תאים שהועברו % אזור ההעברה). עשה זאת לכל תמונה ולא ממוצע המבוסס על העברה לבאר.
2. לאחר נרמול ערכים לכל תמונה, הוסף את הערכים של שתי התמונות, המייצגות באר בודדת. ערך זה ישמש לניתוח גרפי וסטטיסטי. אם העיצוב הניסיוני הכיל העתקים מרובים. שכפול ערכים ממוצע לפני ניתוח סטטיסטי.

תוצאות

הליך זה מתעד גישה חדשה לחקר העברת תאים שהיא גם חסכונית וגם ניתנת להתאמה עבור רוב המעבדות. מחקרים רבים השתמשו במיקרוסקופ זמן לשגות כדי להעריך את העברת תאים, אבל הציוד הדרוש לשיטה זו אינו זמין בקלות למעבדות רבות. בעוד ניצול קווים ומקפים לתיכור מאפשר את היכולת ללכוד מחדש תחומי עניין ספציפיים ...

Discussion

גישה חדשה זו לבחינת העברת השריטות מספקת שיטה נגישה יותר לחוקרים לבחון שינויים בהדברת תאים. בעוד הודעה זו פועלת על פי אותו הליך לניהול שריטה דומה למאגרים אחרים של שריטה, היא מספקת שיטה חדשה להדמיה וניתוח מדויק של העברת תאים¹⁰. במקום להשתמש בשיטות עתירות ציוד של מיקרוסקופית זמן-?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase