Экономически эффективный и адаптируемый анализ миграции царапин

Резюме

Мы представляем экономически эффективный метод анализа миграции царапин, который обеспечивает новый подход к определению миграции клеток без использования интенсивных методов. Хотя фибробласты были использованы в этом протоколе, он может быть адаптирован и использован для изучения дополнительных типов клеток и влияний на миграцию клеток.

Аннотация

Миграция клеток является ключевым компонентом как физиологических, так и патологических явлений. Нормальная миграция клеток необходима для основных функций, таких как развитие и монтаж иммунного ответа. Когда дефект или изменение происходит с процессом миграции клеток, это может иметь пагубные последствия (т.е. метастазы рака, заживление ран, и рубцовое образование). В связи с важностью миграции клеток необходимо иметь доступ к анализу миграции клеток, который является доступным, адаптируемым и повторяемым. Используя общий анализ миграции царапин, мы разработали новый подход к анализу миграции клеток, использующий общее лабораторное оборудование. В описанном методе используются визуальные маркеры, позволяющие отвоевать конкретные области, представляющие интерес, без использования замедленной микроскопии. Кроме того, он обеспечивает гибкость в экспериментальной конструкции, начиная от изменения субстрата матрицы миграции и до добавления фармакологических модификаторов. Кроме того, в этом протоколе излагается способ учета области миграции клеток, который не учитывается несколькими методами при изучении миграции ячееок. Этот новый подход предлагает анализ миграции царапин для более широкой аудитории и предоставит больше возможностей для исследователей, чтобы изучить физиологическое и патофизиологическое воздействие миграции клеток.

Введение

Миграция клеток имеет решающее значение для многих физиологических, а также патологических событий. Это необходимо во время развития, для монтажа иммунного ответа, а также для правильного^{заживления ран 1,2,3.} Многие из этих событий миграции клеток могут быть вызваны физическими или химическими сигналами. Например, во время иммунного ответа, лейкоциты будут мигрировать к месту травмы в ответ на химиотерапию². Кроме того, лейкоциты будут также выпускать цитокины, чтобы вызвать миграцию дополнительных иммунных клеток, а также других типов клеток, таких как фибробласты, которые участвуют в процессе заживления ран, и, таким образом, инициируя многоклеточный^{ответ 4}. Способность клеток мигрировать имеет важное значение для правильной физиологической функции; однако, когда миграция клеток проходит бесконтрольно, она может иметь неблагоприятную реакцию и способствовать патологическим событиям, таким как хроническое воспаление, сосудистые заболевания, метастазы^{рака, и нарушение заживления ран 2,3,4,5,6,7.} Нарушение заживления ран является распространенным недугом диабетиков из-за дефектов в миграции клеток, и если эти дефекты не рассматриваются, это может привести к дальнейшим осложнениям (например,^{ампутация 8,9}). Это исследование, как и другие, указали на необходимость дальнейшего понимания процесса, с помощью которого происходит миграция клеток, либо при нормальных физиологических или патологических условиях, и это имеет жизненно важное значение для дальнейшего этой области исследований. Для достижения этой цели необходимо провести миграционные анализы, которые были бы доступны и доступны для тех исследователей, которые могут не обладать оборудованием, необходимым для проведения этих анализов.

В настоящее время имеются различные миграционные анализы для изучения широкого круга вопросов, касающихся миграции клеток. Разработаны как 2D, так и 3D-модели миграции, каждая из которых ориентирована на конкретные области, влияющие на миграцию клеток. 3D-модели миграции, как правило, связаны с исследованиями вторжения клеток и оценивают влияние внеклеточной матрицы^{на миграцию клеток 10,11,12}, в то время как 2D-анализы миграции имеют больший диапазон применения и в первую очередь используются для изучения химиотатической миграции, заживления ран и функциональных изменений во^{время миграции клеток 13,14,15,16.} Некоторые из этих анализов требуют дополнительного оборудования, таких как камеры Бойдена или кольца исключения, которые могут уменьшить доступность этих анализов для некоторых исследователей. Одним из наиболее экономически эффективных анализов является анализ царапин, который обычно используется для оценки заживления ран и общих изменений в^{миграции клеток 14,17}. В то время как большинство лабораторий оснащены для проведения анализа царапин, оборудование, используемое для отслеживания миграции клеток, как правило, либо недоступно, либо слишком дорого для покупки. Это включает в себя промежуток времени микроскопии, которая требует перевернутого микроскопа и живой системы визуализации. Эти дорогие единицы оборудования не являются общедоступными для каждой лаборатории. Таким образом, это наблюдение подчеркивает необходимость нового протокола, который позволяет оценить миграцию клеток с более доступным оборудованием.

Представленный здесь протокол предоставляет новый и доступный способ оценки миграции клеток. Этот метод следует той же процедуре, связанной с анализом царапин, но отличается в анализе изучения миграции клеток, используя оборудование, более широко доступное в лабораторных условиях фундаментальных наук. Этот протокол с использованием общего оборудования позволяет более точно определить миграцию клеток без использования замедленной микроскопии. Помимо определения миграции, этот метод также определяет переменные факторы в области царапин, которые, как было отмечено, оказывают значительное влияние на миграцию клеток. В целом, этот новый протокол для анализа миграции клеток дает возможность для большего числа лабораторий изучить и внести свой вклад в область миграции клеток.

протокол

1. Общая культура клеток

1. Культура сердечных фибробластов в модифицированных орлов Dulbecco средний (DMEM), содержащий 1 г / л глюкозы, пируват натрия, L-глутамин, и дополнен 14,2 мМ НаГКО₃, 14,9 мМ HEPES, 15% тепловой инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 2% L-глютамина, и 0,02% противомикробных реагентов (см. Таблицу материалов)и поддерживается в инкубаторе CO₂ при температуре 37 градусов по Цельсию.
2. Культура сердечных фибробластов до 90-95% слияние достигнуто при прохождении 0 (P0). На данный момент фибробласты готовы быть разделены на пластину из 48 колодец, которая используется для анализа миграции.

2. Подготовка миграционной плиты

1. Подготовь 48-хорошо пластины клеточной культуры, рисуя линию, используя желтый или светлого цвета постоянный маркер, вниз по центру колодец. Затем нарисуйте три хэш-метки, разделяющие колодец на три отдельные области, представляющие интерес. Эти разделы будут использоваться для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование светлого цвета постоянного маркера позволит легко изображения мигрирующих клеток. Темные маркеры, такие как черный или синий, предотвратит визуализацию мигрирующих ячеек.
2. При оценке миграции на субстрате (например, коллагене) покрыть колодец в это время следуя инструкциям и концентрациям, используемым для конкретного субстрата.
3. Плита 15000-20000 сердечных фибробластов, P1, в каждый колодец и культурных клеток, в нормальных условиях культивирования (условия, перечисленные в предыдущем разделе), пока они не достигнут 90-95% слияния. Слияние должно быть достигнуто между 24-48 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке миграционной пластины убедитесь, что включают положительный контроль (известная миграционная ячейка, такие как 3T3^{клетки 18}), отрицательный контроль (нестратные клетки) и пустой колодец.

3. Анализ миграции царапин и фиксация

1. Как только клетки достигают 90-95% слияния, удалите средства массовой информации и поцарапать вдоль нарисованной линии с помощью стерильной P200 пипетки отзыв.
   ПРИМЕЧАНИЕ: P200 пипетки отзыв общий наконечник пипетки размера используется с нуля анализ^10,14,19. Кроме того, только сделать один проход с P200 отзыв, как более чем одна попытка может привести к нескольким линиям нуля.
2. Промыть колодец с низким содержанием средств сыворотки (1,5% FBS), чтобы удалить любые непривязанные сердечные фибробласты.
3. Добавьте 500 МКЛ с низким содержанием сыворотки в каждую колодец. При использовании каких-либо фармакологических агентов, добавить их в это время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Низкие средства массовой информации сыворотки используется, потому что это позволяет / способствует миграции клеток происходит и предотвращает фибробласты от распространения, которые могут исказить результаты миграции^{анализ 20}. Для этого протокола было использовано 1,5% FBS.
4. Захват 0 ч изображения перед инкубацией фибробластов в 5% CO_{2 инкубатор при} 37 градусов по Цельсию в течение 24 ч.
   1. Захват 0 ч изображения с помощью перевернутого микроскопа с 20x цели. Возьмите два 0 ч изображения на колодец. Это позволит обеспечить более полное охват линии миграции.
   2. Используя разметку (линию и тире), распоить колодец, чтобы захватить верхнюю половину линии царапины. Избегайте изображения среднего тире, чтобы убедиться, что одна и та же область миграции не изображена дважды, что может исказить результаты.
   3. Используйте программное обеспечениедля визуализации (Таблицаматериалов), чтобы захватить 0 ч изображения #1. Затем переместив пластину, чтобы распоить нижнюю половину хорошо / линии нуля в виде камеры. Опять же, избежать захвата среднего тире. Оказавшись на месте, захват 0 ч изображения #2 (Рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегая среднего тире в обоих 0 ч изображения будут препятствовать захвату областей миграции в два раза, которые, если сделать может привести к повторению результатов и исказить данные.
5. После инкубации в течение 24 ч, удалить средства массовой информации из хорошо, и мыть хорошо с 1x нестерильной PBS (отныне все 1x PBS используется нестерильный).
6. В паровой капюшон добавьте 500 МКЛ из 4% параформальдегида в колодец и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
7. Удалите параформальдегид и мыть 3x с 1x PBS в течение 5 минут каждый на RT.
8. После того, как клетки промывают, приступить к захвату 24 ч изображения или добавить 1x PBS к каждому хорошо и место при 4 градусов по Цельсию до более позднего времени. Клетки могут оставаться на уровне 4 градусов по Цельсию в течение 1-2 недель, пока не будут готовы к изображению.
   1. Перемеабилизировать клетки, добавив 300 МКЛ пермябилизирующего раствора (1x PBS и 0.01% тритон X-100) к каждой колодец. Инкубировать клетки / пластины с нежным, постоянное качание в течение 30 минут на RT.
   2. Удалить проницаемый раствор и добавить 1% Coomassie Блестящий синий пятно (3% Coomassie Блестящий синий, 10% уксусной кислоты, 45% метанола, и 45% dH₂O) в течение 10 мин с нежным, постоянно качания на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пластины покрыты внеклеточной матрицы субстрата убедитесь, что проверить покрытием пластины с Coomassie окрашивания перед проведением миграции анализа. Рисунок 2 показывает, что матричный субстрат может быть использован с помощью этого анализа и не влияет на визуализацию клеток.
   3. Вымойте скважины 3x с 1x PBS на RT с постоянным качания в течение 5 минут каждый.
   4. После мытья, добавил 300 йл 1x PBS и захватить 24 ч изображений.
   5. Захват 24 ч изображения путем выравнивания хорошо в том же положении, которое было использовано для захвата 0 ч изображений. Для достижения этой цели откройте ранее захваченные изображения 0 ч и используя маркировку, сделанную с помощью постоянного маркера, выровнять колодец в том же положении. Линия посередине и дополнительные знаки тире должны позволить тесное выравнивание между изображением 24 ч и изображением 0 ч(рисунок 1).

4. Подготовка изображений 0 ч и 24 ч

1. Откройте 0 ч и 24 ч изображения, сделанные из той же хорошо и положение в изображении программного обеспечения(Таблица материалов).
2. Создайте новый слой на изображении 0 ч. Затем нажмите на новый слой и измените название слоя на "линейный слой", дважды нажав на текст.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот слой будет называться линейным слоем с этого момента.
3. Нажмите на инструмент кисти (значок кисти) и установите размер на 10 px и цвет до красного цвета.
4. При выборе слоя линии нарисуйте две отдельные линии, которые обрисовают область царапины. Линии не должны касаться каких-либо ячеек из-за этих линий, обозначая область миграции.
5. Нажмите на инструмент Move Tool (значок стрелки), а затем нажмите кнопку Ctrl и нажмите на линейный и фоновый слои.
6. Нажмите в центре изображения 0 ч и перетащите оба этих слоя к середине изображения 24 ч.
7. Теперь, используя изображение 24 ч, нажмите на фоновый слой 0 ч и измените непрозрачность до 50%.
8. Удерживая кнопку Ctrl, нажмите на фоновый и линейный слой 0 ч, а затем освободите преобразованиеслоев (Edit'gt;Free Transform). Используя свободную трансформацию, выровняйте фон и изображение линии 0 ч с фоновым изображением 24 ч. Этот шаг приводит к наложению изображения 0 ч и 24 ч, которое необходимо для позиционирования линий, которые отмечают область миграции в правильном положении на изображении 24 ч.
9. После успешного наложения фоновых и линейных слоев 0 ч на фоновое изображение 24 ч удалите фоновый слой 0 ч. Удалите, нажав на фоновый слой 0 ч, затем нажмите правой кнопкой мыши и нажмите на слой удаления.
10. Удаление фонового изображения 0 ч оставит только линию и фоновый слой 24 ч (теперь именуемый миграционным изображением). Слой линии будет указывать область миграции/царапины на изображении 24 ч и может быть использован для определения количества мигрирующих ячеек.
11. Сохранить в качестве нового изображения миграции, как фотошоп файл и TIFF / JPEG. ПРИМЕЧАНИЕ: репрезентативная фигура, изображающая этот процесс, представлена на рисунке 3.

5. Подсчет количества мигрирующих ячеек

1. Откройте изображение миграции. Это можно сделать в программе, которая принимает файлы TIFF/JPEG(Таблица материалов).
2. Подсчитайте количество ячеек, расположенных между ними, а также касаясь двух красных линий.
3. Запись количества мигрирующих ячеек на изображение. На колодец будет по два мигрирующих изображения, и эти значения не следует комбинировать до тех пор, пока значения не будут исправлены для области миграции (подробно описано в следующем разделе).

6. Определить область миграции

1. Откройте изображение 24 ч, которое содержит линии миграции в программе визуализации в разделе 5(Таблица материалов).
2. Сохранить, как это изображение, как "Миграция района изображения".
3. После сохранения нажмите на фоновый слой, нажмите правой кнопкой мыши и нажмите на слой удаления. Это должно оставить только царапины на изображении(рисунок 3).
4. Использование инструмента кисти (иконка кисти) заполняет область между линиями царапин. Соейте цвет кисти с цветом, используемым для нарисовки линий для миграции.
5. Измените изображение на серую шкалу, чтобы создатьчерно-белое изображение (Изображение,gt;Mode'gt;Grayscale), а затем сохранить изображение(рисунок 4).
6. Запустите программное обеспечение анализа(Таблица материалов),а затем откройте файл "Область миграции" в рамках программного обеспечения анализа.
7. Чтобы определить область линии миграции, щелкните Изображение Черная область миграции покраснеет, а процентная область будет указана в пороговом поле. Область будет сообщена в процентах от площади линии миграции охватывает по сравнению со всей области, захваченной на изображении.
8. Завехать процентную область для линии миграции и убедитесь, что это значение в паре с числом мигрирующих ячеек для одного и того же изображения.

7. Анализ данных

1. Нормализует количество мигрирующих ячеек в процентную область царапины. Разделите число мигрирующих ячеек на процентную область линии миграции (« мигрировавшие ячейки % Область миграции)... Делайте это на изображение, а не в среднем на основе миграции на колодец.
2. После нормализации значений на изображение добавьте значения двух изображений, которые представляют собой индивидуальный колодец. Это значение будет использоваться для графического и статистического анализа. Если экспериментальный дизайн содержал несколько репликаций. Средние значения репликации до статистического анализа.

Результаты

Эта процедура документирует новый подход к изучению миграции клеток, который является экономически эффективным и легко адаптируемым для большинства лабораторий. Во многих исследованиях используется промежуток времени микроскопия для оценки миграции клеток, однако оборудование, нео...

Обсуждение

Этот новый подход к анализу миграции царапин обеспечивает более доступный метод для исследователей для изучения изменений в миграции клеток. Хотя этот анализ следует той же процедуре для администрирования царапины похож на другие анализы нуля, он предоставляет новый метод для визуал?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase