Medición del flujo sanguíneo auricular en cóclea de ratón utilizando una ventana de vaso abierto y microscopía de fluorescencia intravital

Resumen

Un enfoque de ventana de vaso abierto utilizando trazadores fluorescentes proporciona una resolución suficiente para la medición del flujo sanguíneo coclear (CoBF). El método facilita el estudio de los cambios estructurales y funcionales en CoBF en ratón en condiciones normales y patológicas.

Resumen

La transducción del sonido es metabólicamente exigente, y la función normal de la microvasculatura en la pared lateral es crítica para mantener el potencial endococlear, el transporte de iones y el equilibrio de líquidos. Se informa que diferentes formas de trastornos auditivos implican microcirculación anormal en la cóclea. La investigación de cómo la patología del flujo sanguíneo coclear (CoBF) afecta la función auditiva es un desafío debido a la falta de métodos de interrogatorio factibles y la dificultad para acceder al oído interno. Una ventana de vaso abierta en la pared coclear lateral, combinada con microscopía intravital de fluorescencia, se ha utilizado para estudiar los cambios de CoBF in vivo, pero principalmente en conejillos de indias y solo recientemente en el ratón. Este documento y el video asociado describen el método de ventana de vaso abierto para visualizar el flujo sanguíneo en la cóclea del ratón. Los detalles incluyen 1) preparación de la suspensión de células sanguíneas marcadas con fluorescencia de ratones; 2) construcción de una ventana de vaso abierta para microscopía intravital en un ratón anestesiado, y 3) medición de la velocidad y el volumen del flujo sanguíneo utilizando una grabación fuera de línea de las imágenes. El método se presenta en formato de video para mostrar cómo usar el enfoque de ventana abierta en el ratón para investigar cambios estructurales y funcionales en la microcirculación coclear en condiciones normales y patológicas.

Introducción

La función normal de la microcirculación en la pared coclear lateral (que comprende la mayoría de los capilares en el ligamento espiral y la estría vascular) es de importancia crítica para mantener la función auditiva¹. La CoBF anormal está implicada en la fisiopatología de muchos trastornos del oído interno, incluida la pérdida de audición inducida por ruido, la hidropesía del oído y la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualización del CoBF intravital permitirá una mejor comprensión de los vínculos entre la función auditiva y la patología vascular coclear.

Aunque la complejidad y localización de la cóclea dentro del hueso temporal impide la visualización directa y la medición del CoBF, se han desarrollado diversos métodos para la evaluación del CoBF, incluyendo la flujometría láser-doppler (LDF)10,11,12, la resonancia magnética (RM)13, la microscopía intravital de fluorescencia (FIVM)14, la microendoscopia fluorescente (FME)^15, la imagen endoscópica de contraste con moteado láser (LSCI)¹⁶ , y enfoques basados en la inyección de marcadores marcados y microesferas marcadas radiactivamente en el torrente sanguíneo (microangiografía óptica, OMAG)^17,18,19,20. Sin embargo, ninguno de estos métodos ha permitido el seguimiento absoluto en tiempo real de los cambios en CoBF in vivo, con la excepción de FIVM. La FIVM, en combinación con una ventana de vaso en la pared coclear lateral, es un abordaje que ha sido utilizado y validado en cuyes bajo diferentes condiciones experimentales por diversos laboratorios 14,21,22^.

Se estableció con éxito un método FIVM para estudiar los cambios estructurales y funcionales en la microcirculación coclear en ratón utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como medio de contraste y un colorante de fluorescencia, ya sea DiO (perclorato de 3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina, verde) o Dil (perclorato de 1,1-dioctadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina, rojo), para premarcar las células sanguíneas, visualizar los vasos y rastrear la velocidad del flujo sanguíneo. En el presente estudio, se ha descrito el protocolo de este método para obtener imágenes y cuantificar los cambios en CoBF en ratones en condiciones normales y patológicas (como después de la exposición al ruido). Esta técnica proporciona al investigador las herramientas necesarias para investigar los mecanismos subyacentes de CoBF relacionados con la disfunción auditiva y la patología en la estría vascular, especialmente cuando se aplica junto con modelos de ratones transgénicos fácilmente disponibles.

Protocolo

NOTA: Esta es una cirugía de no supervivencia. Todos los procedimientos que involucran el uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón (número de aprobación de IACUC: TR01_IP00000968).

1. Preparación de las células sanguíneas marcadas con fluorescencia

1. Anestesiar a los ratones donantes (ratones machos C57BL/6J de edad ~6 semanas) con una inyección intraperitoneal (i.p.) de solución anestésica de ketamina/xilazina (5 mL/kg, ver la Tabla de materiales).
   NOTA: Este protocolo de anestesia es muy confiable y mantiene la presión arterial sistémica.
2. Coloque el ratón sobre su espalda, abra la piel y exponga la cavidad torácica con pinzas y tijeras de disección. Corte el diafragma, agarre la base del esternón con tijeras de abrazadera, corte a través de la caja torácica y levante para exponer el corazón. Recoger 1 ml de sangre en heparina (15 UI/ml de sangre) mediante punción cardíaca y centrifugar a 3.000 × g durante 3 min a 4 °C. Eutanasia del ratón por dislocación cervical después de la recolección de sangre.
3. Extraer el plasma, lavar el pellet de células sanguíneas con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y centrifugar 3x a 3000 × g durante 3 min a 4 °C.
4. Etiquetar las células sanguíneas con 1 ml de 20 mM de DiO o Dil en PBS, e incubar en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente^23,24.
5. Centrifugar y lavar las células sanguíneas marcadas con 1 ml de PBS, centrifugar 3x a 3000 × g durante 3 min a 4 °C, y resuspender el pellet celular en hematocrito al 30% con ~0,9 ml de PBS (volumen final ~1,3 ml) antes de la inyección.

2. Cirugía para crear una ventana abierta ²⁵

1. Prepare los instrumentos quirúrgicos estériles y la plataforma de imágenes, y coloque una almohadilla térmica debajo de la cortina (Figura 1A). Anestesiar a los ratones (ratones machos C57BL / 6J de edad ~ 6 semanas) como se describe en el paso 1.1, y verificar la profundidad de la anestesia monitoreando el reflejo de la pata y el tono muscular general. Coloque al animal en la almohadilla térmica caliente y mantenga la temperatura rectal a 37 ° C.
2. Coloque la cola del animal en el sistema de monitoreo CODATM para monitorear la presión arterial y los latidos cardíacos (consulte la Tabla de materiales). Registre la presión arterial sistólica del animal, la presión arterial diastólica y la presión arterial media (MBP) en la condición anestesiada.
   NOTA: No se observan diferencias en la MBP animal en el estado anestesiado y no anestesiado (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). La frecuencia cardíaca animal es estable bajo anestesia, aunque menor (todavía dentro del rango normal) que en la condición no anestesiada (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). Se debe esperar un ligero aumento del latido cardíaco en animales colocados en restricción²⁶.
3. Abrir la bulla timpánica izquierda mediante un abordaje lateral y ventral bajo un microscopio estereoscópico (ver Tabla de Materiales), dejando intactas la membrana timpánica y los osículos²¹.
   1. Haga una incisión a lo largo de la línea media del cuello del animal con la cabeza inmovilizada y colocada para minimizar el movimiento (Figura 1B). Extirpar la glándula submandibular izquierda y el vientre posterior del músculo digástrico y cauterizar.
      NOTA: Inyecte buprenorfina por vía subcutánea a 0,05 mg/kg para reducir el dolor durante la cirugía.
   2. Localice y exponga la bulla ósea identificando el músculo esternocleidomastoideo y el nervio facial que se extiende anteriormente hacia la bulla.
   3. Abra la bulla ósea con una aguja de 30 G y retire cuidadosamente el hueso circundante con pinzas quirúrgicas para proporcionar una visión clara de la cóclea y la arteria estapedial, con su margen medial sobre el borde del nicho de la ventana redonda y cursando anterior-superior hacia la ventana oval (Figura 1C, D).
      NOTA: La traqueotomía se realiza para mantener las vías respiratorias sin obstrucciones y solo debe realizarse cuando el animal tiene un problema respiratorio durante la cirugía. En general, la mayoría de los animales bajo anestesia tienen una respiración suave. Sin embargo, si los animales recibieron una traqueotomía durante la cirugía, el flujo sanguíneo registrado no debe usarse para ninguna comparación.
4. Use una hoja de cuchillo pequeña (bisturí # 16 molido a medida) para raspar el hueso de la pared lateral en el ápice de la cóclea media del ápice, aproximadamente a 1,25 mm del ápice hasta que se agriete un punto delgado. Retire las astillas de hueso con pequeños ganchos de alambre (Figura 1E).
5. Cubra la ventana del recipiente con un cubreobjetos cortado para preservar las condiciones fisiológicas normales y proporcione una vista óptica para grabar imágenes del recipiente.
   NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse con precaución. Además de controlar la temperatura corporal, los signos vitales del animal, incluida la presión arterial y los latidos del corazón, también deben controlarse durante toda la cirugía.

3. Imágenes de CoBF bajo FIVM

1. Haga una incisión de ~1 cm a lo largo de la vena safena derecha para exponer el vaso (Figura 1F).
2. Infundir 100 μL de la solución de FITC-dextrano (2000 kDa, 40 mg/ml en PBS) y 100 μL de una suspensión de células sanguíneas (hematocrito al 30%) sucesivamente en el animal a través de la vena safena (Figura 1G) para permitir la visualización de los vasos sanguíneos y el seguimiento de la velocidad del flujo sanguíneo.
3. Observe el flujo sanguíneo en tiempo real directamente en un monitor de video 5 minutos después de la inyección. Imagen de los vasos sanguíneos utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de larga distancia de trabajo (W.D.) (W.D. 30.5 mm, 10x, 0.26 apertura numérica) y una carcasa de lámpara que contiene un filtro de excitación de banda múltiple y un filtro de emisión compatible (Tabla de materiales). Grabe el vídeo con una cámara digital de alta resolución en blanco y negro con dispositivo de carga acoplada (Tabla de materiales) a 2 fotogramas/s). Adquiera más de 350 imágenes por video para garantizar un análisis exitoso de la velocidad del flujo.
   NOTA: Se pueden obtener imágenes de los vasos sanguíneos tanto del ligamento espiral como de la estría vascular ajustando el enfoque óptico (Video suplementario 1).

4. Análisis de vídeo

1. Mida el diámetro del recipiente utilizando el software apropiado (Tabla de materiales) y determine la distancia entre dos puntos fijos a través del recipiente en las imágenes adquiridas.
2. Calcule la velocidad del flujo sanguíneo a partir de fotogramas de vídeo capturados rastreando el movimiento de las células sanguíneas marcadas en la distancia espacial entre las ubicaciones de las imágenes²⁷.
   1. Abra el video del flujo sanguíneo en el software (Fiji [ImageJ] se usó en este protocolo) y establezca la escala de las imágenes.
   2. Rastree las células sanguíneas teñidas con DiO seleccionadas utilizando la función de seguimiento. Utilice la distancia a la que se han movido las celdas y el intervalo de tiempo entre fotogramas de imagen en el vídeo para el cálculo automático de la velocidad de flujo.
3. Calcule el flujo volumétrico (F) según la siguiente ecuación: F = V × A. (V: velocidad; A: área de sección transversal del buque).

5. Exposición al ruido

1. Coloque a los animales en jaulas de malla de alambre. Exponerlos a ruido de banda ancha a un nivel de presión acústica de 120 dB en una cabina de exposición al sonido durante 3 h y durante 3 h adicionales al día siguiente.
   NOTA: Este régimen de exposición al ruido, utilizado habitualmente en este laboratorio, produce pérdida permanente de sensibilidad coclear²⁸.

Resultados

Después de la exposición quirúrgica de los capilares cocleares en la pared lateral (Figura 1), la observación microscópica de fluorescencia intravital de alta resolución de células sanguíneas marcadas con Dil en vasos marcados con FITC-dextrano fue factible a través de una ventana de vaso abierta. La Figura 2A es una imagen representativa tomada bajo FIVM que muestra los capilares de la pared lateral del ápice coclear d...

Discusión

Este documento demuestra cómo los capilares en la pared lateral coclear (y en la estría vascular) de un modelo de ratón se pueden visualizar con etiquetado fluoróforo en una preparación de ventana de vaso abierto bajo un sistema FIVM. El modelo de ratón es ampliamente utilizado y preferido como modelo de mamífero para investigar la salud humana y la enfermedad. El protocolo descrito aquí es un enfoque factible para obtener imágenes e investigar CoBF en la pared lateral del ratón (particularmente en la estría v...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope