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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine kostengünstige Methode zum Scratch-Migrationstest, die einen neuen Ansatz zur Bestimmung der Zellmigration ohne den Einsatz geräteintensiver Methoden bietet. Während Fibroblasten in diesem Protokoll verwendet wurden, kann es angepasst und verwendet werden, um zusätzliche Zelltypen und Einflüsse auf die Zellmigration zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Zellmigration ist eine Schlüsselkomponente sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Ereignissen. Normale Zellmigration ist für wesentliche Funktionen wie Entwicklung und Diemontage einer Immunantwort erforderlich. Wenn ein Defekt oder eine Veränderung mit dem Zellmigrationsprozess auftritt, kann es zu schädlichen Folgen kommen (d. h. Krebsmetastasen, Wundheilung und Narbenbildung). Aufgrund der Bedeutung der Zellmigration ist es notwendig, Zugang zu einem Zellmigrationstest zu haben, der erschwinglich, anpassungsfähig und wiederholbar ist. Unter Verwendung des gemeinsamen Scratch-Migration-Assays haben wir einen neuen Ansatz zur Analyse der Zellmigration entwickelt, bei dem allgemeine Laborgeräte verwendet werden. Die beschriebene Methode verwendet visuelle Marker, die es ermöglichen, bestimmte Interessenbereiche ohne Zeitraffermikroskopie zurückzuerobern. Darüber hinaus bietet es Flexibilität im experimentellen Design, von der Änderung des Migrationsmatrixsubstrats bis hin zur Zugabe von pharmakologischen Modifikatoren. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Möglichkeit, den Bereich der Zellmigration zu berücksichtigen, der bei der Untersuchung der Zellmigration nicht von mehreren Methoden berücksichtigt wird. Dieser neue Ansatz bietet einem größeren Publikum einen Scratch-Migrationstest und bietet Forschern mehr Möglichkeiten, die physiologischen und pathophysiologischen Auswirkungen der Zellmigration zu untersuchen.

Einleitung

Die Zellmigration ist für viele physiologische und pathologische Ereignisse von entscheidender Bedeutung. Es wird während der Entwicklung, für die Montage einer Immunantwort, und für die richtige Wundheilung1,2,3erforderlich. Viele dieser Zellmigrationsereignisse können durch physikalische oder chemische Signale ausgelöst werden. Zum Beispiel, während einer Immunantwort, Leukozyten wandern in Richtung einer Stelle der Verletzung als Reaktion auf ein Chemoattractant2. Darüber hinaus werden Leukozyten auch Zytokine freisetzen, um die Migration von zusätzlichen Immunzellen sowie anderer Zelltypen, wie Z. B. Fibroblasten, die am Wundheilungsprozess beteiligt sind, zu induzieren und somit eine mehrzellige Reaktion zu ingangsetzen4. Die Fähigkeit der Zellen zu migrieren ist wichtig für die richtige physiologische Funktion; Wenn jedoch die Zellmigration unkontrolliert bleibt, kann sie eine unerwünschte Reaktion haben und zu pathologischen Ereignissen wie chronischen Entzündungen, Gefäßerkrankungen, Krebsmetastasen und beeinträchtigter Wundheilung2,3,4,5,6,7beitragen. Beeinträchtigte Wundheilung ist eine häufige Beleidung von Diabetikern aufgrund von Defekten bei der Zellmigration, und wenn diese Defekte nicht behoben werden, kann dies zu weiteren Komplikationen führen (z.B. Amputation8,9). Diese Studie und andere haben die Notwendigkeit gezeigt, den Prozess, durch den die Zellmigration stattfindet, entweder unter normalen physiologischen oder pathologischen Bedingungen weiter zu verstehen, und es ist entscheidend für die Förderung dieses Forschungsfeldes. Um dies zu erreichen, müssen Migrationstests verfügbar sein, die sowohl zugänglich als auch erschwinglich für diejenigen Forscher sind, die möglicherweise nicht über die Ausrüstung verfügen, die für die Durchführung dieser Assays benötigt wird.

Derzeit stehen eine Vielzahl von Migrationstests zur Verfügung, um eine Vielzahl von Themen zur Zellmigration zu untersuchen. Es wurden sowohl 2D- als auch 3D-Migrationsmodelle entwickelt, die jeweils auf bestimmte Bereiche abzielen, die sich auf die Zellmigration auswirken. 3D-Migrationsmodelle werden in der Regel mit Zellinvasionsstudien in Verbindung gebracht und bewerten die Auswirkungen der extrazellulären Matrix auf die Zellmigration10,11,12, während 2D-Migrationsassays einen größeren Anwendungsbereich haben und in erster Linie zur Untersuchung von chemotaktischen Migration, Wundheilung und funktionellen Veränderungen während der Zellmigration13,14,15,16verwendet werden. Einige dieser Assays erfordern zusätzliche Ausrüstung, wie Boyden-Kammern oder Ausschlussringe, die die Verfügbarkeit dieser Assays für bestimmte Forscher reduzieren können. Einer der kosteneffizienteren Assays ist der Scratch-Assay, der typischerweise zur Beurteilung der Wundheilung und allgemeiner Veränderungen der Zellmigration14,17verwendet wird. Während die meisten Laboratorien für die Durchführung eines Kratzer-Assays ausgestattet sind, sind die Geräte, die zur Verfolgung der Zellmigration verwendet werden, in der Regel entweder nicht verfügbar oder zu teuer für den Kauf. Dazu gehört auch die Zeitraffermikroskopie, die ein invertiertes Mikroskop und ein Live-Bildgebungssystem erfordert. Diese teuren Geräte sind nicht für jedes Labor allgemein zugänglich. Daher unterstreicht diese Beobachtung die Notwendigkeit eines neuen Protokolls, das eine Bewertung der Zellmigration mit leichter verfügbaren Geräten ermöglicht.

Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine neue und kostengünstige Möglichkeit, die Zellmigration zu bewerten. Diese Methode folgt dem gleichen Verfahren, das mit Scratch-Assays verbunden ist, unterscheidet sich jedoch in der Analyse der Untersuchung der Zellmigration, indem Geräte verwendet werden, die in einem grundlegenden wissenschaftlichen Labor verfügbar sind. Dieses Protokoll mit gängigen Geräten ermöglicht eine genauere Bestimmung der Zellmigration ohne den Einsatz von Zeitraffermikroskopie. Neben der Bestimmung der Migration berücksichtigt diese Methode auch variable Faktoren im Scratch-Bereich, die sich stark auf die Zellmigration auswirken. Insgesamt bietet dieses neue Protokoll für die Zellmigrationsanalyse mehr Laboratorien die Möglichkeit, den Bereich der Zellmigration zu erforschen und dazu beizutragen.

Protokoll

1. Allgemeine Zellkultur

  1. Kultur-Herz-Fibroblasten in Dulbecco es Modified Eagles Medium (DMEM) mit 1 g/L Glukose, Natriumpyruvat, L-Glutamin und ergänzt mit 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 2% L-Glutamin und 0,02% antimikrobiellem Reagenz (siehe Materialtabelle) und imCO2-Inkubator bei 37 °C gehalten.
  2. Kultur-Herz-Fibroblasten bis 90-95% Konfluenz wird bei Durchgang 0 (P0) erreicht. An dieser Stelle sind die Fibroblasten bereit, in eine 48-Well-Platte aufgeteilt zu werden, die für den Migrationstest verwendet wird.

2. Vorbereitung der Migrationsplatte

  1. Bereiten Sie eine 48-Well-Zellkulturplatte vor, indem Sie eine Linie mit einem gelben oder hellen permanenten Marker in der Mitte des Brunnens zeichnen. Zeichnen Sie dann drei Hash-Markierungen, die den Brunnen in drei separate Interessenbereiche unterteilen. Diese Abschnitte werden für die Bildgebung verwendet.
    HINWEIS: Die Verwendung eines permanenten Lichtfarbmarkers ermöglicht eine einfache Abbildung migrierender Zellen. Dunkle Markierungen wie Schwarz oder Blau verhindern die Visualisierung migrierender Zellen.
  2. Bei der Beurteilung der Migration auf einem Substrat (z. B. Kollagen), beschichten Sie den Brunnen zu diesem Zeitpunkt nach Anweisungen und Konzentrationen, die für das spezifische Substrat verwendet werden.
  3. Platte 15.000-20.000 Herzfibroblasten, P1, in jeden Brunnen und Kulturzellen, unter normalen Kultivierungsbedingungen (Bedingungen im vorherigen Abschnitt aufgeführt), bis sie 90-95% Konfluenz erreichen. Die Konfluenz sollte zwischen 24-48 Stunden erreicht werden.
    HINWEIS: Achten Sie beim Einrichten der Migrationsplatte darauf, eine positive Steuerung (eine bekannte Migrationszelle, z. B. 3T3-Zellen18), eine negative Kontrolle (ungerrubbte Zellen) und einen leeren Brunnen einzuschließen.

3. Scratch Migration Assay & Fixierung

  1. Sobald die Zellen 90-95% Koninfluenza erreichen, entfernen Sie die Medien und kratzen Sie entlang der gezeichneten Linie mit einer sterilen P200 Pipettenspitze.
    HINWEIS: Eine P200 Pipettenspitze ist die übliche Pipettenspitze, die mit dem Kratzer-Assay10,14,19verwendet wird. Machen Sie auch nur einen Durchgang mit der P200-Spitze, da mehr als ein Versuch zu mehreren Kratzerlinien führen kann.
  2. Spülen Sie den Brunnen mit niedrigen Serummedien (1,5% FBS), um alle nicht angeschlossenen Herzfibroblasten zu entfernen.
  3. Fügen Sie jedem Brunnen 500 L mit niedrigem Serummedium hinzu. Wenn Sie pharmakologische Mittel verwenden, fügen Sie sie zu diesem Zeitpunkt hinzu.
    HINWEIS: Niedrige Serummedien werden verwendet, weil sie die Zellmigration ermöglichen/fördern und verhindert, dass sich Fibroblasten ausbreiten, was die Ergebnisse des Migrationsassays20verzerren könnte. Für dieses Protokoll wurden 1,5% FBS verwendet.
  4. Erfassen Sie 0 h-Bilder, bevor Sie die Fibroblasten in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C für 24 h inkubieren.
    1. Erfassen Sie 0 h-Bilder mit einem invertierten Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv. Nehmen Sie zwei 0 h Bilder pro Brunnen. Dies wird eine vollständigere Abdeckung der Migrationslinie ermöglichen.
    2. Positionieren Sie den Brunnen mit den Markierungen (Linie und Striche), um die obere Hälfte der Kratzlinie zu erfassen. Vermeiden Sie die Abbildung des mittleren Bindestrichs, um sicherzustellen, dass derselbe Migrationsbereich nicht zweimal abgebildet wird, was die Ergebnisse verzerren könnte.
    3. Verwenden Sie Bildgebungssoftware (Tabelle der Materialien), um 0 h Bild #1 zu erfassen. Bewegen Sie dann die Platte, um die untere Hälfte des Brunnens/der Kratzerlinie in Sichtweite der Kamera zu positionieren. Vermeiden Sie es erneut, den mittleren Strich einzufangen. Sobald Sie an Ort und Stelle sind, erfassen Sie 0 h Bild #2 (Abbildung 1).
      HINWEIS: Wenn Sie den mittleren Strich in beiden 0-h-Bildern vermeiden, wird verhindert, dass Migrationsbereiche doppelt erfasst werden, was, wenn dies geschieht, zu wiederholten Ergebnissen führen und die Daten verzerren könnte.
  5. Nach der Inkubation für 24 h, entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen, und waschen Sie den Brunnen mit 1x nichtsterilen PBS (fortan sind alle 1x PBS verwendet, ist nicht steril).
  6. In der Dunstabzugshaube 500 l 4% Paraformaldehyd in den Brunnen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) brüten.
  7. Paraformaldehyd entfernen und 3x mit 1x PBS für je 5 min bei RT waschen.
  8. Sobald die Zellen gewaschen sind, nehmen Sie 24-stunden-Bilder auf oder fügen Sie jedem Brunnen 1x PBS hinzu und platzieren Sie sie bis zu einem späteren Zeitpunkt bei 4 °C. Die Zellen können 1-2 Wochen bei 4 °C bleiben, bis sie bildbereit sind.
    1. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen 300 L permeabilisierende Lösung (1x PBS und 0,01 % Triton X-100) hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen/Platte mit sanftem, kontinuierlichem Schaukeln für 30 min bei RT.
    2. Entfernen Sie die Permeabilisizing-Lösung und fügen Sie 1% Coomassie Brilliant Blue Fleck (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% Essigsäure, 45% Methanol und 45% dH2O) für 10 min mit sanftem, kontinuierlichem Schaukeln bei RT hinzu.
      HINWEIS: Wenn Platten mit einem extrazellulären Matrixsubstrat beschichtet sind, sollten Sie eine beschichtete Platte mit Coomassie-Färbung testen, bevor Sie einen Migrationstest durchführen. Abbildung 2 zeigt, dass ein Matrixsubstrat mit diesem Test verwendet werden kann und keine Auswirkungen auf die Visualisierung von Zellen.
    3. Waschen Sie Die Brunnen 3x mit 1x PBS bei RT mit kontinuierlichem Schaukeln für jeweils 5 min.
    4. Nach dem Einwälten 300 l 1x PBS hinzugefügt und 24 h-Bilder aufnehmen.
    5. Erfassen Sie 24-h-Bilder, indem Sie den Brunnen an der gleichen Position ausrichten, die zum Erfassen der 0-h-Bilder verwendet wurde. Um dies zu erreichen, öffnen Sie die zuvor erfassten 0 h-Bilder und richten Sie die Markierung mit dem permanenten Marker an der gleichen Position aus. Die Linie in der Mitte und zusätzliche Strichmarken sollten eine enge Ausrichtung zwischen dem 24-h-Bild und dem 0-h-Bild ermöglichen (Abbildung 1).

4. Erstellung von 0 h und 24 h Bildern

  1. Öffnen Sie 0 h und 24 h Bilder, die vom gleichen Brunnen und Position in der Bildverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien) aufgenommen wurden.
  2. Erstellen Sie eine neue Ebene auf dem 0-h-Bild. Klicken Sie dann auf die neue Ebene, und ändern Sie den Namen des Layers in "Linienebene", indem Sie auf den Text doppelklicken.
    HINWEIS: Dieser Layer wird von diesem Punkt an als Linien-Layer bezeichnet.
  3. Klicken Sie auf das Pinselwerkzeug (Pinselsymbol) und legen Sie die Größe auf 10 px und die Farbe auf Rot fest.
  4. Zeichnen Sie mit dem ausgewählten Linien-Layer zwei separate Linien, die den Bereich des Kratzers umreißen. Die Linien sollten keine Zellen berühren, da diese Linien den Migrationsbereich markieren.
  5. Klicken Sie auf das Werkzeug verschieben (Pfeilsymbol), und drücken Sie dann die Strg-Taste nach unten, und klicken Sie auf die Linien- und Hintergrund-Layer.
  6. Klicken Sie in die Mitte des 0-h-Bildes und ziehen Sie beide Ebenen in die Mitte des 24-H-Bildes.
  7. Klicken Sie nun mit dem 24-Stunden-Bild auf die 0 h-Hintergrundebene und ändern Sie die Deckkraft auf 50 %.
  8. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt, klicken Sie sowohl auf den 0 h Hintergrund- als auch auf den Linien-Layer, und transformieren Sie dann die Layer (Bearbeiten>Freie Transformation). Richten Sie mit der freien Transformation den 0 h-Hintergrund und das Linienbild am 24-stunden-Hintergrundbild aus. Dieser Schritt führt zur Überlagerung des Bildes 0 h und 24 h, die notwendig ist, um die Linien, die den Bereich der Migration markieren, in der richtigen Position auf dem 24-h-Bild zu positionieren.
  9. Löschen Sie nach erfolgreicher Überlagerung der 0 h-Hintergrund- und Linienebenen auf das 24-h-Hintergrundbild die 0 h-Hintergrundebene. Löschen Sie, indem Sie auf die 0 h-Hintergrundebene klicken, dann mit der rechten Maustaste klicken und auf Layer löschen klicken.
  10. Wenn Sie das 0 h-Hintergrundbild löschen, bleibt nur die Linie und die 24-h-Hintergrundebene (jetzt als Migrationsbild bezeichnet). Der Linien-Layer gibt den Bereich Migration/Scratch auf dem 24-Stunden-Bild an und kann zum Bestimmen der Anzahl der migrierenden Zellen verwendet werden.
  11. Speichern als neues Migrationsbild als Photoshop-Datei und Als TIFF/JPEG. ANMERKUNG: Eine repräsentative Abbildung, die diesen Prozess darstellt, ist in Abbildung 3dargestellt.

5. Zählen der Anzahl der migrierenden Zellen

  1. Öffnen Sie das Migrationsbild. Dies kann in einem Programm erfolgen, das TIFF/JPEG-Dateien akzeptiert (Tabelle der Materialien).
  2. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die sich dazwischen befinden, und berühren Sie die beiden roten Linien.
  3. Zeichnen Sie die Anzahl der migrierenden Zellen pro Bild auf. Es gibt zwei migrierende Bilder pro Brunnen, und diese Werte sollten erst kombiniert werden, nachdem die Werte für den Migrationsbereich korrigiert wurden (im nächsten Abschnitt beschrieben).

6. Bestimmen des Migrationsbereichs

    7. Datenanalyse

    1. Normalisieren Sie die Anzahl der migrierenden Zellen in den prozentualen Bereich des Kratzers. Teilen Sie die Anzahl der migrierenden Zellen durch den prozentualen Bereich der Migrationslinie (- migrierte Zellen % Migrationsbereich). Führen Sie dies pro Bild und nicht einen Durchschnitt basierend auf der Migration pro Brunnen aus.
    2. Fügen Sie nach der Normalisierung der Werte pro Bild die Werte der beiden Bilder hinzu, die einen einzelnen Brunnen darstellen. Dieser Wert wird für grafische und statistische Analysen verwendet. Wenn der experimentelle Entwurf mehrere Replikationen enthielt. Durchschnittliche Replikationswerte vor der statistischen Analyse.

    Ergebnisse

    Dieses Verfahren dokumentiert einen neuen Ansatz zum Untersuchen der Zellmigration, der sowohl kostengünstig als auch für die meisten Labore leicht anpassungsfähig ist. Viele Studien haben Zeitraffermikroskopie verwendet, um die Zellmigration zu bewerten, aber die für diese Methode erforderliche Ausrüstung ist vielen Laboratorien nicht ohne weiteres zugänglich. Die Verwendung von Linien und Bindestrichen für die Abgrenzung ermöglicht die Möglichkeit, bestimmte Interessengebiete zu unterschiedlichen Zeitpunkten o...

    Diskussion

    Dieser neue Ansatz für den Scratch-Migration-Assay bietet Forschern eine leichter zugängliche Methode, um Veränderungen in der Zellmigration zu untersuchen. Während dieser Test dem gleichen Verfahren für die Verabreichung eines Kratzers ähnlich wie andere Scratch-Assays folgt, bietet er eine neue Methode für die Bildgebung und genaue Analyse der Zellmigration10. Anstatt geräteintensive Methoden der Zeitraffermikroskopie und Live-Zell-Bildgebungskammern zu verwenden, beschreibt diese Method...

    Offenlegungen

    Die Autoren haben nichts zu verraten.

    Danksagungen

    Diese Arbeit wird durch den US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, die University of Mississippi School of Pharmacy und das Department of BioMolecular Sciences unterstützt.

    Materialien

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Adobe All AppsAdobeThis includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
    Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterileMIDSCIAVR1Tips are autoclaved to sterilize
    AxioCam Erc 5s CameraZeiss426540-9901-000
    Coomassie Brilliant Blue R-250Fisher ScientificBP101-25
    Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 WellsFisher Scientific07-200-86
    DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvateFisher ScientificMT10014CM
    Image JNIHThis is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
    ParaformaldehydeFisher ScientificAC416785000
    Premium US origin fetal bovine serumInnovative ResearchIFBS-HU
    PrimocinInvivoGENant-pm-2This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
    Zeiss Primovert MicroscopeZeiss491206-0002-000
    Zen Blue Edition 2.3 softwareZeisssoftware comes with camera purchase

    Referenzen

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