Messung des restrischen Blutflusses in Maus-Cochlea mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Ein offener Gefäßfensteransatz mit fluoreszierenden Tracern bietet eine ausreichende Auflösung für die Messung des Cochlea-Blutflusses (CoBF). Die Methode erleichtert die Untersuchung struktureller und funktioneller Veränderungen von CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen.

Zusammenfassung

Die Schalltransduktion ist metabolisch anspruchsvoll, und die normale Funktion der Mikrovaskulatur in der Seitenwand ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des endocochleären Potenzials, des Ionentransports und des Flüssigkeitshaushalts. Es wird berichtet, dass verschiedene Formen von Hörstörungen eine abnormale Mikrozirkulation in der Cochlea beinhalten. Die Untersuchung, wie sich die Pathologie des Cochlea-Blutflusses (CoBF) auf die Hörfunktion auswirkt, ist aufgrund des Mangels an praktikablen Abfragemethoden und des schwierigen Zugangs zum Innenohr eine Herausforderung. Ein offenes Gefäßfenster in der lateralen Cochlea-Wand, kombiniert mit intravitaler Fluoreszenzmikroskopie, wurde zur Untersuchung von CoBF-Veränderungen in vivo verwendet, hauptsächlich jedoch bei Meerschweinchen und erst kürzlich in der Maus. Dieser Artikel und das zugehörige Video beschreiben die offene Gefäßfenstermethode zur Visualisierung des Blutflusses in der Maus-Cochlea. Zu den Details gehören 1) Herstellung der fluoreszenzmarkierten Blutzellsuspension von Mäusen; 2) Konstruktion eines offenen Gefäßfensters für die intravitale Mikroskopie in einer anästhesierten Maus und 3) Messung der Blutflussgeschwindigkeit und des Blutvolumens mittels einer Offline-Aufzeichnung der Bildgebung. Die Methode wird im Videoformat präsentiert, um zu zeigen, wie der Open-Window-Ansatz in der Maus verwendet werden kann, um strukturelle und funktionelle Veränderungen in der Cochlea-Mikrozirkulation unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.

Einleitung

Die normale Funktion der Mikrozirkulation in der lateralen Cochlea-Wand (die den Großteil der Kapillaren im Spiralband und in der Stria vascularis umfasst) ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Hörfunktion¹. Abnorme CoBF ist an der Pathophysiologie vieler Innenohrerkrankungen beteiligt, einschließlich lärmbedingtem Hörverlust, Ohrhydrops und Presbyakusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Die Visualisierung der intravitalen CoBF ermöglicht ein besseres Verständnis der Zusammenhänge zwischen Hörfunktion und cochlea-vaskulärer Pathologie.

Obwohl die Komplexität und Lage der Cochlea im Schläfenbein eine direkte Visualisierung und Messung von CoBF ausschließt, wurden verschiedene Methoden zur Beurteilung von CoBF entwickelt, darunter Laser-Doppler-Durchflussmessung (LDF)10,11,12, Magnetresonanztomographie (MRT)¹³, intravitale Fluoreszenzmikroskopie (FIVM)14, Fluoreszenzmikroskopie (FME)^15, endoskopische Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI)¹⁶ und Ansätze, die auf der Injektion markierter Marker und radioaktiv markierter Mikrosphären in den Blutkreislauf basieren (optische Mikroangiographie, OMAG)^17,18,19,20. Keine dieser Methoden hat jedoch eine absolute Echtzeitverfolgung von Änderungen in CoBF in vivo ermöglicht, mit Ausnahme von FIVM. FIVM, in Kombination mit einem Gefäßfenster in der lateralen Cochlea-Wand, ist ein Ansatz, der bei Meerschweinchen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen von verschiedenen Laboratorien verwendet und validiert wurde 14,21,22.

Eine FIVM-Methode wurde erfolgreich etabliert, um die strukturellen und funktionellen Veränderungen in der Cochlea-Mikrozirkulation in der Maus unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran als Kontrastmittel und einem Fluoreszenzfarbstoff zu untersuchen - entweder DiO (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat, grün) oder Dil (1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyaninperchlorat, rot) - zur Vormarkierung von Blutzellen, zur Visualisierung von Gefäßen und zur Verfolgung der Blutflussgeschwindigkeit. In der vorliegenden Studie wurde das Protokoll dieser Methode zur Bildgebung und Quantifizierung von Veränderungen der CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen (z. B. nach Lärmexposition) beschrieben. Diese Technik gibt dem Forscher die notwendigen Werkzeuge an die Hand, um die zugrunde liegenden Mechanismen von CoBF im Zusammenhang mit Hörstörungen und Pathologie in der Stria vascularis zu untersuchen, insbesondere wenn sie in Verbindung mit leicht verfügbaren transgenen Mausmodellen angewendet werden.

Protokoll

HINWEIS: Dies ist eine Operation ohne Überleben. Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oregon Health & Science University überprüft und genehmigt (IACUC-Zulassungsnummer: TR01_IP00000968).

1. Vorbereitung der fluoreszenzmarkierten Blutzellen

1. Betäuben Sie die Spendermäuse (männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von ~6 Wochen) mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von Ketamin / Xylazin-Anästhesielösung (5 ml / kg, siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Dieses Anästhesieprotokoll ist sehr zuverlässig und hält den systemischen Blutdruck aufrecht.
2. Legen Sie die Maus auf den Rücken, öffnen Sie die Haut und legen Sie die Brusthöhle mit einer Pinzette und einer Sezierschere frei. Schneiden Sie das Zwerchfell auf, greifen Sie mit einer Klemmschere an der Basis des Brustbeins, schneiden Sie durch den Brustkorb und heben Sie es an, um das Herz freizulegen. Sammeln Sie 1 ml Blut in Heparin (15 IE / ml Blut) durch Herzpunktion und zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 3 min bei 4 ° C. Euthanasieren Sie die Maus durch zervikale Dislokation nach der Blutentnahme.
3. Entfernen Sie das Plasma, waschen Sie das Blutzellenpellet mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und zentrifugieren Sie 3x bei 3000 × g für 3 min bei 4 °C.
4. Beschriften Sie die Blutzellen mit 1 ml 20 mM DiO oder Dil in PBS und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur^23,24.
5. Zentrifugieren und waschen Sie die markierten Blutzellen mit 1 ml PBS, zentrifugieren Sie 3x bei 3000 × g für 3 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 30% Hämatokrit mit ~0,9 ml PBS (Endvolumen ~ 1,3 ml) vor der Injektion.

2. Operation zur Schaffung eines offenen ^{Fensters 25}

1. Bereiten Sie die sterilen chirurgischen Instrumente und die Bildgebungsplattform vor, und legen Sie ein Heizkissen unter den Vorhang (Abbildung 1A). Betäuben Sie die Mäuse (männliche C57BL / 6J-Mäuse im Alter von ~ 6 Wochen) wie in Schritt 1.1 beschrieben und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pfotenreflex und den allgemeinen Muskeltonus überwachen. Legen Sie das Tier auf das warme Heizkissen und halten Sie die Rektaltemperatur bei 37 °C.
2. Legen Sie den Tierschwanz in das CODATM-Überwachungssystem zur Überwachung von Blutdruck und Herzschlag (siehe Materialtabelle). Zeichnen Sie den systolischen Blutdruck, den diastolischen Blutdruck und den mittleren Blutdruck (MBP) des Tieres im anästhesierten Zustand auf.
   HINWEIS: Es ist kein Unterschied bei der tierischen MBP im anästhesierten und nicht anästhesierten Zustand zu sehen (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). Die Herzfrequenz des Tieres ist unter Narkose stabil, wenn auch niedriger (immer noch im normalen Bereich) als im nicht betäubten Zustand (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). Ein leicht erhöhter Herzschlag sollte bei Tieren in Fesselhaltung²⁶ erwartet werden.
3. Öffnen Sie die linke Paukenbulle über einen lateralen und ventralen Zugang unter einem Stereomikroskop (siehe Materialtabelle), wobei das Trommelfell und die Gehörknöchelchen intakt bleiben²¹.
   1. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres, wobei der Kopf immobilisiert und positioniert ist, um die Bewegung zu minimieren (Abbildung 1B). Entfernen Sie die linke Unterkieferdrüse und den hinteren Bauch des Digastriummuskels und kauterisieren.
      HINWEIS: Unterkutan injizieren Sie Buprenorphin in 0,05 mg/kg, um die Schmerzen während der Operation zu reduzieren.
   2. Lokalisieren und exponieren Sie die knöcherne Bulle, indem Sie den sternocleidomastoideus Muskel und den Gesichtsnerv identifizieren, die sich vor der Bulle erstrecken.
   3. Öffnen Sie die knöcherne Bulle mit einer 30-G-Nadel und entfernen Sie den umgebenden Knochen vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette, um eine klare Sicht auf die Cochlea und die Arteria stapedialis zu ermöglichen, deren medialer Rand über dem Rand der runden Fensternische liegt und anterior superior zum ovalen Fenster führt (Abbildung 1C, D).
      HINWEIS: Die Tracheotomie wird durchgeführt, um die Atemwege ungehindert zu halten, und sollte nur durchgeführt werden, wenn das Tier während der Operation ein Atemproblem hat. Im Allgemeinen haben die meisten Tiere unter Narkose eine glatte Atmung. Wenn Tiere jedoch während der Operation eine Tracheotomie erhielten, sollte der aufgezeichnete Blutfluss nicht für einen Vergleich verwendet werden.
4. Verwenden Sie eine kleine Messerklinge (speziell gefrästes #16-Skalpell), um den seitlichen Wandknochen an der Apex-Mitteldrehung der Maus-Cochlea, etwa 1,25 mm von der Spitze entfernt, abzukratzen, bis eine dünne Stelle gerissen ist. Entfernen Sie die Knochenspäne mit kleinen Drahthaken (Abbildung 1E).
5. Decken Sie das Gefäßfenster mit einem geschnittenen Deckglas ab, um normale physiologische Bedingungen zu erhalten, und bieten Sie eine optische Ansicht für die Aufnahme von Gefäßbildern.
   HINWEIS: Alle Verfahren sind mit Vorsicht durchzuführen. Neben der Überwachung der Körpertemperatur sollten auch die Vitalfunktionen des Tieres, einschließlich Blutdruck und Herzschlag, während der gesamten Operation überwacht werden.

3. Bildgebung von CoBF unter FIVM

1. Machen Sie einen ~1 cm langen Schnitt entlang der rechten Vena saphena, um das Gefäß freizulegen (Abbildung 1F).
2. 100 μL der FITC-Dextran-Lösung (2000 kDa, 40 mg/ml in PBS) und 100 μL einer Blutzellsuspension (30% Hämatokrit) nacheinander durch die Stammvene in das Tier infundiert werden (Abbildung 1G), um die Visualisierung der Blutgefäße und die Verfolgung der Blutflussgeschwindigkeit zu ermöglichen.
3. Beobachten Sie den Blutfluss in Echtzeit direkt auf einem Videomonitor 5 Minuten nach der Injektion. Abbildung der Blutgefäße mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand (B.D. 30,5 mm, 10x, 0,26 numerische Apertur) und einem Lampengehäuse mit einem Mehrband-Anregungsfilter und einem kompatiblen Emissionsfilter (Table of Materials) ausgestattet ist. Nehmen Sie das Video mit einer hochauflösenden digitalen Schwarzweißkamera (Table of Materials) mit 2 Bildern / s auf. Erfassen Sie mehr als 350 Bilder pro Video, um eine erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten.
   HINWEIS: Blutgefäße sowohl des Spiralbandes als auch der Stria vascularis können durch Einstellen des optischen Fokus abgebildet werden (Supplemental Video 1).

4. Videoanalyse

1. Messen Sie den Gefäßdurchmesser mit einer geeigneten Software (Table of Materials) und bestimmen Sie den Abstand zwischen zwei festen Punkten über das Gefäß in den aufgenommenen Bildern.
2. Berechnen Sie die Blutflussgeschwindigkeit aus aufgenommenen Videobildern, indem Sie die Bewegung markierter Blutzellen in der räumlichen Entfernung zwischen Bildpositionen^{verfolgen 27}.
   1. Öffnen Sie das Video des Blutflusses in der Software (Fidschi [ImageJ] wurde in diesem Protokoll verwendet) und stellen Sie die Skala der Bilder ein.
   2. Verfolgen Sie die ausgewählten DiO-gefärbten Blutzellen mit der Tracking-Funktion. Verwenden Sie die Entfernung, die sich die Zellen bewegt haben, und das Zeitintervall zwischen den Bildbildern im Video zur automatischen Berechnung der Strömungsgeschwindigkeit.
3. Berechnen Sie den Volumenstrom (F) nach folgender Gleichung: F = V × A. (V: Geschwindigkeit; A: Querschnittsfläche des Schiffes).

5. Lärmbelastung

1. Setzen Sie die Tiere in Maschendrahtkäfige. Setzen Sie sie Breitbandrauschen bei 120 dB Schalldruckpegel in einer Schallexpositionskabine für 3 h und für weitere 3 h am nächsten Tag aus.
   HINWEIS: Dieses Lärmexpositionsregime, das routinemäßig in diesem Labor angewendet wird, führt zu einem dauerhaften Verlust der Cochlea-Empfindlichkeit²⁸.

Ergebnisse

Nach chirurgischer Exposition der Cochlea-Kapillaren in der Seitenwand (Abbildung 1) war eine intravitale hochauflösende fluoreszenzmikroskopische Beobachtung von Dil-markierten Blutzellen in FITC-Dextran-markierten Gefäßen durch ein offenes Gefäßfenster möglich. Abbildung 2A ist ein repräsentatives Bild, das unter FIVM aufgenommen wurde und die Kapillaren der Cochlea-Apex-Middle Turn Seitenwand der Maus zeigt. Die Lumina ...

Diskussion

Diese Arbeit zeigt, wie Kapillaren in der Cochlea-Seitenwand (und in der Stria vascularis) eines Mausmodells mit Fluorophormarkierung in einer offenen Gefäßfensterpräparation unter einem FIVM-System sichtbar gemacht werden können. Das Mausmodell ist weit verbreitet und wird als Säugetiermodell zur Untersuchung der menschlichen Gesundheit und Krankheit bevorzugt. Das hier beschriebene Protokoll ist ein praktikabler Ansatz zur Bildgebung und Untersuchung von CoBF in der Mausseitenwand (insbesondere in der Striaa vascu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope