Um ensaio de migração de arranhões econômico e adaptável

Resumo

Apresentamos um método econômico para o ensaio de migração de arranhões que fornece uma nova abordagem para determinar a migração celular sem o uso de métodos intensivos em equipamentos. Embora os fibroblastos tenham sido usados neste protocolo, ele pode ser adaptado e utilizado para estudar tipos e influências adicionais de células na migração celular.

Resumo

A migração celular é um componente-chave em eventos fisiológicos e patológicos. A migração celular normal é necessária para funções essenciais, como o desenvolvimento e a montagem de uma resposta imune. Quando ocorre um defeito ou alteração com o processo de migração celular, ele pode ter desfechos prejudiciais (ou seja, metástase do câncer, cicatrização de feridas e formação de cicatrizes). Devido à importância da migração celular, é necessário ter acesso a um ensaio de migração celular acessível, adaptável e repetível. Utilizando o ensaio comum de migração de arranhões, desenvolvemos uma nova abordagem para analisar a migração celular que utiliza equipamentos de laboratório gerais. O método descrito utiliza marcadores visuais que permitem a recapturação de áreas específicas de interesse sem o uso de microscopia de lapso de tempo. Além disso, proporciona flexibilidade no design experimental, desde a alteração do substrato da matriz migratória até a adição de modificadores farmacológicos. Além disso, este protocolo descreve uma forma de explicar a área de migração celular, que não é considerada por vários métodos ao examinar a migração celular. Esta nova abordagem oferece um ensaio de migração de arranhões para um público maior e proporcionará maior oportunidade para os pesquisadores examinarem o impacto fisiológico e fisiofisiológico da migração celular.

Introdução

A migração celular é crucial para muitos eventos fisiológicos e patológicos. É necessário durante o desenvolvimento, para a montagem de uma resposta imune, e para a cicatrização adequada da ferida^1,2,3. Muitos desses eventos de migração celular podem ser desencadeados por sinais físicos ou químicos. Por exemplo, durante uma resposta imune, os leucócitos migrarão para um local de lesão em resposta a um quimioattractant². Além disso, os leucócitos também liberarão citocinas para induzir a migração de células imunes adicionais, bem como outros tipos de células, como os fibroblastos, que estão envolvidos no processo de cicatrização da ferida, e assim, iniciando uma resposta multicelular⁴. A capacidade das células de migrar é essencial para uma função fisiológica adequada; no entanto, quando a migração celular passa descontrolada, pode ter uma resposta adversa e contribuir para eventos patológicos, como inflamação crônica, doença vascular, metástase do câncer e cicatrização de feridas^{prejudicadas 2,3,4,5,6,7}. A cicatrização de feridas prejudicadas é uma aflição comum de diabéticos devido a defeitos na migração celular, e se esses defeitos não forem resolvidos, pode levar a complicações adicionais (por exemplo, amputação^8,9). Este estudo, assim como outros, indicou a necessidade de compreender melhor o processo pelo qual ocorre a migração celular, seja em condições fisiológicas normais ou patológicas, e é vital para promover esse campo de pesquisa. Para isso, é preciso que haja ensaios migratórios disponíveis, acessíveis e acessíveis aos pesquisadores, que podem não possuir os equipamentos necessários para a realização desses ensaios.

Atualmente, há uma variedade de ensaios migratórios disponíveis para examinar uma ampla gama de tópicos sobre migração celular. Ambos os modelos de migração 2D e 3D foram desenvolvidos, cada um visando áreas específicas que impactam a migração celular. Modelos de migração 3D são tipicamente associados a estudos de invasão celular e avaliam o impacto da matriz extracelular na migração celular^10,11,12, enquanto os ensaios de migração 2D têm uma maior gama de aplicações e são usados principalmente para estudar migração quimotactica, cicatrização de feridas e alterações funcionais durante a migração celular^13,14,15,16. Vários desses ensaios exigem equipamentos adicionais, como câmaras de Boyden ou anéis de exclusão, o que pode reduzir a disponibilidade desses ensaios para certos pesquisadores. Um dos ensaios mais econômicos é o ensaio de arranhões, que é normalmente usado para avaliar a cicatrização de feridas e mudanças gerais na migração celular^14,17. Embora a maioria dos laboratórios esteja equipada para realizar um ensaio de arranhões, os equipamentos usados para rastrear a migração celular tendem a ser indisponíveis ou muito caros para comprar. Isso inclui microscopia de lapso de tempo, que requer um microscópio invertido e um sistema de imagem ao vivo. Esses equipamentos caros não são comumente acessíveis a todos os laboratórios. Portanto, esta observação destaca a necessidade de um novo protocolo que permita a avaliação da migração celular com equipamentos mais facilmente disponíveis.

O protocolo aqui apresentado fornece uma nova e acessível maneira de avaliar a migração celular. Este método segue o mesmo procedimento associado a ensaios de risco, mas difere na análise da migração celular examinando utilizando equipamentos mais comumente disponíveis em um ambiente de laboratório de ciências básicas. Este protocolo usando equipamento comum permite uma determinação mais precisa da migração celular sem o uso de microscopia de lapso de tempo. Além de determinar a migração, esse método também contabiliza fatores variáveis na área de risco que tem sido notados como um impacto muito grande na migração celular. No geral, este novo protocolo de análise de migração celular oferece uma oportunidade para mais laboratórios explorarem e contribuirem para o campo da migração celular.

Protocolo

1. Cultura geral de células

1. Fibroblastos cardíacos de cultura no Meio de Águias Modificadas (DMEM) de Dulbecco contendo 1 g/L de glicose, Piruvato de sódio, L-glutamina, e suplementado com 14,2 mM NaHCO₃, 14,9 mM HEPES, 15% de soro bovino fetal inativado térmico (FBS), 2% L-glutamina e 0,02% reagente antimicrobiano (ver Tabela de Materiais) e mantido na incubadora CO₂ a 37 °C.
2. Fibroblastos cardíacos de cultura até 90-95% de confluência é alcançado na passagem 0 (P0). Neste ponto, os fibroblastos estão prontos para serem divididos em uma placa de 48 poços, que é usada para o ensaio de migração.

2. Preparação da placa de migração

1. Prepare uma placa de cultura celular de 48 poços desenhando uma linha, usando um marcador permanente amarelo ou de cor clara, no centro do poço. Em seguida, desenhe três hash marks dividindo o poço em três áreas de interesse separadas. Estas seções serão usadas para imagens.
   NOTA: O uso de um marcador permanente de cor clara permitirá uma imagem fácil das células migratórias. Marcadores escuros como preto ou azul impedirão a visualização de células migratórias.
2. Se avaliar a migração em um substrato (por exemplo, colágeno), cubra o poço neste momento seguindo instruções e concentrações utilizadas para o substrato específico.
3. Placa ~15.000-20.000 fibroblastos cardíacos, P1, em cada célula de poço e cultura, em condições normais de cultivo (condições listadas na seção anterior), até atingirem 90-95% de confluência. A confluência deve ser alcançada entre 24-48 horas.
   NOTA: Ao configurar a placa de migração certifique-se de incluir um controle positivo (uma célula migratória conhecida, como células 3T3^18),um controle negativo (células nãotched) e um poço em branco.

3. Ensaio e fixação de migração de arranhões

1. Uma vez que as células atinjam 90-95% de confluência, remova a mídia e arranhe ao longo da linha desenhada usando uma ponta de pipeta P200 estéril.
   NOTA: Uma ponta de pipeta P200 é a ponta comum de pipeta usada com o ensaio de arranhão^10,14,19. Além disso, apenas faça uma passagem com a ponta P200, pois mais de uma tentativa pode resultar em múltiplas linhas de arranhão.
2. Enxágüe o poço com baixa mídia sárida (1,5% FBS) para remover quaisquer fibroblastos cardíacos não ligados.
3. Adicione 500 μL de baixa mídia sármia a cada poço. Se usar algum agente farmacológico, adicione-os neste momento.
   NOTA: A baixa mídia sérico é usada porque permite/promove a migração celular e impede a proliferação de fibroblastos que podem distorcer os resultados do ensaio migratório²⁰. Para este protocolo, foi utilizado 1,5% de FBS.
4. Capture 0h imagens antes de incubar os fibroblastos em uma incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C por 24 h.
   1. Capture imagens de 0 h usando um microscópio invertido com um objetivo de 20x. Tire duas imagens de 0 h por poço. Isso permitirá uma cobertura mais completa da linha de migração.
   2. Usando as marcas (linha e traços), posicione o poço para capturar a metade superior da linha de arranhão. Evite a imagem do painel do meio para garantir que a mesma área de migração não seja imagem duas vezes, o que pode distorcer os resultados.
   3. Use software de imagem(Tabela de Materiais) para capturar #1 de imagem de 0 h. Em seguida, mova a placa para posicionar a metade inferior do bem/linha de arranhão em vista da câmera. Novamente, evite capturar o traço do meio. Uma vez no lugar, capture 0h imagem #2(Figura 1).
      NOTA: Evitar o traço médio em ambas as imagens de 0h evitará capturar áreas de migração duas vezes que, se feitas, poderiam produzir resultados repetitivos e distorcer os dados.
5. Depois de incubar por 24h, remova a mídia do poço e lave o poço com PBS 1x nonsterile (de agora em diante todos os 1x PBS usados não são téris).
6. Na capa de fumaça, adicione 500 μL de 4% de paraformaldeído ao poço e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente (RT).
7. Remova o paraformaldeído e lave 3x com 1x PBS por 5 min cada no RT.
8. Uma vez lavadas as células, proceda à captura de imagens de 24 h ou adicione 1x PBS a cada poço e coloque a 4 °C até um horário posterior. As células podem ficar a 4 °C por 1-2 semanas até ficarem prontas para a imagem.
   1. Permeabilize as células adicionando 300 μL de solução permeabilizing (1x PBS e 0,01% triton X-100) a cada poço. Incubar células/placas com balanço suave e contínuo por 30 min no RT.
   2. Remova a solução de permeabilização e adicione 1% de corroma da corroísia brilhante azul (3% Coomassie Azul Brilhante, 10% ácido acético, 45% metanol e 45% dH₂O) por 10 minutos com balanço suave e contínuo na RT.
      NOTA: Se as placas forem revestidas com um substrato de matriz extracelular, certifique-se de testar uma placa revestida com coloração coomassie antes de realizar o ensaio de migração. A Figura 2 demonstra que um substrato matricial pode ser usado com este ensaio e não com a visualização de impacto das células.
   3. Lave os poços 3x com 1x PBS no RT com balanço contínuo por 5 min cada.
   4. Após lavagens, adicione 300 μL de 1x PBS e capture imagens de 24h.
   5. Capture imagens de 24h alinhando o poço na mesma posição usada para capturar as imagens de 0h. Para isso, abra as imagens 0h anteriormente capturadas e usando a marcação feita com o marcador permanente, alinhe o poço na mesma posição. A linha abaixo das marcas de traço médio e adicional deve permitir um alinhamento próximo entre a imagem de 24h e a imagem de 0h(Figura 1).

4. Preparação de imagens de 0h e 24 h

1. Abra 0h e 24h imagens tiradas do mesmo poço e posição em software de imagem(Tabela de Materiais).
2. Crie uma nova camada na imagem de 0h. Em seguida, clique na nova camada e altere o nome da camada para "camada de linha" clicando duas vezes no texto.
   NOTA: Esta camada será referida como camada de linha a partir deste ponto.
3. Clique na Ferramenta de escova (ícone de escova) e ajuste o tamanho em 10 px e a cor para vermelho.
4. Com a camada de linha selecionada, desenhe duas linhas separadas que delineiam a área do arranhão. As linhas não devem tocar em nenhuma célula devido a essas linhas que marcam a área de migração.
5. Clique na Ferramenta mover (ícone de seta) e pressione o botão Ctrl e clique nas camadas de linha e de fundo.
6. Clique no centro da imagem de 0h e arraste ambas as camadas para o meio da imagem de 24h.
7. Agora, usando a imagem de 24h, clique na camada de fundo de 0h e altere a opacidade para 50%.
8. Segurando o botão Ctrl, clique na camada de fundo e linha de 0h e, em seguida, transforme livremente as camadas (Editar>Transformar Livre). Usando a transformação livre, alinhe o fundo 0h e a imagem da linha à imagem de fundo de 24 horas. Esta etapa resulta na sobreposição da imagem de 0h e 24h, necessária para posicionar as linhas que marcam a área de migração na posição correta na imagem de 24h.
9. Após sobreposição bem sucedida do fundo de 0h e camadas de linha na imagem de fundo de 24 horas, exclua a camada de fundo de 0 h. Exclua clicando na camada de fundo de 0 h, em seguida, clique com o botão direito do mouse e clique em excluir camada.
10. A exclusão da imagem de fundo de 0h deixará apenas a linha e a camada de fundo de 24h (agora chamada de imagem de migração). A camada de linha indicará a área de migração/arranhão na imagem de 24h e pode ser usada para determinar o número de células migratórias.
11. Salve como a nova imagem de migração como um arquivo photoshop e um TIFF/JPEG. NOTA: uma figura representativa que retrata esse processo é apresentada na Figura 3.

5. Contando o número de células migratórias

1. Abra a imagem de migração. Isso pode ser feito em um programa que aceita arquivos TIFF/JPEG(Tabela de Materiais).
2. Conte o número de células que estão localizadas no meio, bem como toque as duas linhas vermelhas.
3. Regisso o número de células migratórias por imagem. Haverá duas imagens migratórias por poço, e esses valores não devem ser combinados até que os valores tenham sido corrigidos para área de migração (detalhados na próxima seção).

6. Determinar a área de migração

1. Abra a imagem de 24h que contém as linhas de migração no programa de software de imagem na seção 5 (Tabela de Materiais).
2. Salve Como esta imagem como "Imagem da área de migração".
3. Depois de salvar, clique na camada de fundo, clique com o botão direito do mouse e clique em excluir camada. Isso deve deixar apenas as linhas de arranhão na imagem(Figura 3).
4. Utilizando a ferramenta de escova (ícone de escova) preencha a área entre as linhas de risco. Combine a cor do pincel com a cor usada para desenhar as linhas para migração.
5. Mude a imagem para uma escala de cinza para gerar uma imagem em preto e branco(Image>Mode>Grayscale) e, em seguida, salvar a imagem(Figura 4).
6. Inicie o software de análise (Tabela de Materiais) e, em seguida, abra o arquivo "Área de Migração" dentro do software de análise.
7. Para determinar a área da linha de migração, clique em Imagem>Ajuste>Limiar. A área de migração preta ficará vermelha e a área percentual será indicada na caixa Limiar. A área será relatada como a porcentagem da área que a linha de migração cobre em comparação com toda a área capturada na imagem.
8. Regiss qual é a área percentual para a linha de migração e certifique-se de que esse valor seja emparelhado com o número de células migratórias para a mesma imagem.

7. Análise de dados

1. Normalizar o número de células migratórias para a área percentual do arranhão. Divida o número de células migratórias pela área percentual da linha de migração (# células migradas % Área de migração). Faça isso por imagem e não uma média baseada na migração por poço.
2. Após normalizar valores por imagem, adicione os valores das duas imagens, o que representa um bem individual. Este valor será utilizado para análise gráfica e estatística. Se o projeto experimental contivesse várias réplicas. Valores médios de replicação antes da análise estatística.

Resultados

Este procedimento documenta uma nova abordagem para estudar a migração celular que é ao mesmo tempo econômica e facilmente adaptável para a maioria dos laboratórios. Muitos estudos têm usado microscopia de lapso de tempo para avaliar a migração celular, mas o equipamento necessário para este método não está prontamente disponível para muitos laboratórios. Considerando que a utilização de linhas e traços para demarcação permite a capacidade de recapturar áreas específicas de interesse em diferentes p...

Discussão

Essa nova abordagem do ensaio de migração de arranhões fornece um método mais acessível para os pesquisadores examinarem as mudanças na migração celular. Embora este ensaio siga o mesmo procedimento para administrar um arranhão semelhante a outros ensaios de risco, ele fornece um novo método para imagem e análise precisa da migração celular¹⁰. Em vez de usar métodos intensivos em equipamentos de microscopia de lapso de tempo e câmaras de imagem de células vivas, este método detalh...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase