Un test de migration à gratter rentable et adaptable

Résumé

Nous présentons une méthode rentable à l’essai de migration de rayures qui fournit une nouvelle approche pour déterminer la migration cellulaire sans l’utilisation de méthodes à forte intensité d’équipement. Bien que les fibroblastes aient été utilisés dans ce protocole, ils peuvent être adaptés et utilisés pour étudier d’autres types de cellules et influences sur la migration cellulaire.

Résumé

La migration cellulaire est un élément clé des événements physiologiques et pathologiques. La migration cellulaire normale est nécessaire pour les fonctions essentielles telles que le développement et le montage d’une réponse immunitaire. Lorsqu’un défaut ou une altération se produit avec le processus de migration cellulaire, il peut avoir des conséquences néfastes (c.-à-d. métastase du cancer, cicatrisation des plaies et formation de cicatrices). En raison de l’importance de la migration cellulaire, il est nécessaire d’avoir accès à un test de migration cellulaire abordable, adaptable et reproductible. En utilisant l’analyse commune de migration des rayures, nous avons développé une nouvelle approche pour analyser la migration cellulaire qui utilise l’équipement de laboratoire général. La méthode décrite utilise des marqueurs visuels qui permettent de reprendre des domaines d’intérêt spécifiques sans l’utilisation de la microscopie en accéléré. En outre, il offre une flexibilité dans la conception expérimentale, allant de la modification du substrat de la matrice de migration à l’ajout de modificateurs pharmacologiques. En outre, ce protocole décrit un moyen de rendre compte de la zone de migration cellulaire, qui n’est pas prise en compte par plusieurs méthodes lors de l’examen de la migration cellulaire. Cette nouvelle approche offre un test de migration à gratter à un public plus large et offrira aux chercheurs une plus grande occasion d’examiner l’impact physiologique et pathophysiologique de la migration cellulaire.

Introduction

La migration cellulaire est cruciale pour de nombreux événements physiologiques et pathologiques. Il est nécessaire pendant le développement, pour monter une réponse immunitaire, et pour la guérison appropriée de^{blessure 1,2,3.} Bon nombre de ces événements de migration cellulaire peuvent être déclenchés par des signaux physiques ou chimiques. Par exemple, au cours d’une réponse immunitaire, les leucocytes migreront vers un site de blessures en réponse à un chimioattractant². En outre, les leucocytes libéreront également des cytokines pour induire la migration des cellules immunitaires additionneuses, aussi bien que d’autres types de cellules, tels que des fibroblastes, qui sont impliqués dans le processus de guérison de blessure, et ainsi, initiant une réponse multicellulaire^4. La capacité des cellules à migrer est essentielle pour une fonction physiologique appropriée; cependant, quand la migration cellulaire passe inaperçue, elle peut avoir une réponse défavorable et contribuer aux événements pathologiques, tels que l’inflammation chronique, la maladie vasculaire, la métastase de cancer, et la guérison altérée de^{blessure 2,3,4,5,6,7.} La cicatrisation altérée des plaies est une affection courante chez les diabétiques en raison de défauts dans la migration cellulaire, et si ces défauts ne sont pas pris en compte, elle pourrait entraîner d’autres complications (p. ex., amputation^8,9). Cette étude, ainsi que d’autres, ont indiqué la nécessité de mieux comprendre le processus par lequel la migration cellulaire se produit, soit dans des conditions physiologiques ou pathologiques normales, et il est vital pour faire avancer ce domaine de recherche. Pour ce faire, il doit y avoir des analyses de migration disponibles qui sont à la fois accessibles et abordables pour les chercheurs, qui peuvent ne pas posséder l’équipement nécessaire pour effectuer ces analyses.

À l’heure actuelle, il existe une variété d’analyses migratoires disponibles pour examiner un large éventail de sujets concernant la migration cellulaire. Des modèles de migration 2D et 3D ont été développés, chacun ciblant des zones spécifiques impactant la migration cellulaire. Les modèles de migration 3D sont généralement associés à des études d’invasion cellulaire et évaluent l’impact de la matrice extracellulaire sur la migration^{cellulaire 10,11,12}, tandis que les tests de migration 2D ont une plus grande gamme d’application et sont principalement utilisés pour étudier la migration chimoactique, la cicatrisation des plaies et les changements fonctionnels pendant la migration^{cellulaire 13,14,15,16}. Plusieurs de ces analyses nécessitent de l’équipement supplémentaire, comme des chambres Boyden ou des anneaux d’exclusion, ce qui peut réduire la disponibilité de ces tests pour certains chercheurs. Un des analyses les plus rentables est l’analyse à gratter, qui est généralement utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies et les changements généraux dans la migration^{cellulaire 14,17}. Bien que la plupart des laboratoires soient équipés pour effectuer un test d’éraflure, l’équipement utilisé pour suivre la migration cellulaire a tendance à être indisponible ou trop coûteux à acheter. Cela inclut la microscopie en accéléré, qui nécessite un microscope inversé et un système d’imagerie en direct. Ces pièces d’équipement coûteuses ne sont pas couramment accessibles à tous les laboratoires. Par conséquent, cette observation souligne la nécessité d’un nouveau protocole qui permette l’évaluation de la migration cellulaire avec un équipement plus facilement disponible.

Le protocole présenté ici fournit un moyen nouveau et abordable d’évaluer la migration cellulaire. Cette méthode suit la même procédure associée aux essais à gratter, mais diffère dans l’analyse de l’examen de la migration cellulaire en utilisant l’équipement plus couramment disponible dans un laboratoire de sciences fondamentales. Ce protocole utilisant l’équipement commun permet une détermination plus précise de la migration cellulaire sans l’utilisation de la microscopie time-lapse. En plus de déterminer la migration, cette méthode explique également les facteurs variables dans la zone d’éraflure qui a été noté pour avoir un impact considérable sur la migration cellulaire. Dans l’ensemble, ce nouveau protocole d’analyse de la migration cellulaire offre à un plus grand nombre de laboratoires l’occasion d’explorer et de contribuer au domaine de la migration cellulaire.

Protocole

1. Culture cellulaire générale

1. Fibroblastes cardiaques de culture dans le milieu modifié d’aigles de Dulbecco (DMEM) contenant le glucose de 1 g/L, pyruvate de sodium, L-glutamine, et complété par 14,2 mM NaHCO₃, 14,9 mM HEPES, 15% sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 2% L-glutamine, et 0,02% réavant antimicrobien (voir tableau des matériaux) et maintenu dans l’incubateur de CO₂ à 37 °C.
2. Les fibroblastes cardiaques de culture jusqu’à 90-95% confluent est atteint au passage 0 (P0). À ce stade, les fibroblastes sont prêts à être divisés en une plaque de 48 puits, qui est utilisé pour l’analyse de migration.

2. Préparation de la plaque de migration

1. Préparez une plaque de culture cellulaire de 48 puits en dessinant une ligne, à l’aide d’un marqueur permanent jaune ou de couleur claire, au centre du puits. Ensuite, dessinez trois marques de hachage qui divisent le puits en trois domaines d’intérêt distincts. Ces sections seront utilisées pour l’imagerie.
   REMARQUE : L’utilisation d’un marqueur permanent de couleur claire permettra une imagerie facile des cellules migrées. Les marqueurs foncés tels que le noir ou le bleu empêcheront la visualisation des cellules migrantes.
2. Si vous évaluez la migration sur un substrat (p. ex., collagène), enduire le puits en ce moment en suivant les instructions et les concentrations utilisées pour le substrat spécifique.
3. Plaque ~15.000-20.000 fibroblastes cardiaques, P1, dans chaque puits et cellules de culture, dans des conditions normales de culturisme (conditions énumérées dans la section précédente), jusqu’à ce qu’ils atteignent 90-95% confluency. La confluence doit être atteinte entre 24 et 48 heures.
   REMARQUE : Lors de la mise en place de la plaque de migration, assurez-vous d’inclure un contrôle positif (une cellule migratrice connue, comme les cellules 3T3^18),un contrôle négatif (cellules non sécrables) et un puits vierge.

3. Essai de migration de éraflure et fixation

1. Une fois que les cellules atteignent la confluence de 90-95%, retirez le média et grattez le long de la ligne tracée à l’aide d’une pointe stérile de pipette P200.
   REMARQUE : Une pointe de pipette P200 est la pointe commune de pipette de taille employée avec l’essai^{d’égratignure 10,14,19.} En outre, ne faire qu’une seule passe avec la pointe P200 que plus d’une tentative peut entraîner plusieurs lignes de rayures.
2. Rincer le puits avec un faible sérum (1,5% FBS) pour enlever les fibroblastes cardiaques non attachés.
3. Ajouter 500 μL de faible teneur en sérum à chaque puits. Si vous utilisez des agents pharmacologiques, ajoutez-les en ce moment.
   REMARQUE : Un faible média sérique est utilisé parce qu’il permet/favorise la migration cellulaire et empêche les fibroblastes de proliférer, ce qui pourrait fausser les résultats de l’analyse de migration²⁰. Pour ce protocole, 1,5% FBS a été utilisé.
4. Capturez des images de 0 h avant d’incuber les fibroblastes dans un incubateur de CO_{2 à} 37 °C pendant 24 h.
   1. Capturez des images de 0 h à l’aide d’un microscope inversé avec un objectif 20x. Prenez deux images de 0 h par puits. Cela permettra une couverture plus complète de la ligne de migration.
   2. À l’aide des marques (ligne et tirets), placez le puits pour capturer la moitié supérieure de la ligne de rayures. Évitez d’imaginer le tiret du milieu pour vous assurer que la même zone de migration n’est pas photographiée deux fois, ce qui pourrait fausser les résultats.
   3. Utilisez un logicield’imagerie ( Tableau des matériaux) pour capturer 0 h d’image #1. Déplacez ensuite la plaque pour positionner la moitié inférieure du puits/ligne de rayures en vue de la caméra. Encore une fois, évitez de capturer le tiret du milieu. Une fois en place, capturez l’image de 0 h #2(figure 1).
      REMARQUE : Éviter le tiret du milieu dans les deux images de 0 h empêchera de capturer deux fois les zones de migration qui, si elles sont faites, pourraient produire des résultats répétés et fausser les données.
5. Après avoir couvé pendant 24 h, retirez le média du puits et lavez le puits avec 1x PBS non stérile (désormais tous les 1x PBS utilisés sont non stériles).
6. Dans le capot des vapeurs, ajouter 500 μL de paraformaldéhyde de 4 % au puits et incuber pendant 10 minutes à température ambiante (RT).
7. Retirer le paraformaldéhyde et laver 3x avec 1x PBS pendant 5 min chacun à RT.
8. Une fois les cellules lavées, procéder à la capture d’images de 24 h ou ajouter 1x PBS à chaque puits et placer à 4 °C jusqu’à une date ultérieure. Les cellules peuvent rester à 4 °C pendant 1 à 2 semaines jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être image.
   1. Perméabiliser les cellules en ajoutant 300 μL de solution permeabilizing (1x PBS et 0,01% triton X-100) à chaque puits. Incuber les cellules/plaque avec un basculement doux et continu pendant 30 min à RT.
   2. Retirer la solution perméabilisante et ajouter 1% coomassie brilliant blue tache (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% acide acétique, 45% méthanol, et 45% dH₂O) pendant 10 min avec doux, basculement continu à RT.
      REMARQUE : Si les plaques sont recouvertes d’un substrat matriciel extracellulaire, assurez-vous de tester une plaque enduite de taches Coomassie avant d’effectuer un test de migration. La figure 2 démontre qu’un substrat matriciel peut être utilisé avec cet essai et ne pas avoir d’impact sur la visualisation des cellules.
   3. Laver les puits 3x avec 1x PBS à RT avec bascule continue pendant 5 min chacun.
   4. Après les lavages, ajouter 300 μL de 1x PBS et capturer des images de 24 h.
   5. Capturez des images à 24 h en alignant le puits dans la même position que celle utilisée pour capturer les images de 0 h. Pour ce faire, ouvrez les images de 0 h précédemment capturées et en utilisant le marquage effectué avec le marqueur permanent, alignez le puits dans la même position. La ligne au milieu et les marques de tiret supplémentaires devraient permettre un alignement étroit entre l’image de 24 h et l’image de 0 h (figure 1).

4. Préparation d’images de 0 h et 24 h

1. Ouvrez des images de 0 h et 24 h prises du même puits et de la même position dans les logicielsd’imagerie ( Tableau des matériaux).
2. Créez une nouvelle couche sur l’image de 0 h. Ensuite, cliquez sur la nouvelle couche et changez le nom de la couche en « couche de ligne » en cliquant deux fois sur le texte.
   REMARQUE : Cette couche sera appelée couche de ligne à partir de ce point.
3. Cliquez sur l’outil Brush (icône brosse) et réglez la taille à 10 px et la couleur au rouge.
4. Avec la couche de ligne sélectionnée, dessinez deux lignes distinctes qui décrivent la zone de l’égratignure. Les lignes ne doivent toucher aucune cellule en raison de ces lignes marquant la zone de migration.
5. Cliquez sur l’outil Move (icône flèche) puis appuyez sur le bouton Ctrl et cliquez à la fois sur la ligne et les couches d’arrière-plan.
6. Cliquez au centre de l’image de 0 h et faites glisser ces deux couches au milieu de l’image de 24 h.
7. Maintenant, en utilisant l’image 24 h, cliquez sur la couche de fond de 0 h et de changer l’opacité à 50%.
8. En tenant le bouton Ctrl, cliquez à la fois sur l’arrière-plan de 0 h et la couche de ligne, puis transformez librement les couches (Edit >Free Transform). En utilisant la transformation libre, alignez l’image de fond et de ligne de 0 h sur l’image de fond de 24 h. Cette étape se traduit par la superposition de l’image de 0 h et 24 h, ce qui est nécessaire pour positionner les lignes qui marquent la zone de migration dans la bonne position sur l’image de 24 h.
9. Après avoir réussi à superposer les couches d’arrière-plan et de ligne de 0 h sur l’image de fond de 24 h, supprimez la couche d’arrière-plan de 0 h. Supprimer en cliquant sur la couche d’arrière-plan de 0 h, puis cliquez à droite, et cliquez sur supprimer la couche.
10. La suppression de l’image de fond de 0 h ne laissera que la ligne et la couche d’arrière-plan de 24 h (maintenant appelée image de migration). La couche de ligne indiquera la zone de migration/égratignure sur l’image de 24 h et peut être utilisée pour déterminer le nombre de cellules migrantes.
11. Enregistrer comme la nouvelle image de migration à la fois comme un fichier Photoshop et un TIFF / JPEG. REMARQUE : une figure représentative qui décrit ce processus est présentée à la figure 3.

5. Compter le nombre de cellules migrées

1. Ouvrez l’image de migration. Cela peut être fait dans un programme qui accepte les fichiers TIFF / JPEG (Tableau des matériaux).
2. Comptez le nombre de cellules qui se trouvent entre les deux et touchez les deux lignes rouges.
3. Enregistrez le nombre de cellules migrantes par image. Il y aura deux images de migration par puits, et ces valeurs ne devraient pas être combinées avant que les valeurs aient été corrigées pour la zone de migration (détaillée dans la section suivante).

6. Déterminer la zone de migration

1. Ouvrez l’image 24 h qui contient les lignes de migration dans le logiciel d’imagerie dans la section 5 (Tableau des matériaux).
2. Enregistrer comme cette image comme « Image zone de migration ».
3. Après avoir sauvé, cliquez sur la couche d’arrière-plan, cliquez à droite et cliquez sur supprimer la couche. Cela ne devrait laisser que les lignes de rayures sur l’image( Figure 3).
4. À l’aide de l’outil brush (icône brosse) remplir la zone entre les lignes de rayures. Faire correspondre la couleur de la brosse avec la couleur utilisée pour tracer les lignes pour la migration.
5. Changez l’image en une échelle grise pour générer une image en noir et blanc (Image >Mode>Grayscale) puis enregistrer l’image (Figure 4).
6. Démarrez le logicield’analyse ( Tableau des matériaux) puis ouvrez le fichier « Zone de migration » dans le logiciel d’analyse.
7. Pour déterminer la zone de la ligne de migration, cliquez sur Image>Adjust>Threshold. La zone de migration noire deviendra rouge et la zone en pourcentage sera indiquée dans la case Seuil. La zone sera signalée comme le pourcentage de la zone que couvre la ligne de migration par rapport à l’ensemble de la zone capturée dans l’image.
8. Enregistrez la zone de pourcentage pour la ligne de migration et assurez-vous que cette valeur est jumelée avec le nombre de cellules migratives pour la même image.

7. Analyse des données

1. Normalisez le nombre de cellules migrantes jusqu’à la zone en pourcentage de l’égratignure. Diviser le nombre de cellules migrateurs par la zone de pourcentage de la ligne de migration (# cellules migrées % Zone de migration). Faites ceci par image et non pas une moyenne basée sur la migration par puits.
2. Après avoir normalisé les valeurs par image, ajoutez les valeurs des deux images, ce qui représente un puits individuel. Cette valeur sera utilisée pour l’analyse graphique et statistique. Si la conception expérimentale contenait plusieurs répliques. Valeurs moyennes de réplique avant analyse statistique.

Résultats

Cette procédure documente une nouvelle approche de l’étude de la migration cellulaire qui est à la fois rentable et facilement adaptable pour la plupart des laboratoires. De nombreuses études ont utilisé la microscopie en accéléré pour évaluer la migration cellulaire, mais l’équipement nécessaire à cette méthode n’est pas facilement accessible à de nombreux laboratoires. Considérant que l’utilisation de lignes et de tirets pour la démarcation permet de récupérer des zones d’intérêt spécifiq...

Discussion

Cette nouvelle approche de l’analyse de la migration des rayures offre aux chercheurs une méthode plus accessible pour examiner les changements dans la migration cellulaire. Bien que cet essai suive la même procédure pour administrer une égratignure semblable à d’autres analyses de rayures, il fournit une nouvelle méthode pour l’imagerie et l’analyse précise de la migration cellulaire¹⁰. Au lieu d’utiliser des méthodes intensives d’équipement de microscopie en accéléré et d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase