使用打开的血管窗口和活体荧光显微镜测量小鼠耳蜗中的心室血流

摘要

使用荧光示踪剂的开放式血管窗口方法为耳蜗血流（CoBF）测量提供了足够的分辨率。该方法有助于研究正常和病理条件下小鼠CoBF的结构和功能变化。

摘要

声音的转导对代谢要求很高，侧壁微脉管系统的正常功能对于维持耳蜗电位、离子转运和体液平衡至关重要。据报道，不同形式的听力障碍涉及耳蜗中的异常微循环。由于缺乏可行的询问方法和难以进入内耳，研究人工耳血流（CoBF）病理如何影响听力功能具有挑战性。侧耳蜗壁上的打开血管窗口与荧光活体显微镜相结合，已被用于研究体内CoBF变化， 但主要用于豚鼠，最近才在小鼠中。本文和相关视频描述了用于可视化小鼠耳蜗血流的开放血管窗口方法。细节包括1）从小鼠制备荧光标记的血细胞悬液;2）在麻醉小鼠中构建用于活体显微镜检查的开放血管窗口，以及3）使用成像的离线记录测量血流速度和体积。该方法以视频格式呈现，以展示如何使用鼠标中的开窗方法研究正常和病理条件下耳蜗微循环的结构和功能变化。

引言

耳蜗外侧壁微循环（包括螺旋韧带和血管纹中的大部分毛细血管）的正常功能对于维持^{听力功能至关重要}1。CoBF异常与许多内耳疾病的病理生理学有关，包括噪音引起的听力损失，耳水肿和老年性聋²，³，⁴，⁵，⁶，^7，8^，9。活体CoBF的可视化将有助于更好地了解听力功能与耳蜗血管病理之间的联系。

尽管耳蜗在颞骨内的复杂性和位置无法直接可视化和测量CoBF，但已经开发了各种方法来评估CoBF，包括激光多普勒血流法（LDF）10，11，^12，磁共振成像（MRI）13，荧光活体显微镜（FIVM）14，荧光显微内窥镜（FME）15^，内窥镜激光斑点对比成像（LSCI）¹⁶。，以及基于将标记标记物和放射性标记微球注射到血液中的方法（光学微血管造影，OMAG）¹⁷，¹⁸，^19，20。然而，除了FIVM之外，这些方法都没有能够绝对实时跟踪体内CoBF的变化。FIVM与侧耳蜗壁中的容器窗口相结合，是一种已被各种实验室在不同实验条件下在豚鼠中使用和验证的方法¹⁴，^21，22。

以异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖为造影剂，以DiO（3，3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐，绿色）或Dil（1，1-二十八烷基-3，3，3，3-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐，红色）为预标记血细胞、可视化血管和跟踪血流速度，成功建立了研究小鼠耳蜗微循环结构和功能变化的FIVM方法。在本研究中，已经描述了该方法的方案，用于在正常和病理条件下（例如噪声暴露后）对小鼠CoBF的变化进行成像和量化。该技术为研究人员提供了研究与血管纹中听力功能障碍和病理学相关的CoBF潜在机制所需的工具，特别是当与现成的转基因小鼠模型结合使用时。

研究方案

注意:这是一项非生存性手术。所有涉及使用动物的程序均由俄勒冈健康与科学大学的机构动物护理和使用委员会审查和批准（IACUC批准号:TR01_IP00000968）。

1.荧光标记血细胞的制备

1. 用腹膜内（ip）注射氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉液（5mL / kg，参见 材料表）麻醉供体小鼠（年龄~6周的雄性C57BL / 6J小鼠）。
   注意:此麻醉方案非常可靠，可维持全身血压。
2. 将鼠标放在背上，打开皮肤并使用镊子和解剖剪刀露出胸腔。切开横膈膜，用夹式剪刀抓住胸骨底部，切开胸腔并提起以露出心脏。通过心脏穿刺收集1mL肝素（15IU / mL血液）中的血液，并在4°C下以3，000× g 离心3分钟。 采血后通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
3. 取出血浆，用1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤血细胞沉淀，并在4°C下以3000× g 离心3x3分钟。
4. 在PBS中用1mL的20mM DiO或Dil标记血细胞，并在室温^23，24下在黑暗中孵育30分钟。
5. 用1mL PBS离心并洗涤标记的血细胞，在4°C下以3000× g 离心3x3分钟，并在注射前用~0.9mL PBS（最终体积~1.3mL）将细胞沉淀重悬于30%血细胞比容中。

2. 手术创造打开的窗户 ²⁵

1. 准备无菌手术器械和成像平台，并在窗帘下方放置加热垫（图1A）。如步骤1.1所述麻醉小鼠（年龄~6周的雄性C57BL / 6J小鼠），并通过监测爪反射和一般肌肉张力来检查麻醉深度。将动物放在温暖的加热垫上，并将直肠温度保持在37°C。
2. 将动物尾巴放入CODATM监测系统中，以监测血压和心跳（见 材料表）。记录动物在麻醉状态下的收缩压、舒张压和平均血压 （MBP）。
   注意:在麻醉和非麻醉状态下，动物MBP没有差异（107 ± 11 mmHg与97 ± 7 mmHg）。动物心率在麻醉下稳定，但低于（仍在正常范围内）低于非麻醉条件下（357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp）。在被束缚的动物中，预计心跳应略有增加²⁶.
3. 在体视显微镜下通过侧向和腹侧入路打开左鼓膜大疱（见 材料表），保持鼓膜和听小骨完整²¹.
   1. 沿着动物颈部的中线做一个切口，头部固定并定位以尽量减少运动（图1B）。切除左下颌下腺和二腹肌后腹部并烧灼。
      注意:皮下注射丁丙诺啡0.05mg / kg，以减轻手术过程中的疼痛。
   2. 通过识别胸锁乳突肌和向前延伸至大疱的面神经来定位并暴露骨大疱。
   3. 用30G针打开骨大疱，并用手术镊子小心地去除周围的骨头，以提供耳蜗和镫骨动脉的清晰视野，其内侧边缘位于圆窗壁龛的边缘，并向椭圆形窗口前上流（图1C，D）。
      注意:进行气管切开术是为了保持气道畅通无阻，并且只有在动物在手术过程中出现呼吸问题时才应进行。一般来说，大多数麻醉下的动物呼吸顺畅。但是，如果动物在手术过程中接受了气管切开术，则记录的血流量不应用于任何比较。
4. 使用小刀片（定制铣削的#16手术刀）刮擦小鼠耳蜗顶端-中转处的侧壁骨，距顶端约1.25毫米，直到薄点破裂。用小线钩取出骨屑（图1E）。
5. 用切好的盖玻片盖住容器窗口，以保持正常的生理条件，并为记录容器图像提供光学视图。
   注意:所有程序均应谨慎执行。除了监测体温外，还应在整个手术过程中监测动物的生命体征，包括血压和心跳。

3. FIVM 下 CoBF 的成像

1. 沿右隐静脉做一个~1厘米的切口以暴露血管（图1F）。
2. 通过大隐静脉将 100 μL FITC-葡聚糖溶液（2000 kDa，40 mg/mL PBS 溶液）和 100 μL 血细胞悬液（30% 血细胞比容）相继注入动物体内（图 1G），以实现血管可视化和血流速度跟踪。
3. 注射后5分钟直接在视频监视器上实时观察血流。使用配备长工作距离（W.D.）物镜（W.D.30.5 mm，10x，0.26数值孔径）和包含多波段激发滤光片和兼容发射滤光片的灯罩（材料表）的荧光显微镜对血管进行成像。使用高分辨率数字黑白电荷耦合器件相机（材料表）以 2 帧/秒的速度录制视频）。每个视频采集 350 多张图像，以确保成功分析流速。
   注意:螺旋韧带和血管纹的血管都可以通过调整光学焦点来成像（补充视频1）。

4. 视频分析

1. 使用适当的软件（材料表）测量容器直径，并确定采集图像中容器上两个固定点之间的距离。
2. 通过跟踪标记血细胞在图像位置²⁷之间的空间距离中的运动，从捕获的视频帧计算血流速度。
   1. 在软件中打开血流视频（本协议中使用了斐济[ImageJ]），并设置图像的比例。
   2. 使用跟踪功能跟踪选定的DiO染色血细胞。使用单元格移动的距离和视频中图像帧之间的时间间隔来自动计算流速。
3. 根据以下公式计算体积流量 （F）:F = V × A.（V:速度;A:容器的横截面积）。

5. 噪声暴露

1. 将动物放在金属丝网笼中。将它们暴露在声音暴露室中120 dB声压级的宽带噪声中3小时，第二天再暴露3小时。
   注意:本实验室常规使用的这种噪声暴露制度会导致人工耳蜗敏感性的永久性丧失²⁸。

结果

在侧壁的耳蜗毛细血管手术暴露后（图1），通过打开的血管窗口对FITC右旋糖酐标记的血管中的Dil标记血细胞进行活体高分辨率荧光显微镜观察是可行的。图2A是在FIVM下拍摄的代表性图像，显示了小鼠耳蜗顶端-中转侧壁的毛细血管。这些血管的管腔通过与血浆混合的FITC-葡聚糖的荧光可见。分布在血管网络中的单独标记的血细?...

讨论

本文展示了如何在FIVM系统下的开放式血管窗口制备中通过荧光团标记可视化小鼠模型耳蜗侧壁（和血管纹）中的毛细血管。小鼠模型被广泛使用并优选作为哺乳动物模型来研究人类健康和疾病。这里描述的协议是一种可行的方法，用于在FIVM系统下使用开放的血管窗口对小鼠侧壁（特别是在血管纹中）中的CoBF进行成像和研究该方法提供了足够的分辨率，用于使用荧光标记的血细胞作为示踪剂来确?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope