Medição do fluxo sanguíneo strial em Cochlea de rato utilizando uma janela de vaso aberto e microscopia de fluorescência intravital

Resumo

Uma abordagem aberta da janela do vaso usando rastreadores fluorescentes fornece resolução suficiente para a medição do fluxo sanguíneo coclear (CoBF). O método facilita o estudo de mudanças estruturais e funcionais no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas.

Resumo

A transdução do som é metabolicamente exigente, e a função normal da microvasculatura na parede lateral é fundamental para manter o potencial endococlear, o transporte de íons e o equilíbrio de fluidos. Diferentes formas de distúrbios auditivos envolvem microcirculação anormal na cóclea. A investigação de como a patologia do fluxo sanguíneo coclear (CoBF) afeta a função auditiva é desafiadora devido à falta de métodos de interrogatório viáveis e à dificuldade de acesso ao ouvido interno. Uma janela de vaso aberto na parede coclear lateral, combinada com microscopia intravital de fluorescência, tem sido usada para estudar mudanças de CoBF in vivo, mas principalmente em cobaia e apenas recentemente no mouse. Este papel e o vídeo associado descrevem o método aberto da janela do vaso para visualizar o fluxo sanguíneo na cóclea do rato. Os detalhes incluem 1) preparação da suspensão de células sanguíneas rotuladas por fluorescentes em camundongos; 2) construção de uma janela de vaso aberta para microscopia intravital em um rato anestesiado, e 3) medição da velocidade e volume do fluxo sanguíneo usando uma gravação offline da imagem. O método é apresentado em formato de vídeo para mostrar como usar a abordagem da janela aberta no mouse para investigar alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear em condições normais e patológicas.

Introdução

A função normal da microcirculação na parede coclear lateral (compreendendo a maioria dos capilares no ligamento espiral e estria vascularis) é criticamente importante para a manutenção da função auditiva¹. CoBF anormal está implicado na fisiopatologia de muitos distúrbios do ouvido interno, incluindo perda auditiva induzida por ruído, hidrops de ouvido e presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. A visualização do CoBF intravital permitirá uma melhor compreensão dos vínculos entre a função auditiva e a patologia vascular coclear.

Embora a complexidade e a localização da cóclea dentro do osso temporal impeça a visualização direta e a medição do CoBF, vários métodos foram desenvolvidos para a avaliação da CoBF, incluindo a estirmetria de fluxo de doppler a laser (LDF)^10,11,12, ressonância magnética (RM)¹³, microscopia intravital fluorescência (FIVM)¹⁴, microendoscopia de fluorescência (FME)¹⁵, endoscópica de análise de contraste de ondas laser (LSCI)¹⁶ , e abordagens baseadas na injeção de marcadores rotulados e microesferas marcadas radioativamente na corrente sanguínea (microangiografia óptica, OMAG)17,18,19,20. No entanto, nenhum desses métodos permitiu o acompanhamento absoluto em tempo real das alterações no CoBF in vivo, com exceção da FIVM. FIVM, em combinação com uma janela de vaso na parede coclear lateral, é uma abordagem que tem sido usada e validada em cobaia em diferentes condições experimentais por vários laboratórios 14,21,22.

Um método FIVM foi estabelecido com sucesso para estudar as alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear no camundongo usando isothiocnato fluoresceína (FITC)-dextran como meio de contraste e um corante de fluorescência - ou DiO (3, 3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato, verde) ou Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-3-tetramethylindocarbocyanine perclorato, vermelho)-para pré-rotular glóbulos, visualizar vasos e rastrear a velocidade do fluxo sanguíneo. No presente estudo, o protocolo deste método foi descrito para imagens e alterações quantificantes no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas (como após exposição ao ruído). Esta técnica dá ao pesquisador as ferramentas necessárias para investigar os mecanismos subjacentes do CoBF relacionados à disfunção auditiva e patologia na estria vascularis, especialmente quando aplicada em conjunto com modelos de camundongos transgênicos prontamente disponíveis.

Protocolo

NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência. Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oregon Health & Science University (número de aprovação da IACUC: TR01_IP00000968).

1. Preparação das células sanguíneas rotuladas por fluorescentes

1. Anestesiar os camundongos doadores (camundongos C57BL/6J machos com idade ~6 semanas) com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de solução anestésico de cetamina/xilazina (5 mL/kg, consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Este protocolo de anestesia é muito confiável e mantém a pressão arterial sistêmica.
2. Coloque o rato nas costas, abra a pele e exponha a cavidade torácica usando pinças e dissecando tesouras. Corte o diafragma, pegue na base do esterno usando uma tesoura de grampo, corte a caixa torácica e levante para expor o coração. Coletar 1 mL de sangue em heparina (15 UI/mL de sangue) por punção cardíaca, e centrífuga a 3.000 × g por 3 min a 4 °C. Eutanize o rato por luxação cervical após coleta de sangue.
3. Remova o plasma, lave a pelota de célula sanguínea com 1 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e centrífuga 3x a 3000 × g por 3 min a 4 °C.
4. Rotule as células sanguíneas com 1 mL de 20 mM DiO ou Dil em PBS, e incubar no escuro por 30 minutos a temperatura ambiente^23,24.
5. Centrifugar e lavar as células sanguíneas rotuladas com 1 mL de PBS, centrífugas 3x a 3000 × g por 3 min a 4 °C, e resuspensar a pelota celular em 30% de hematócrito com ~0,9 mL de PBS (volume final ~1,3 mL) antes da injeção.

2. Cirurgia para criar uma janela aberta ²⁵

1. Prepare os instrumentos cirúrgicos estéreis e a plataforma de imagem, e coloque uma almofada de aquecimento sob a cortina (Figura 1A). Anestesiar os camundongos (camundongos C57BL/6J machos com idade ~6 semanas) conforme descrito na etapa 1.1, e verificar a profundidade da anestesia monitorando o reflexo da pata e o tônus muscular geral. Coloque o animal na almofada de aquecimento quente e mantenha a temperatura retal a 37 °C.
2. Coloque a cauda animal no sistema de monitor CODATM para monitorar a pressão arterial e os batimentos cardíacos (consulte a Tabela de Materiais). Registosos a pressão arterial sistólica do animal, a pressão arterial diastólica e a pressão arterial média (MBP) na condição anestesiada.
   NOTA: Não é observada diferença no MBP animal no estado anestesiado e não anestesiado (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). A frequência cardíaca animal é estável sob anestesia, embora menor (ainda dentro da faixa normal) do que na condição não anestesiada (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). Uma batida cardíaca ligeiramente aumentada deve ser esperada em animais colocados na contenção²⁶.
3. Abra a bula timpânica esquerda através de uma abordagem lateral e ventral sob um microscópio estéreo (veja a Tabela de Materiais), deixando a membrana timpânica e ossículos intactas²¹.
   1. Faça uma incisão ao longo da linha média do pescoço do animal com a cabeça imobilizada e posicionada para minimizar o movimento (Figura 1B). Remova a glândula submandibular esquerda e a barriga posterior do músculo digastric e cauterize.
      NOTA: Injete subcutâneamente buprenorfina a 0,05 mg/kg para reduzir a dor durante a cirurgia.
   2. Localize e exponha a bula óssea identificando o músculo estenicleidomastoide e o nervo facial estendendo-se anteriormente em direção à bula.
   3. Abra a bula óssea com uma agulha de 30 G, e remova cuidadosamente o osso circundante com pinças cirúrgicas para fornecer uma visão clara da cóclea e artéria stapedial, com sua margem medial sobre a borda do nicho da janela redonda, e correndo anteriormente superior em direção à janela oval (Figura 1C, D).
      NOTA: A traqueotomia é realizada para manter as vias aéreas desobstruídas e só deve ser feita quando o animal tiver um problema respiratório durante a cirurgia. Em geral, a maioria dos animais sob anestesia tem respiração suave. No entanto, se os animais receberam uma traqueotomia durante a cirurgia, o fluxo sanguíneo registrado não deve ser usado para qualquer comparação.
4. Use uma pequena lâmina de faca (bisturi nº 16 frenado personalizado) para raspar o osso lateral da parede na curva do meio do ápice da cóclea do rato, aproximadamente 1,25 mm do ápice até que um ponto fino seja rachado. Remova os lascas ósseas com pequenos ganchos de arame (Figura 1E).
5. Cubra a janela do vaso com um deslizamento de tampa de corte para preservar as condições fisiológicas normais e forneça uma visão óptica para registrar imagens do vaso.
   NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados com cautela. Além do monitoramento da temperatura corporal, os sinais vitais do animal, incluindo pressão arterial e batimentos cardíacos, também devem ser monitorados durante toda a cirurgia.

3. Imagem de CoBF sob FIVM

1. Faça uma incisão de ~1 cm ao longo da veia safena direita para expor o vaso (Figura 1F).
2. Infundir 100 μL da solução FITC-dextran (2000 kDa, 40 mg/mL em PBS) e 100 μL de uma suspensão de células sanguíneas (30% hematócrito) sucessivamente no animal através da veia safena (Figura 1G) para permitir a visualização dos vasos sanguíneos e o rastreamento da velocidade do fluxo sanguíneo.
3. Observe o fluxo sanguíneo em tempo real diretamente em um monitor de vídeo 5 minutos após a injeção. Imagem dos vasos sanguíneos usando um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de longa distância de trabalho (W.D.) objetivo (W.D. 30,5 mm, 10x, 0,26 abertura numérica) e uma caixa de lâmpada contendo um filtro de excitação de banda múltipla e filtro de emissão compatível (Tabela de Materiais). Grave o vídeo usando uma câmera de dispositivo digital de alta resolução em preto e branco (Tabela de Materiais) a 2 quadros/s). Adquira mais de 350 imagens por vídeo para garantir uma análise bem-sucedida da velocidade de fluxo.
   NOTA: Os vasos sanguíneos tanto do ligamento espiral quanto da estria vascularis podem ser imagens ajustando o foco óptico (Vídeo Suplementar 1).

4. Análise de vídeo

1. Meça o diâmetro da embarcação utilizando um software apropriado (Tabela de Materiais) e determine a distância entre dois pontos fixos através da embarcação nas imagens adquiridas.
2. Calcule a velocidade de fluxo sanguíneo a partir de quadros de vídeo capturados traçando o movimento das células sanguíneas rotuladas na distância espacial entre os locais^{de imagem 27}.
   1. Abra o vídeo do fluxo sanguíneo no software (Fiji [ImageJ] foi usado neste protocolo), e defina a escala das imagens.
   2. Rastreie as células sanguíneas manchadas de DiO selecionadas usando a função de rastreamento. Use a distância que as células moveram e o intervalo de tempo entre os quadros de imagem no vídeo para o auto-cálculo da velocidade de fluxo.
3. Calcular o fluxo volumoso (F) pela seguinte equação: F = V × A. (V: velocidade; A: área transversal da embarcação).

5. Exposição ao ruído

1. Coloque os animais em gaiolas de malha de arame. Exponha-os ao ruído de banda larga a 120 dB nível de pressão sonora em uma cabine de exposição sonora por 3h e por mais 3 h no dia seguinte.
   NOTA: Este regime de exposição ao ruído, rotineiramente utilizado neste laboratório, produz perda permanente de sensibilidade coclear²⁸.

Resultados

Após a exposição cirúrgica dos capilares cocleares na parede lateral (Figura 1), a observação microscópica de fluorescência intravital de alta resolução das células sanguíneas rotuladas por Dil em vasos rotulados pelo FITC-dextran era viável através de uma janela de vaso aberto. Figura 2A é uma imagem representativa tirada sob FIVM que mostra os capilares da parede lateral do ápice coclear do mouse. A lumina deste...

Discussão

Este artigo demonstra como os capilares na parede lateral coclear (e na estria vascularis) de um modelo de mouse podem ser visualizados com rotulagem fluorófora em uma preparação aberta de janela de vaso sob um sistema FIVM. O modelo de camundongos é amplamente utilizado e preferido como um modelo mamífero para investigar a saúde e a doença humana. O protocolo descrito aqui é uma abordagem viável para a imagem e investigação de CoBF na parede lateral do rato (particularmente na estria vascularis) usando uma ja...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope